Name: fabrication of a crystalline nanocellulose embedded agarose biomaterial ink for bone marrow-derived mast cell culture
Uploaded: 2021-05-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture at JoVE.com

We bedanken Alberta Innovates voor het leveren van de CNC en Ken Harris en Jae-Young Cho voor hun technisch advies bij het voorbereiden van de CNC / agarose / D-mannitol matrix. We bedanken ook Ben Hoffman, Heather Winchell en Nicole Diamantides voor hun technisch advies en ondersteuning bij de installatie en kalibratie van de INKREDIBLE+ 3D bioprinter.

OPMERKING: Dit protocol bestaat uit vijf secties: (1) isolatie van muisbeenmerg en differentiatie van van het beenmerg afgeleide mestcellen van muizen (BMMCs), (2) fabricage van CNC/agarose/D-mannitol hydrogel substraten in een 24-well systeem en kweek van BMMCs op de substraten, (3) verwijdering van BMMCs uit de CNC/agarose/D-mannitol hydrogel substraten en analyse van levensvatbaarheid en biomarker expressie met behulp van flowcytometrie, (4) 3D-bioprinting van hydrogelsteigers uit een in de handel verkrijgbare fibril...

<ol>
	<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Drury, J. L., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+tissue+engineering:+Scaffold+design+variables+and+applications.">Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications.</a> Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).</li><li>Lee, K. Y., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+tissue+engineering.">Hydrogels for tissue engineering.</a> Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1879 (2001).</li><li>Halib, N., Ahmad, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanocellulose:+Insight+into+health+and+medical+applications.">Nanocellulose: Insight into health and medical applications.</a> Handbook of Ecomaterials. , 1345-1363 (2019).</li><li>Alonso-Lerma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+performance+crystalline+nanocellulose+using+an+ancestral+endoglucanase.">High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase.</a> Communications Materials. 1 (1), 57 (2020).</li><li>Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+of+nanocellulose-reinforced+PVA+hydrogel+with+human+corneal+epithelial+cells+for+ophthalmic+applications.">Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications.</a> Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35 (2019).</li><li>Fey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+nanocellulose+as+novel+carrier+for+intestinal+epithelial+cells+in+drug+delivery+studies.">Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies.</a> Materials Science and Engineering: C. 109, 110613 (2020).</li><li>Ojansivu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wood-based+nanocellulose+and+bioactive+glass+modified+gelatin-alginate+bioinks+for+3D+bioprinting+of+bone+cells.">Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells.</a> Biofabrication. 11 (3), 035010 (2019).</li><li>Jonsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+networks+on+nanocellulose+scaffolds.">Neuronal networks on nanocellulose scaffolds.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).</li><li>Samulin Erdem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+nanocrystals+modulate+alveolar+macrophage+phenotype+and+phagocytic+function.">Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function.</a> Biomaterials. 203, 31-42 (2019).</li><li>Menas, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrillar+vs+crystalline+nanocellulose+pulmonary+epithelial+cell+responses:+Cytotoxicity+or+inflammation.">Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation.</a> Chemosphere. 171, 671-680 (2017).</li><li>Halova, I., Draberova, L., Draber, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+chemotaxis+chemoattractants+and+signaling+pathways.">Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways.</a> Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).</li><li>Groll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+definition+of+bioinks+and+their+distinction+from+biomaterial+inks.">A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks.</a> Biofabrication. 11 (1), 013001 (2019).</li><li>Schwab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printability+and+shape+fidelity+of+bioinks+in+3D+bioprinting.">Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting.</a> Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).</li><li>Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+molecular+design+criteria+for+3D+printable+hydrogels.">Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels.</a> Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).</li><li>Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+viable+and+non-viable+cells+using+propidium+iodide+in+two+color+immunofluorescence.">Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence.</a> Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).</li><li>Usov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+nanocellulose+chirality+and+structure-properties+relationship+at+the+single+fibril+level.">Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level.</a> Nature Communications. 6 (1), 7564 (2015).</li></ol>

De fabricage van 3D-biomimetische weefsels vereist de succesvolle samensmelting van de bioink, die componenten van de extracellulaire matrix nabootst, met de cellulaire component (en) om fysiologische analogen van in vivo weefsels te creëren. Dit vereist het gebruik van primaire cellen, en niet getransformeerde cellen, bij het fabriceren van fysiologische biomimetische weefsels. Primaire immunologische cellen, zoals mestcellen, zijn echter bijzonder gevoelig voor cytotoxische effecten en fenotypische veranderin...

De recente interesse in 3D-kweeksystemen en 3D-bioprinting heeft de aandacht gevestigd op hydrogels en hydrogelcomposieten. Deze composieten dienen als viskeuze maar poreuze biomimetica en kunnen worden samengesteld uit maximaal 99% watergehalte in gewicht, wat vergelijkbaar is met biologische weefsels1,2,3. Deze kenmerken van hydrogelcomposieten maken daardoor de groei van cellen mogelijk zonder hun levensvatbaarheid en functie te beïnvloeden. Een van die composieten is kristallijne nanocellulose (CNC), die is gebruikt als versterkend materiaal in hydrogelcomposieten, celsteigers bij de ontwikkeling van biomateriaalimplantaten en in tweedimensionale (2D) en 3D in vitro celcultuur4,5. Voor het grootste deel zijn matrices samengesteld uit CNC niet openlijk cytotoxisch voor menselijke cornea-epitheelcellen6, intestinale epitheelcellen7, van menselijk beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen8 of neuronachtige cellen9. Metabole activiteit en proliferatie van van menselijk beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen neemt echter af in correlatie met de verhoogde viscositeit van op hout gebaseerde nanocellulosecomposieten, wat suggereert dat de samenstelling van de matrix zorgvuldig moet worden getest op zijn schadelijke effecten op celfuncties8.
Evenzo kan CNC ontstekingsreacties in macrofagen induceren bij internalisatie, wat ernstige gevolgen kan hebben in 3D-immuuncelkweeksystemen10,11. In feite zijn er zeer weinig gegevens beschikbaar over hoe CNC andere immuuncelreacties kan beïnvloeden, met name allergische ontstekingsreacties die worden geïnitieerd door mestcellen. Mestcellen zijn gegranuleerde leukocyten die de IgE-receptor met hoge affiniteit, FceRI, tot expressie brengen, verantwoordelijk voor het activeren van ontstekingsreacties op allergenen. Hun proliferatie en differentiatie zijn afhankelijk van stamcelfactor (SCF), die de tyrosinereceptor Kit bindt. Mestcellen zijn afgeleid van beenmergvoorlopercellen die de circulatie binnenkomen en vervolgens perifeer migreren om zich alomtegenwoordig te verspreiden in alle menselijke weefsels12. Omdat mestcellen functioneren in een 3D-weefselomgeving, zijn ze een ideale immuuncelkandidaat voor het bestuderen van immunologische processen in in vitro 3D-weefselmodellen. Tot op heden is er echter geen levensvatbaar in vitro 3D-weefselmodel dat mestcellen bevat.
Vanwege de zeer gevoelige aard van mestcellen en hun neiging om pro-inflammatoire reacties op externe stimuli uit te lokken, is een zorgvuldige overweging van de 3D-matrixbestanddelen en de bioprintmethode voor het introduceren van mestcellen in de 3D-steiger vereist, zoals verder besproken. Weefselconstructies kunnen worden gebiofabriceerd uit twee brede categorieën biomaterialen, d.w.z. bioinkten en biomateriaalinkten. Het onderscheid ligt in het feit dat bioinks celbeladen hydrogelcomposieten zijn, terwijl biomateriaalinkten hydrogelcomposieten zijn die verstoken zijn van cellen, zoals gedefinieerd door Groll et al.13,14. Vandaar dat 3D-constructies geprint met bioinks cellen bevatten die vooraf zijn ingebed in de hydrogelmatrix, terwijl 3D-constructies die zijn geprint met biomateriaalinkten moeten worden gezaaid met cellen na het printen. De biofabricage van kweeksteigers van op hydrogel gebaseerde bioinkten /biomateriaalinkten wordt meestal uitgevoerd met behulp van extrusie 3D-bioprinters, die de bioink / biomateriaalinkt onder druk extruderen door een mondstuk op microschaal via een pneumatisch of mechanisch aangedreven zuiger14. Extrusiebioprinters fabriceren 3D-steigers door de bioink af te zetten in 2D-dwarsdoorsnedepatronen die achtereenvolgens op elkaar worden gestapeld in een 'bottom-up' benadering.
Om compatibel te zijn met extrusiebioprinting, moet de op hydrogel gebaseerde bioink/biomateriaalinkt thixotrope (afschuifverdunning) eigenschappen bezitten, waarbij de samenstellende hydrogelpolymeren van de bioink/biomateriaalinkt als een vloeistof door een microkanaalmondstuk stromen wanneer ze worden blootgesteld aan schuifspanning, maar terugkeren naar een viskeuze, gelachtige toestand bij verwijdering van de schuifspanning15 . Vanwege hun hoge watergehalte moeten de polymeren van op hydrogel gebaseerde bioinks / biomateriaalinkten fysiek of covalent worden verknoopt om de architectuur en structurele integriteit van de 3D-biogeprinte structuur te behouden. In het geval van celbeladen bioinks worden de cellen direct blootgesteld aan chemische spanningen tijdens het crosslinking-proces. Het proces van het extruderen van cellen ingekapseld in de bioink hydrogel matrix onderwerpt de cellen ook aan schuifspanning, wat kan leiden tot verminderde levensvatbaarheid en / of celdood. Zodra het 3D-weefselmodel is gebioprint, is het moeilijk om onderscheid te maken tussen de niveaus van cytotoxiciteit die worden opgewekt door de hydrogelmatrix zelf en de extrusie- en crosslinkingprocessen, respectievelijk. Dit is met name een uitdaging in de context van 3D-steigers waar de cellen vooraf zijn ingebed in de hydrogelmatrix, waardoor het moeilijk wordt om de cellen te verwijderen voor latere analyses, wat schadelijk zou zijn voor de levensvatbaarheid van mestcellen.
Een zachtere benadering van het genereren van 3D-weefselconstructies die mestcellen bevatten, omvat het zaaien van de cellen in voorgedrukte, poreuze biomateriaalinkt 3D-steigers uit een celcultuursuspensie, die gebruik maakt van het aangeboren vermogen van mestcellen om van de circulatie naar perifere weefsels te migreren. De voordelen van deze celzaaibenadering zijn tweeledig: (i) de mestcellen worden niet onderworpen aan afschuiving en chemische spanningen van respectievelijk de extrusie- en crosslinkingprocessen, en (ii) de cellen kunnen gemakkelijk uit de 3D-steiger worden verwijderd na blootstelling door zacht wassen voor analyse zonder hun levensvatbaarheid nadelig te beïnvloeden. Het extra voordeel van het zaaien en analyseren van de levensvatbaarheid van cellen op 3D-biogeprinte, poreuze hydrogel-steigers in tegenstelling tot 2D-hydrogelschijven is dat de 3D-biogeprinte hydrogelsteigers de topografische kenmerken op microschaal van in vivo weefsels, die niet in bulk aanwezig zijn, 2D-planaire hydrogelschijven recapituleren. Deze aanpak is een geschikte, snelle en kosteneffectieve aanpak om de potentieel catastrofale cytotoxische effecten van kandidaat-bioink hydrogelmatrices op mestcellen en andere immunologische cellen te bepalen voorafgaand aan investeringen in dure 3D-weefselmanipulatie-experimenten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid (glacial)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AX0074-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose (OmniPur)</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2125-500GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-4888-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0632-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 24 Well Multidish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>930-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 96 Well Multidish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 175 cm2 Flask Vented</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130-191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet Class II</td>
			<td>Microzone Corp., Canada</td>
			<td>BK-2-6-B3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Fraction V (OmniPur)</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2930-100GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-1171-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge)</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>IK1020000303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mL</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>CL1010006001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>CSC0103000102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK HeartWare for PC</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>Version 2.4.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>S-10003-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>NZ4220005001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>NZ4250005001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>NZ4270005001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11465015001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Benchtop)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar&#160;96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Binder GmbH, Germany</td>
			<td>9040-0113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A00-1-1102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>44-390-7100GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5898-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12484028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Co. USA</td>
			<td>Version 10.6.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software, LLC</td>
			<td>Version 8.4.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15170-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Sodium Salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP410-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodonitrotetrazolium chloride (INT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I10406-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium L-lactate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2250-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes (1.7 mL clear)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes (2.0 mL clear)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZMQS60001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>725-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-3</td>
			<td>PeproTech, Inc.&#160;</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9913213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, 500 g</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP922I-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00D0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of a crystalline nanocellulose embedded agarose biomaterial ink for bone marrow-derived mast cell culture

Driedimensionaal (3D) bioprinten maakt gebruik van op hydrogel gebaseerde composieten (of biomateriaalinkten) die in een patroon worden afgezet en een substraat vormen waarop cellen worden afgezet. Omdat veel biomateriaalinkten potentieel cytotoxisch kunnen zijn voor primaire cellen, is het noodzakelijk om de biocompatibiliteit van deze hydrogelcomposieten te bepalen voordat ze worden gebruikt in kostbare 3D-weefselmanipulatieprocessen. Sommige 3D-kweekmethoden, waaronder bioprinting, vereisen dat cellen worden ingebed in een 3D-matrix, waardoor het moeilijk is om de cellen te extraheren en te analyseren op veranderingen in levensvatbaarheid en biomarkerexpressie zonder mechanische schade uit te lokken. Dit protocol beschrijft als proof of concept, een methode om de biocompatibiliteit van een kristallijne nanocellulose (CNC) ingebed agarosecomposiet te beoordelen, vervaardigd in een 24-well kweeksysteem, met muisbeenmerg-afgeleide mestcellen (BMMCs) met behulp van flowcytometrische assays voor cel levensvatbaarheid en biomarkerexpressie.
Na 18 uur blootstelling aan de CNC/agarose/D-mannitol matrix was de levensvatbaarheid van bmmc ongewijzigd zoals gemeten door propidiumjodide (PI) permeabiliteit. BMMCs gekweekt op het CNC/agarose/D-mannitol substraat bleken echter hun expressie van de hoge-affiniteit IgE receptor (FcεRI) en de stamcelfactor receptor (Kit; CD117), hoewel dit niet afhankelijk lijkt te zijn van de hoeveelheid CNC in het bioinkcomposiet. De levensvatbaarheid van BMMCs werd ook beoordeeld na een tijdsbehandeling met hydrogelsteigers die werden vervaardigd uit een commerciële biomateriaalinkt bestaande uit fibrillaire nanocellulose (FNC) en natriumalginaat met behulp van een 3D-extrusiebioprinter. Gedurende een periode van 6-48 uur hadden de FNC/alginaatsubstraten geen negatieve invloed op de levensvatbaarheid van de BMMCs zoals bepaald door flowcytometrie en microtitertests (XTT en lactaatdehydrogenase). Dit protocol beschrijft een efficiënte methode om snel de biochemische compatibiliteit van kandidaat-biomateriaalinkten te screenen op hun nut als 3D-steigers voor post-print zaaien met mestcellen.

Een van de meest cruciale kenmerken van een succesvolle biomateriaalinkt of kweeksubstraat is die van biocompatibiliteit. In de eerste plaats mag het substraat geen celdood veroorzaken. Er zijn verschillende microtiter-gebaseerde en flow cytometrische methoden voor het kwantificeren van de levensvatbaarheid van cellen en necrose; deze methoden zijn echter niet vatbaar voor het analyseren van cellen die zijn ingebed in een hydrogelmatrix. In dit protocol wordt de bovengenoemde beperking omzeild door de BMMCs op het hydrog...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture at JoVE.com

Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture

Dit protocol benadrukt een methode om snel de biocompatibiliteit van een kristallijne nanocellulose (CNC) / agarose composiet hydrogel biomateriaal inkt met muis beenmerg-afgeleide mestcellen te beoordelen in termen van cel levensvatbaarheid en fenotypische expressie van de celoppervlak receptoren, Kit (CD117) en hoge affiniteit IgE receptor (FcεRI).

Fabricage van een kristallijne nanocellulose ingebedde agarose biomateriaal inkt voor beenmerg-afgeleide mestcelkweek

Three-dimensional (3D) bioprinting utilizes hydrogel-based composites (or biomaterial inks) that are deposited in a pattern, forming a substrate onto ...

Dit protocol biedt een eenvoudige en snelle aanpak om kandidaat-biomateriaalinkten te screenen op mogelijke cytotoxische effecten tegen gevoelige primaire en immuuncellen voorafgaand aan complexe 3D-bioprintexperimenten. Na incubatie van de immuuncellen op de biomateriaalinktconstructies kunnen de cellen gemakkelijk uit de constructen worden gehaald door voorzichtig te wassen om downstream cytotoxiciteit of biomarkeranalyses uit te voeren. Dit protocol is direct relevant voor tissue engineering waarbij biogeprinte weefsels die bestemd zijn voor transplantatie moeten worden opgebouwd uit primaire cellen en biocompatibele biomateriaalinkten.Maak om te beginnen een bio-inktcartridge voor installatie op de INKREDIBLE+3D-bioprinter. Verwijder eerst de blauwe eindkappen van de drie milliliter biomateriaalinktcartridge en bevestig een steriel 22 gauge conisch bioprintmondstuk op het Luer-sloteinde van de bio-inktcartridge. Sluit de luchtdruktoevoerslang voor printkop één of PH1 aan op het andere uiteinde van de cartridge en steek de cartridge met het aangesloten conische bioprintmondstuk in de verticale sleuf van PH1.Plaats vervolgens de cartridge stevig in PH1 met een conisch bioprintmondstuk dat zich onder de printkop uitstrekt. Draai de schroef op PH1 met de klok mee tot de vinger strak om de bio-inktcartridge op zijn plaats te vergrendelen. Merk op dat de 3D-bioprinting kan worden uitgevoerd met PH2 leeg gelaten.Schakel de bioprinter in en start de bioprintersoftware op een pc die via een USB 2.0-kabel is aangesloten op de 3D-bioprinter. Klik in de software op de verbindingsknop om deze te synchroniseren met de 3D-bioprinter. Bekijk drie opties in het hoofdbedieningsmenu van de 3D-bioprinter.Bereid eerst bioprint voor. Ten tweede, hulpprogramma's menu. En ten derde, statusscherm.Selecteer de optie bioprint voorbereiden, scrol omlaag naar en selecteer de optie Home Axes. Na een succesvolle kalibratie van de XYZ-assen zal de hoogte van het printbed iets lager worden en zullen de printkoppen zich verplaatsen naar boven het middelpunt van het printbed. Om door te gaan met de kalibratie van het startpunt voor bioprinting in 24-well platen, verwijdert u een steriele 24-well kweekplaat uit de verzegelde plastic verpakking en markeert u een stip op het middelpunt van put D1 aan de onderkant van de plaat met een permanente marker.Verwijder het platendeksel en plaats de 24-well cultuurplaat op het printbed met put D1 in de linkervoorhoek van het printbed. Selecteer in het hoofdmenu van het besturingselement het menu Hulpprogramma's en verplaats vervolgens de as. Beweeg de printkoppen in stappen van één millimeter langs de X- en Y-as totdat het conische bioprintmondstuk van PH1 direct over de punt onder put D1 ligt. Verfijn indien nodig de positie van het conische bioprintmondstuk over de punt door de printkoppen in stappen van 0,1 millimeter te bewegen.Noteer de X- en Y-coördinaten van het conische bioprintmondstuk direct boven het midden van put D1 zoals aangegeven in het bedieningspaneelscherm van de 3D-bioprinter en markeer de coördinaten. Til vervolgens het printbed in stappen van een millimeter op totdat de bodem van put D1 bijna het conische bioprintmondstuk raakt dat in printkop één is geïnstalleerd. Verfijn de beweging van het printbed indien nodig in stappen van 0,1 millimeter.Selecteer in het menu Hulpprogramma's de kalibratieoptie Z-as en selecteer en bevestig verder de kalibratieoptie store Z. Ga terug naar het hoofdmenu en selecteer de optie bioprint voorbereiden. Scrol omlaag naar en selecteer de optie Z kalibreren.Werk de geometrische code van de 24-putplaat of G-code bij met de juiste coördinaten van het startpunt. Open het meegeleverde 24-well G-code bestand op de bioprint software. Werk de X- en Y-coördinaten op regel één bij met de waarden die in de vorige stappen zijn verkregen en sla het bestand op onder een nieuwe naam.Zorg ervoor dat de pneumatische pomp goed is aangesloten op de achterste luchtinlaatpoort van de INKREDIBLE+3D bioprinter en schakel deze in. Trek de voorwaartse bedieningsknop aan de rechterkant van de INKREDIBLE+3D bioprinter uit. Zorg ervoor dat de digitale manometers voor PH1 en PH2 aan de voorkant van de bioprinter elk bijna nul kilopascal lezen.Draai de voorwaartse bedieningsknop langzaam met de klok mee totdat de druk die op de linkermeter voor PH1 is aangegeven, 12 kilopascal bereikt. Plaats een gevouwen tissuepapier of een stuk waterdichte afdichtfolie onder het printmondstuk van de geïnstalleerde cartridge, waarbij u voorzichtig bent om het afdrukmondstuk niet aan te raken. Selecteer in het hoofdbedieningsmenu van de 3D-bioprinter de optie bioprint voorbereiden.Navigeer naar en selecteer PH1 inschakelen. Merk op dat de bio-inkt begint te extruderen uit het printmondstuk. Verhoog indien nodig de extrusiedruk door de bedieningsknop met de klok mee te draaien totdat de bio-inkt in een continu filament is geëxtrudeerd en noteer de nieuwe drukinstelling.Schakel PH1 uit om extrusie van de bio-inkt te stoppen. Verwijder tissuepapier of folie met de geëxtrudeerde bio-inkt uit het printbed en sluit de deur van de bioprinter. Om 3D-bioprinting van rechtlijnige hydrogelsubstraten in een 24-well plaatformaat uit te voeren, selecteert u het menu hulpprogramma's in het hoofdbesturingsmenu en selecteert u vervolgens SD-afdrukken uitschakelen, zodat de bioprintersoftware G-codebestanden naar de 3D-bioprinter kan verzenden voor afdrukken.Klik op de laadknop in de bioprintersoftware en selecteer het bijgewerkte G-codebestand met 24 putten. Selecteer in het rechter bedieningspaneel in de software het tabblad afdrukvoorbeeld en klik op de afdrukknop om te beginnen met bioprinten in put D1. Na voltooiing van de bioprinting van de rechtlijnige constructies, bedek de 24-putplaat met het deksel en verplaats deze naar een klasse II bioveiligheidskast. Dompel elk rechtlijnig construct onder in twee druppels steriele 50 millimolaire calciumchlorideoplossing en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Zuig de calciumchlorideoplossing voorzichtig uit elke putconstructie en spoel eenmaal in één milliliter 1X PBS om overtollig calciumchloride te verwijderen. Om uitdroging van de biogeprinte hydrogelconstructies te voorkomen, onderhoudt u de 3D-biogeprinte rechtlijnige constructies in verse 1X PBS totdat de van het beenmerg afgeleide mestcellen klaar zijn om op de constructies te worden gezaaid. Op basis van de voorwaartse en zijverstrooiingsparameters van de BMMCs geanalyseerd door flowcytometrie, werd waargenomen dat het hydrogelsubstraat met de hoogste CNC-concentratie de oorspronkelijke grootte of granulariteit van de BMMCs niet veranderde in vergelijking met de BMMCs gekweekt in afwezigheid van de CNC agarose D-mannitol hydrogel substraten.Flowcytometrische analyse van de permeabiliteit van de BMMCs voor propidiumjodide toonde aan dat geen van de geteste CNC-concentraties enig nadelig effect had op de levensvatbaarheid van BMMC's. Het CNC-agarose-substraat verhoogde de expressie van de mestcelbiomarkers bij CNC-concentraties groter dan of gelijk aan 2,5% De expressieniveaus van deze receptoren bleven echter relatief consistent tussen 2,5% en 12,5% CNC, wat een effect suggereert dat onafhankelijk is van de concentratie van CNC. De XTT-test toonde aan dat de metabole activiteit van de BMMCs gekweekt op de 3D-biogeprinte hydrogel-steigers relatief consistent bleef op ongeveer 100% over alle geteste tijdspunten.Evenzo onthulden de LDH-release- en PI-kleurstofuitsluitingstests geen significante veranderingen in de levensvatbaarheid van de BMMCs. Zorgvuldige aandacht voor de selectie van de printmondstukmeter, kalibratie van de assen van de 3D-bioprinter en de extrusiedrukinstelling zorgen voor reproduceerbaar printen van hoogwaardige 3D-constructies. Het gemak waarmee de mestcellen kunnen worden opgehaald, maakt het mogelijk om ze te onderzoeken door een breed scala aan biologische assays om elk aspect van hun cellulaire functies verder te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

Microfabricated Platforms voor Mechanisch Dynamic Cel Cultuur

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Shape Memory Polymeren voor actieve cel Cultuur

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Roterende celkweek systemen for Human Cultuur van de Cel: Human trofoblast cellen als een model

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk Film Culture-systeem voor In vitro Analyse en biomateriaal Ontwerp

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

Fabricage van een gefunctionaliseerd Magnetic Bacterial Nanocellulose met ijzeroxide Nanodeeltjes

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Characterization of Leukocyte-platelet Rich Fibrin, A Novel Biomaterial

Karakterisering van Leukocyte bloedplaatjes Rich fibrine, A Novel Biomateriaal

Autologous platelet concentrates represent promising innovative tools in the field of regenerative medicine and have been extensively used in oral ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabricage van Inverted Colloïdaal Crystal Poly (ethyleen glycol) Steiger: Een drie-dimensionale Cultuur van de Cel Platform for Liver Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Tunable Hydrogels van Pulmonary extracellulaire matrix voor 3D-Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Fabricage van aangepaste Agarose putten voor het zaaien van de cellen en weefsel Ring zelf-assemblage met behulp van 3D-gedrukte mallen

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Grote terrein Scanning Probe Nanolithography vergemakkelijkt door automatische uitlijning en de toepassing ervan op substraat Fabrication voor cel Cultuurwetenschappen