Name: fabrication of a crystalline nanocellulose embedded agarose biomaterial ink for bone marrow-derived mast cell culture
Uploaded: 2021-05-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture at JoVE.com

Wir danken Alberta Innovates für die Bereitstellung der CNC und Ken Harris und Jae-Young Cho für ihre technische Beratung bei der Vorbereitung der CNC/Agarose/D-Mannitol-Matrix. Wir danken auch Ben Hoffman, Heather Winchell und Nicole Diamantides für ihre technische Beratung und Unterstützung bei der Einrichtung und Kalibrierung des INKREDIBLE+ 3D-Bioprinters.

HINWEIS: Dieses Protokoll besteht aus fünf Abschnitten: (1) Isolierung des Knochenmarks der Maus und Differenzierung von aus dem Knochenmark der Maus stammenden Mastzellen (BMMCs), (2) Herstellung von CNC/Agarose/D-Mannitol-Hydrogel-Substraten in einem 24-Well-System und Kultur von BMMCs auf den Substraten, (3) Entfernung von BMMCs aus den CNC/Agarose/D-Mannitol-Hydrogel-Substraten und Analyse der Lebensfähigkeit und Biomarkerexpression mittels Durchflusszytometrie, (4) 3D-Bioprinting von Hydrogelgerüsten aus einer k...

<ol>
	<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Drury, J. L., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+tissue+engineering:+Scaffold+design+variables+and+applications.">Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications.</a> Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).</li><li>Lee, K. Y., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+tissue+engineering.">Hydrogels for tissue engineering.</a> Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1879 (2001).</li><li>Halib, N., Ahmad, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanocellulose:+Insight+into+health+and+medical+applications.">Nanocellulose: Insight into health and medical applications.</a> Handbook of Ecomaterials. , 1345-1363 (2019).</li><li>Alonso-Lerma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+performance+crystalline+nanocellulose+using+an+ancestral+endoglucanase.">High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase.</a> Communications Materials. 1 (1), 57 (2020).</li><li>Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+of+nanocellulose-reinforced+PVA+hydrogel+with+human+corneal+epithelial+cells+for+ophthalmic+applications.">Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications.</a> Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35 (2019).</li><li>Fey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+nanocellulose+as+novel+carrier+for+intestinal+epithelial+cells+in+drug+delivery+studies.">Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies.</a> Materials Science and Engineering: C. 109, 110613 (2020).</li><li>Ojansivu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wood-based+nanocellulose+and+bioactive+glass+modified+gelatin-alginate+bioinks+for+3D+bioprinting+of+bone+cells.">Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells.</a> Biofabrication. 11 (3), 035010 (2019).</li><li>Jonsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+networks+on+nanocellulose+scaffolds.">Neuronal networks on nanocellulose scaffolds.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).</li><li>Samulin Erdem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+nanocrystals+modulate+alveolar+macrophage+phenotype+and+phagocytic+function.">Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function.</a> Biomaterials. 203, 31-42 (2019).</li><li>Menas, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrillar+vs+crystalline+nanocellulose+pulmonary+epithelial+cell+responses:+Cytotoxicity+or+inflammation.">Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation.</a> Chemosphere. 171, 671-680 (2017).</li><li>Halova, I., Draberova, L., Draber, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+chemotaxis+chemoattractants+and+signaling+pathways.">Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways.</a> Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).</li><li>Groll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+definition+of+bioinks+and+their+distinction+from+biomaterial+inks.">A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks.</a> Biofabrication. 11 (1), 013001 (2019).</li><li>Schwab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printability+and+shape+fidelity+of+bioinks+in+3D+bioprinting.">Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting.</a> Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).</li><li>Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+molecular+design+criteria+for+3D+printable+hydrogels.">Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels.</a> Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).</li><li>Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+viable+and+non-viable+cells+using+propidium+iodide+in+two+color+immunofluorescence.">Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence.</a> Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).</li><li>Usov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+nanocellulose+chirality+and+structure-properties+relationship+at+the+single+fibril+level.">Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level.</a> Nature Communications. 6 (1), 7564 (2015).</li></ol>

Die Herstellung von biomimetischen 3D-Geweben erfordert die erfolgreiche Verschmelzung der Biotinte, die Komponenten der extrazellulären Matrix nachahmt, mit der zellulären Komponente(n), um physiologische Analoga von In-vivo-Geweben zu erzeugen. Dies erfordert die Verwendung von Primärzellen und nicht von transformierten Zellen bei der Herstellung physiologischer biomimetischer Gewebe. Primäre immunologische Zellen, wie Mastzellen, sind jedoch besonders anfällig für zytotoxische Wirkungen und phänotypisc...

Das jüngste Interesse an 3D-Kultursystemen und 3D-Bioprinting hat die Aufmerksamkeit auf Hydrogele und Hydrogel-Verbundwerkstoffe gelenkt. Diese Verbundwerkstoffe dienen als viskose, aber poröse Biomimetik und können aus bis zu 99 Gew.-% Wassergehalt bestehen, was mit biologischen Geweben vergleichbar ist1,2,3. Diese Eigenschaften von Hydrogel-Verbundwerkstoffen ermöglichen somit das Wachstum von Zellen, ohne ihre Lebensfähigkeit und Funktion zu beeinträchtigen. Ein solcher Verbundwerkstoff ist kristalline Nanocellulose (CNC), die als Verstärkungsmaterial in Hydrogel-Verbundwerkstoffen, Zellgerüsten bei der Entwicklung von Biomaterialimplantaten und in zweidimensionaler (2D) und 3D-in-vitro-Zellkultur4,5 verwendet wurde. In den meisten Fällen sind Matrizen, die aus CNC bestehen, nicht offen zytotoxisch für menschliche Hornhautepithelzellen6, Darmepithelzellen7, aus dem menschlichen Knochenmark stammende mesenchymale Stammzellen8 oder neuronenähnliche Zellen9. Die metabolische Aktivität und Proliferation von mesenchymalen Stammzellen aus dem menschlichen Knochenmark nimmt jedoch in Korrelation mit der erhöhten Viskosität von Nanocellulose-Verbundwerkstoffen auf Holzbasis ab, was darauf hindeutet, dass die Zusammensetzung der Matrix sorgfältig auf ihre schädlichen Auswirkungen auf die Zellfunktionen getestet werden muss8.
In ähnlicher Weise kann CNC bei der Internalisierung Entzündungsreaktionen in Makrophagen hervorrufen, die schwerwiegende Folgen in 3D-Immunzellkultursystemen haben könnten10,11. Tatsächlich gibt es nur sehr wenige Daten darüber, wie CNC andere Immunzellantworten beeinflussen kann, insbesondere allergische Entzündungsreaktionen, die von Mastzellen initiiert werden. Mastzellen sind granulierte Leukozyten, die den hochaffinen IgE-Rezeptor FceRI exprimieren, der für die Aktivierung von Entzündungsreaktionen auf Allergene verantwortlich ist. Ihre Proliferation und Differenzierung sind abhängig vom Stammzellfaktor (SCF), der den Tyrosinrezeptor Kit bindet. Mastzellen werden aus Vorläuferzellen des Knochenmarks gewonnen, die in den Kreislauf gelangen und anschließend peripher wandern, um sich ubiquitär in allen menschlichen Geweben zu verteilen12. Da Mastzellen in einer 3D-Gewebeumgebung funktionieren, sind sie ein idealer Immunzellkandidat für die Untersuchung immunologischer Prozesse in in vitro 3D-Gewebemodellen. Bis heute gibt es jedoch kein brauchbares in vitro 3D-Gewebemodell, das Mastzellen enthält.
Aufgrund der hochempfindlichen Natur von Mastzellen und ihrer Neigung, entzündungsfördernde Reaktionen auf äußere Reize hervorzurufen, ist eine sorgfältige Berücksichtigung der 3D-Matrixbestandteile und der Bioprinting-Methode zur Einführung von Mastzellen in das 3D-Gerüst erforderlich, wie weiter diskutiert. Gewebekonstrukte können aus zwei großen Kategorien von Biomaterialien biofabriziert werden, nämlich Biotinten und Biomaterialtinten. Der Unterschied liegt in der Tatsache, dass Biotinten zellbeladene Hydrogel-Verbundwerkstoffe sind, während Biomaterial-Tinten Hydrogel-Komposite sind, die frei von Zellen sind, wie von Groll et al.13,14 definiert. Daher enthalten 3D-Konstrukte, die mit Biotinten gedruckt werden, Zellen, die in die Hydrogelmatrix eingebettet sind, während 3D-Konstrukte, die mit Biomaterialtinten gedruckt werden, mit Zellen nach dem Drucken ausgesät werden müssen. Die Biofabrikation von Kulturgerüsten aus Hydrogel-basierten Biotinten/Biomaterialtinten wird am häufigsten mit Extrusions-3D-Bioprintern durchgeführt, die die Bioink-/Biomaterialtinte durch eine mikroskalige Düse unter Druck entweder über einen pneumatisch oder mechanisch angetriebenen Kolben extrudieren14. Extrusionsbioprinter stellen 3D-Gerüste her, indem sie die Bioink in 2D-Querschnittsmustern ablegen, die nacheinander in einem "Bottom-up" -Ansatz aufeinander gestapelt werden.
Um mit dem Extrusions-Bioprinting kompatibel zu sein, muss die Hydrogel-basierte Bioink/Biomaterial-Tinte thixotrope (scherverdünnende) Eigenschaften besitzen, wobei die konstituierenden Hydrogelpolymere der Bioink/Biomaterial-Tinte bei Scherspannung wie eine Flüssigkeit durch eine Mikrokanaldüse fließen, aber bei Entfernung der Scherspannung in einen viskosen, gelartigen Zustand zurückkehren15 . Aufgrund ihres hohen Wassergehalts müssen die Polymere von Hydrogel-basierten Biotinten / Biomaterialtinten entweder physikalisch oder kovalent vernetzt werden, um die Architektur und strukturelle Integrität der 3D-biogedruckten Struktur zu erhalten. Bei zellbeladenen Biotinten werden die Zellen während des Vernetzungsprozesses direkt chemischen Belastungen ausgesetzt. Der Prozess der Extrudierung von Zellen, die in der Bioink-Hydrogel-Matrix eingekapselt sind, setzt die Zellen auch Scherstress aus, was zu einer verminderten Lebensfähigkeit und / oder zum Zelltod führen kann. Sobald das 3D-Gewebemodell biogedruckt wurde, ist es schwierig, zwischen dem Grad der Zytotoxizität, der durch die Hydrogelmatrix selbst hervorgerufen wird, und den Extrusions- bzw. Vernetzungsprozessen zu unterscheiden. Dies ist besonders herausfordernd im Zusammenhang mit 3D-Gerüsten, bei denen die Zellen in die Hydrogelmatrix eingebettet sind, was es schwierig macht, die Zellen für nachfolgende Analysen zu entfernen, was die Lebensfähigkeit von Mastzellen beeinträchtigen würde.
Ein schonenderer Ansatz zur Erzeugung von 3D-Gewebekonstrukten, die Mastzellen enthalten, besteht darin, die Zellen in vorgedruckte, poröse Biomaterial-Tinten-3D-Gerüste aus einer Zellkultursuspension zu säen, die die angeborene Fähigkeit von Mastzellen nutzt, aus dem Kreislauf in periphere Gewebe zu wandern. Die Vorteile dieses Zellsaatansatzes sind zweifach: (i) Die Mastzellen werden keiner Scher- bzw. chemischen Belastung durch die Extrusions- bzw. Vernetzungsprozesse ausgesetzt, und (ii) die Zellen können nach der Exposition durch sanftes Waschen zur Analyse leicht aus dem 3D-Gerüst entfernt werden, ohne ihre Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Der zusätzliche Vorteil der Aussaat und Analyse der Zelllebensfähigkeit von Mastzellen auf 3D-biogedruckten, porösen Hydrogel-Gerüsten im Gegensatz zu 2D-Hydrogel-Scheiben besteht darin, dass die 3D-biogedruckten Hydrogel-Gerüste mikroskalige topographische Merkmale von In-vivo-Geweben rekapitulieren, die in großen, planaren 2D-Hydrogelscheiben nicht vorhanden sind. Dieser Ansatz ist ein geeigneter, schneller und kostengünstiger Ansatz, um die potenziell katastrophalen zytotoxischen Wirkungen von Bioink-Hydrogel-Matrices auf Mastzellen sowie andere immunologische Zellen zu bestimmen, bevor in kostspielige 3D-Tissue-Engineering-Experimente investiert wird.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid (glacial)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AX0074-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose (OmniPur)</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2125-500GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-4888-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0632-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 24 Well Multidish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>930-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 96 Well Multidish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 175 cm2 Flask Vented</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130-191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet Class II</td>
			<td>Microzone Corp., Canada</td>
			<td>BK-2-6-B3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Fraction V (OmniPur)</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2930-100GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-1171-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge)</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>IK1020000303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mL</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>CL1010006001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>CSC0103000102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK HeartWare for PC</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>Version 2.4.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>S-10003-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>NZ4220005001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>NZ4250005001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>NZ4270005001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11465015001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Benchtop)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar&#160;96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Binder GmbH, Germany</td>
			<td>9040-0113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A00-1-1102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>44-390-7100GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5898-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12484028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Co. USA</td>
			<td>Version 10.6.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software, LLC</td>
			<td>Version 8.4.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15170-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Sodium Salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP410-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodonitrotetrazolium chloride (INT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I10406-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium L-lactate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2250-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes (1.7 mL clear)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes (2.0 mL clear)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZMQS60001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>725-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-3</td>
			<td>PeproTech, Inc.&#160;</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9913213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, 500 g</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP922I-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00D0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of a crystalline nanocellulose embedded agarose biomaterial ink for bone marrow-derived mast cell culture

Das dreidimensionale (3D) Bioprinting verwendet Hydrogel-basierte Verbundwerkstoffe (oder Biomaterialtinten), die in einem Muster abgeschieden werden und ein Substrat bilden, auf dem Zellen abgeschieden werden. Da viele Biomaterialtinten potenziell zytotoxisch für Primärzellen sein können, ist es notwendig, die Biokompatibilität dieser Hydrogel-Verbundwerkstoffe vor ihrer Verwendung in kostspieligen 3D-Tissue-Engineering-Prozessen zu bestimmen. Einige 3D-Kulturmethoden, einschließlich Bioprinting, erfordern, dass Zellen in eine 3D-Matrix eingebettet werden, was es schwierig macht, die Zellen auf Veränderungen der Lebensfähigkeit und Biomarkerexpression zu extrahieren und zu analysieren, ohne mechanische Schäden hervorzurufen. Dieses Protokoll beschreibt als Proof of Concept eine Methode zur Bewertung der Biokompatibilität eines kristallinen Nanocellulose (CNC) eingebetteten Agarose-Verbundwerkstoffs, der zu einem 24-Well-Kultursystem mit aus dem Knochenmark der Maus gewonnenen Mastzellen (BMMCs) unter Verwendung von durchflusszytometrischen Assays für zelllebensfähigkeit und Biomarkerexpression hergestellt wird.
Nach 18 h Exposition gegenüber der CNC/Agarose/D-Mannitol-Matrix war die BMMC-Lebensfähigkeit unverändert, gemessen anhand der Propidiumiodidid (PI)-Permeabilität. BMMCs, die auf dem CNC/Agarose/D-Mannitol-Substrat kultiviert wurden, schienen jedoch ihre Expression des hochaffinen IgE-Rezeptors (FcεRI) und des Stammzellfaktorrezeptors (Kit; CD117), obwohl dies nicht von der Menge an CNC im Bioink-Verbundwerkstoff abhängig zu sein scheint. Die Lebensfähigkeit von BMMCs wurde auch nach einer zeitlichen Exposition gegenüber Hydrogelgerüsten bewertet, die aus einer kommerziellen Biomaterialtinte hergestellt wurden, die aus fibrillerer Nanocellulose (FNC) und Natriumalginat unter Verwendung eines 3D-Extrusionsbioprinters hergestellt wurde. Über einen Zeitraum von 6-48 h beeinträchtigten die FNC/Alginat-Substrate die Durchflusszytometrie und Mikrotiterassays (XTT und Laktatdehydrogenase) ermittelte Lebensfähigkeit der BMMCs nicht. Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode, um die biochemische Kompatibilität von Kandidaten-Biomaterialtinten schnell auf ihren Nutzen als 3D-Gerüste für das Post-Print-Seeding mit Mastzellen zu überprüfen.

Eine der wichtigsten Eigenschaften einer erfolgreichen Biomaterialtinte oder eines Kultursubstrats ist die Biokompatibilität. In erster Linie darf das Substrat keinen Zelltod induzieren. Es gibt mehrere mikrotiterbasierte und durchflusszytometrische Methoden zur Quantifizierung der Zelllebensfähigkeit und Nekrose; Diese Methoden sind jedoch nicht für die Analyse von Zellen geeignet, die in eine Hydrogelmatrix eingebettet sind. In diesem Protokoll wird die oben genannte Einschränkung umgangen, indem die BMMCs auf das ...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture at JoVE.com

Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture

Dieses Protokoll hebt eine Methode zur schnellen Bewertung der Biokompatibilität einer kristallinen Nanocellulose (CNC)/Agarose-Verbundhydrogel-Biomaterialtinte mit aus dem Knochenmark der Maus gewonnenen Mastzellen in Bezug auf die Zelllebensfähigkeit und die phänotypische Expression der Zelloberflächenrezeptoren Kit (CD117) und des hochaffinen IgE-Rezeptors (FcεRI) hervor.

Herstellung einer kristallinen Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Tinte für Knochenmark-abgeleitete Mastzellkultur

Three-dimensional (3D) bioprinting utilizes hydrogel-based composites (or biomaterial inks) that are deposited in a pattern, forming a substrate onto ...

Dieses Protokoll bietet einen einfachen und schnellen Ansatz, um Kandidaten-Biomaterialtinten vor komplexen 3D-Bioprinting-Experimenten auf mögliche zytotoxische Wirkungen gegen empfindliche Primär- und Immunzellen zu untersuchen. Nach der Inkubation der Immunzellen auf den Biomaterial-Tintenkonstrukten können die Zellen durch sanftes Waschen leicht aus den Konstrukten entnommen werden, um nachgeschaltete Zytotoxizitäts- oder Biomarkeranalysen durchzuführen. Dieses Protokoll ist direkt relevant für das Tissue Engineering, bei dem biogedruckte Gewebe, die für die Transplantation bestimmt sind, aus Primärzellen und biokompatiblen Biomaterialtinten hergestellt werden müssen.Bereiten Sie zunächst eine Bio-Tintenpatrone für die Installation auf dem INKREDIBLE+3D-Bioprinter vor. Entfernen Sie zunächst die blauen Endkappen von der drei Milliliter großen Biomaterial-Tintenpatrone und befestigen Sie eine sterile konische 22-Gauge-Bioprinting-Düse am Luer-Lock-Ende der Bio-Tintenpatrone. Schließen Sie den Luftdruckzufuhrschlauch für Druckkopf eins oder PH1 an das gegenüberliegende Ende der Patrone an und setzen Sie die Patrone mit der angeschlossenen konischen Bioprinting-Düse in den vertikalen Schlitz von PH1 ein.Setzen Sie als Nächstes die Patrone fest in PH1 mit einer konischen Bioprinting-Düse ein, die sich unter den Druckkopf erstreckt. Ziehen Sie die Schraube am PH1 im Uhrzeigersinn fest, bis der Finger fest sitzt, um die Bio-Tintenpatrone zu verriegeln. Beachten Sie, dass der 3D-Bioprinting mit ph2 durchgeführt werden kann, der leer bleibt.Schalten Sie den Bioprinter ein und starten Sie die Bioprinter-Software auf einem PC, der über ein USB 2.0-Kabel mit dem 3D-Bioprinter verbunden ist. Klicken Sie in der Software auf die Schaltfläche Verbinden, um sie mit dem 3D-Bioprinter zu synchronisieren. Beachten Sie drei Optionen im Hauptsteuerungsmenü des 3D-Bioprinters.Bereiten Sie zunächst den Bioprint vor. Zweitens, Dienstprogramme Menü. Und drittens, Statusbildschirm.Wählen Sie die Option Bioprint vorbereiten aus, scrollen Sie dann nach unten und wählen Sie die Option Home-Achsen aus. Nach erfolgreicher Kalibrierung der XYZ-Achsen sinkt die Höhe des Druckbetts leicht ab und die Druckköpfe verschieben sich über den Mittelpunkt des Druckbetts. Um mit der Ausgangspunktkalibrierung für das Bioprinting in 24-Well-Platten fortzufahren, entfernen Sie eine sterile 24-Well-Kulturplatte aus der versiegelten Plastikverpackung und markieren Sie einen Punkt auf dem Mittelpunkt von Well D1 auf der Unterseite der Platte mit einem Permanentmarker.Entfernen Sie die Plattenabdeckung und legen Sie die 24-Well-Kulturplatte auf das Druckbett mit der Vertiefung D1 in der vorderen linken Ecke des Druckbetts. Wählen Sie im Hauptsteuerungsmenü das Menü Dienstprogramme aus, und verschieben Sie dann die Achse. Bewegen Sie die Druckköpfe in Schritten von einem Millimeter entlang der X- und Y-Achse, bis sich die konische Bioprinting-Düse von PH1 direkt über dem Punkt befindet, der unter vertiefung D1 markiert ist. Passen Sie bei Bedarf die Position der konischen Bioprinting-Düse über dem Punkt ab, indem Sie die Druckköpfe in Schritten von 0,1 Millimetern bewegen.Zeichnen Sie die X- und Y-Koordinaten der konischen Bioprinting-Düse auf, wenn Sie sich direkt über der Mitte der Vertiefung D1 befinden, wie im Bedienfeldbildschirm des 3D-Biodruckers angegeben, und markieren Sie die Koordinaten. Als nächstes heben Sie das Druckbett in Schritten von einem Millimeter an, bis der Boden der Vertiefung D1 fast die konische Bioprinting-Düse berührt, die im ersten Druckkopf installiert ist. Feinabstimmung der Bewegung des Druckbettes in 0,1-Millimeter-Schritten, falls erforderlich.Wählen Sie im Dienstprogrammmenü die Option Z-Achsen-Kalibrierung und wählen und bestätigen Sie die Option Z-Kalibrierung speichern. Kehren Sie zum Hauptmenü zurück und wählen Sie die Option Bioprint vorbereiten. Scrollen Sie nach unten zu und wählen Sie die Option Z kalibrieren aus.Aktualisieren Sie den geometrischen Code der 24-Well-Platte oder den G-Code mit den richtigen Startpunktkoordinaten. Öffnen Sie die mitgelieferte 24-Well-G-Code-Datei in der Bioprint-Software. Aktualisieren Sie die X- und Y-Koordinaten in Zeile eins mit den in den vorherigen Schritten erhaltenen Werten und speichern Sie die Datei unter einem neuen Namen.Stellen Sie sicher, dass die pneumatische Pumpe fest mit dem hinteren Luftansauganschluss des INKREDIBLE+3D-Biodruckers verbunden ist, und schalten Sie ihn ein. Ziehen Sie den vorderen Steuerknopf auf der rechten Seite des INKREDIBLE+3D-Biodruckers heraus. Stellen Sie sicher, dass die digitalen Manometer für PH1 und PH2, die sich auf der Vorderseite des Biodruckers befinden, jeweils nahezu null Kilopascal lesen.Drehen Sie den vorderen Steuerknopf langsam im Uhrzeigersinn, bis der auf dem linken Messgerät für PH1 angezeigte Druck 12 Kilopascal erreicht. Legen Sie ein gefaltetes Seidenpapier oder ein Stück wasserdichte Dichtungsfolie unter die Druckdüse der installierten Patrone und achten Sie darauf, die Druckdüse nicht zu berühren. Wählen Sie im Hauptsteuerungsmenü des 3D-Bioprinters die Option Bioprint vorbereiten aus.Navigieren Sie zu PH1 aktivieren, und wählen Sie PH1 aktivieren aus. Beachten Sie, dass die Bio-Tinte aus der Druckdüse zu extrudieren beginnt. Erhöhen Sie bei Bedarf den Extrusionsdruck, indem Sie den Steuerknopf im Uhrzeigersinn drehen, bis die Biotinte in einem kontinuierlichen Filament extrudiert ist, und zeichnen Sie die neue Druckeinstellung auf.Wählen Sie PH1 deaktivieren, um die Extrusion der Biotinte zu stoppen. Entfernen Sie Seidenpapier oder -folie, die die extrudierte Biotinte enthält, aus dem Druckbett und schließen Sie die Bioprinter-Tür. Um den 3D-Biodruck von geradlinigen Hydrogelsubstraten in einem 24-Well-Plattenformat durchzuführen, wählen Sie das Dienstprogrammmenü aus dem Hauptsteuerungsmenü und wählen Sie dann SD-Druck deaktivieren, damit die Bioprinter-Software G-Code-Dateien zum Drucken an den 3D-Bioprinter übertragen kann.Klicken Sie auf die Schaltfläche Laden in der Bioprinter-Software und wählen Sie die aktualisierte 24-Well-Platten-G-Code-Datei aus. Wählen Sie im rechten Bedienfeld der Software die Registerkarte Druckvorschau und klicken Sie auf die Schaltfläche Drucken, um mit dem Bioprinting in Bohrloch D1 zu beginnen. Nach Abschluss des Bioprintings der geradlinigen Konstrukte decken Sie die 24-Well-Platte mit ihrem Deckel ab und bringen Sie sie in eine Biosicherheitswerkbank der Klasse II. Tauchen Sie jedes geradlinige Konstrukt in zwei Tropfen steriler 50-millimoler Calciumchloridlösung und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.Saugen Sie die Calciumchloridlösung vorsichtig aus jedem Bohrlochkonstrukt ab und spülen Sie sie einmal in einem Milliliter 1X PBS ab, um überschüssiges Calciumchlorid zu entfernen. Um eine Austrocknung der biogedruckten Hydrogelkonstrukte zu verhindern, halten Sie die 3D-biogedruckten geradlinigen Konstrukte in frischem 1X PBS, bis die aus dem Knochenmark stammenden Mastzellen bereit sind, auf die Konstrukte gesät zu werden. Basierend auf den Vorwärts- und Seitenstreuparametern der mittels Durchflusszytometrie analysierten BMMCs wurde beobachtet, dass das Hydrogelsubstrat mit der höchsten CNC-Konzentration die native Größe oder Granularität der BMMCs im Vergleich zu den BMMCs, die in Abwesenheit der CNC-Agarose D-Mannitol-Hydrogel-Substrate kultiviert wurden, nicht veränderte.Die durchflusszytometrische Analyse der Permeabilität der BMMCs gegenüber Propidiumiodid zeigte, dass keine der getesteten CNC-Konzentrationen nachteilige Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit von BMMC hatte. Das CNC-Agarose-Substrat erhöhte die Expression der Mastzell-Biomarker bei CNC-Konzentrationen größer oder gleich 2,5%, die Expressionsniveaus dieser Rezeptoren blieben jedoch relativ konstant zwischen 2,5% und 12,5% CNC, was auf einen Effekt hindeutet, der unabhängig von der Konzentration von CNC ist. Der XTT-Assay zeigte, dass die metabolische Aktivität der auf den 3D-biogedruckten Hydrogelgerüsten kultivierten BMMCs über alle getesteten Zeitpunkte hinweg relativ konstant bei etwa 100% blieb.Ebenso zeigten die LDH-Freisetzungs- und PI-Farbstoffausschluss-Assays keine signifikanten Veränderungen in der Lebensfähigkeit der BMMCs. Sorgfältige Aufmerksamkeit bei der Auswahl des Druckdüsenmessgeräts, der Kalibrierung der Achsen des 3D-Biodruckers und der Extrusionsdruckeinstellung gewährleistet einen reproduzierbaren Druck hochwertiger 3D-Konstrukte. Die Leichtigkeit, mit der die Mastzellen abgerufen werden können, ermöglicht es, sie durch eine breite Palette biologischer Assays zu untersuchen, um jeden Aspekt ihrer zellulären Funktionen weiter zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Forschung

Biotechnik

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Formgedächtnis-Polymere für Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Rotierende Cell Culture Systems für Human Cell Culture: Human Trophoblastzellen als Modell

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk Film Culture-System für In-vitro- Analyse und Design-Biomaterial

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

Die Herstellung einer funktionalisierter magnetischer bakterielle Nanocellulose mit Eisenoxid-Nanopartikel

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Characterization of Leukocyte-platelet Rich Fibrin, A Novel Biomaterial

Charakterisierung von Leukozyten-Thrombozyten-Rich-Fibrin, ein neuartiges Biomaterial

Autologous platelet concentrates represent promising innovative tools in the field of regenerative medicine and have been extensively used in oral ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Die Herstellung von Inverted Kolloid-Kristallen Poly (Ethylenglycol) Scaffold: Eine dreidimensionale Zellkultur-Plattform für Leber-Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Herstellung von benutzerdefinierten Agarose Brunnen für die Aussaat von Zelle und Gewebe Ring Selbstmontage mit 3D-Druck Formen

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Großflächige Scan Sonde Nanolithografie erleichtert durch automatische Ausrichtung und seine Anwendung auf Substrat Herstellung für Zell-Kultur-Studien