Name: fabrication of a crystalline nanocellulose embedded agarose biomaterial ink for bone marrow-derived mast cell culture
Uploaded: 2021-05-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture at JoVE.com

Ringraziamo Alberta Innovates per aver fornito il CNC e Ken Harris e Jae-Young Cho per la loro consulenza tecnica durante la preparazione della matrice CNC / agarosio / D-mannitolo. Ringraziamo anche Ben Hoffman, Heather Winchell e Nicole Diamantides per la loro consulenza tecnica e supporto con la configurazione e la calibrazione della bioprinter 3D INKREDIBLE+.

NOTA: Questo protocollo è composto da cinque sezioni: (1) isolamento del midollo osseo di topo e differenziazione dei mastociti derivati dal midollo osseo del topo (BMMC), (2) fabbricazione di substrati di idrogel CNC/agarosio/D-mannitolo in un sistema a 24 pozzetti e coltura di BMMC sui substrati, (3) rimozione di BMMC dai substrati di idrogel CNC/agarosio/D-mannitolo e analisi della vitalità e dell'espressione del biomarcatore mediante citometria a flusso, (4) Bioprinting 3D di scaffold di idrogel da un inchiostro d...

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K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+of+nanocellulose-reinforced+PVA+hydrogel+with+human+corneal+epithelial+cells+for+ophthalmic+applications.">Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications.</a> Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35 (2019).</li><li>Fey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+nanocellulose+as+novel+carrier+for+intestinal+epithelial+cells+in+drug+delivery+studies.">Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies.</a> Materials Science and Engineering: C. 109, 110613 (2020).</li><li>Ojansivu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wood-based+nanocellulose+and+bioactive+glass+modified+gelatin-alginate+bioinks+for+3D+bioprinting+of+bone+cells.">Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells.</a> Biofabrication. 11 (3), 035010 (2019).</li><li>Jonsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+networks+on+nanocellulose+scaffolds.">Neuronal networks on nanocellulose scaffolds.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).</li><li>Samulin Erdem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+nanocrystals+modulate+alveolar+macrophage+phenotype+and+phagocytic+function.">Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function.</a> Biomaterials. 203, 31-42 (2019).</li><li>Menas, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrillar+vs+crystalline+nanocellulose+pulmonary+epithelial+cell+responses:+Cytotoxicity+or+inflammation.">Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation.</a> Chemosphere. 171, 671-680 (2017).</li><li>Halova, I., Draberova, L., Draber, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+chemotaxis+chemoattractants+and+signaling+pathways.">Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways.</a> Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).</li><li>Groll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+definition+of+bioinks+and+their+distinction+from+biomaterial+inks.">A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks.</a> Biofabrication. 11 (1), 013001 (2019).</li><li>Schwab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printability+and+shape+fidelity+of+bioinks+in+3D+bioprinting.">Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting.</a> Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).</li><li>Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+molecular+design+criteria+for+3D+printable+hydrogels.">Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels.</a> Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).</li><li>Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+viable+and+non-viable+cells+using+propidium+iodide+in+two+color+immunofluorescence.">Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence.</a> Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).</li><li>Usov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+nanocellulose+chirality+and+structure-properties+relationship+at+the+single+fibril+level.">Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level.</a> Nature Communications. 6 (1), 7564 (2015).</li></ol>

La fabbricazione di tessuti biomimetici 3D richiede la riuscita fusione del bioink, che imita i componenti della matrice extracellulare, con i componenti cellulari per creare analoghi fisiologici dei tessuti in vivo . Ciò richiede l'uso di cellule primarie, e non di cellule trasformate, quando si fabbricano tessuti biomimetici fisiologici. Le cellule immunologiche primarie, come i mastociti, tuttavia, sono particolarmente suscettibili agli effetti citotossici e ai cambiamenti fenotipici che possono essere provo...

Il recente interesse per i sistemi di coltura 3D e il bioprinting 3D ha focalizzato l'attenzione su idrogel e compositi idrogel. Questi compositi fungono da biomimetica viscosa ma porosa e possono essere composti fino al 99% di contenuto di acqua in peso, che è paragonabile ai tessuti biologici1,2,3. Queste caratteristiche dei compositi idrogel consentono quindi la crescita delle cellule senza influire sulla loro vitalità e funzione. Uno di questi compositi è la nanocellulosa cristallina (CNC), che è stata utilizzata come materiale di rinforzo nei compositi idrogel, negli scaffold cellulari nello sviluppo di impianti di biomateriali e nelle colture cellulari bidimensionali (2D) e 3D in vitro4,5. Per la maggior parte, le matrici composte da CNC non sono apertamente citotossiche per le cellule epiteliali corneali umane6, le cellule epiteliali intestinali7, le cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo umano8 o le cellule neuronali9. Tuttavia, l'attività metabolica e la proliferazione delle cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo umano diminuiscono in correlazione con l'aumento della viscosità dei compositi nanocellulosici a base di legno, suggerendo che la composizione della matrice deve essere attentamente testata per i suoi effetti deleteri sulle funzioni cellulari8.
Allo stesso modo, il CNC può indurre risposte infiammatorie nei macrofagi dopo l'internalizzazione, che potrebbero avere gravi conseguenze nei sistemi di coltura cellulare immunitaria 3D10,11. In effetti, ci sono pochissimi dati disponibili su come il CNC può influenzare altre risposte delle cellule immunitarie, in particolare le risposte infiammatorie allergiche che vengono avviate dai mastociti. I mastociti sono leucociti granulati che esprimono il recettore delle IgE ad alta affinità, FceRI, responsabile dell'attivazione delle risposte infiammatorie agli allergeni. La loro proliferazione e differenziazione dipendono dal fattore delle cellule staminali (SCF), che lega il recettore della tirosina, Kit. I mastociti sono derivati da cellule progenitrici del midollo osseo che entrano in circolazione e successivamente migrano perifericamente per disperdersi ubiquitariamente in tutti i tessuti umani12. Poiché i mastociti funzionano in un ambiente tissutale 3D, sono un candidato immunocellulare ideale per lo studio dei processi immunologici in modelli tissutali 3D in vitro. Tuttavia, ad oggi, non esiste un modello di tessuto 3D in vitro praticabile contenente mastociti.
A causa della natura altamente sensibile dei mastociti e della loro propensione a suscitare risposte pro-infiammatorie a stimoli esterni, è necessaria un'attenta considerazione dei costituenti della matrice 3D e del metodo di bioprinting per introdurre i mastociti nello scaffold 3D, come discusso ulteriormente. I costrutti tissutali possono essere biofabbricati da due grandi categorie di biomateriali, vale a dire, bioink e inchiostri biomateriali. La distinzione sta nel fatto che i bioink sono compositi di idrogel carichi di cellule, mentre gli inchiostri di biomateriali sono compositi di idrogel privi di cellule, come definito da Groll et al.13,14. Quindi, i costrutti 3D stampati con bioink contengono cellule pre-incorporate all'interno della matrice idrogel, mentre i costrutti 3D stampati con inchiostri biomateriali devono essere seminati con cellule post-stampa. La biofabbricazione di scaffold di coltura da bioink / inchiostri biomateriali a base di idrogel viene eseguita più comunemente utilizzando bioprinter 3D di estrusione, che estrudono l'inchiostro bioink / biomateriale attraverso un ugello su microscala sotto pressione tramite un pistone pneumatico o meccanico14. Le biostampanti di estrusione fabbricano scaffold 3D depositando il bioink in modelli di sezione trasversale 2D che sono impilati sequenzialmente l'uno sull'altro in un approccio "bottom-up".
Per essere compatibile con la bioprinting per estrusione, l'inchiostro bioink/biomateriale a base di idrogel deve possedere proprietà tissotropiche (diradamento del taglio), per cui i polimeri idrogel costituenti dell'inchiostro bioink/biomateriale fluiscono come un fluido attraverso un ugello a microcanale quando sottoposti a sforzo di taglio, ma ritornano a uno stato viscoso e gelatinoso dopo la rimozione dello stress di taglio15 . A causa del loro elevato contenuto di acqua, i polimeri di bioink a base di idrogel / inchiostri biomateriali devono essere reticolati, fisicamente o covalentemente, per mantenere l'architettura e l'integrità strutturale della struttura biostampata 3D. Nel caso di bioink carichi di cellule, le cellule sono direttamente sottoposte a sollecitazioni chimiche durante il processo di reticolazione. Il processo di estrusione delle cellule incapsulate all'interno della matrice di idrogel bioink sottopone anche le cellule a stress di taglio, che può portare a una ridotta vitalità e / o morte cellulare. Una volta che il modello tissutale 3D è stato biostampato, è difficile discriminare tra i livelli di citotossicità suscitati dalla matrice idrogel stessa e i processi di estrusione e reticolazione, rispettivamente. Ciò è particolarmente impegnativo nel contesto di scaffold 3D in cui le cellule sono pre-incorporate all'interno della matrice di idrogel, rendendo così difficile rimuovere le cellule per le analisi successive, il che sarebbe dannoso per la vitalità dei mastociti.
Un approccio più delicato alla generazione di costrutti tissutali 3D contenenti mastociti comporta la semina delle cellule in scaffold 3D a inchiostro biomateriale poroso prestampato da una sospensione di coltura cellulare, che sfrutta la capacità innata dei mastociti di migrare dalla circolazione ai tessuti periferici. I vantaggi di questo approccio di semina cellulare sono duplici: (i) i mastociti non sono sottoposti a sollecitazioni di taglio e chimiche dai processi di estrusione e reticolazione, rispettivamente, e (ii) le cellule possono essere facilmente rimosse dall'impalcatura 3D dopo l'esposizione mediante lavaggio delicato per l'analisi senza influire negativamente sulla loro vitalità. L'ulteriore vantaggio di seminare e analizzare la vitalità cellulare dei mastociti su scaffold di idrogel porosi biostampati in 3D rispetto ai dischi di idrogel 2D è che gli scaffold di idrogel biostampati in 3D ricapitolano le caratteristiche topografiche su microscala dei tessuti in vivo , che non sono presenti nei dischi idrogel planari 2D alla rinfusa. Questo approccio è un approccio adatto, rapido ed economico per determinare gli effetti citotossici potenzialmente catastrofici delle matrici di idrogel bioink candidate sui mastociti, così come su altre cellule immunologiche, prima di investire in costosi esperimenti di ingegneria tissutale 3D.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid (glacial)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AX0074-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose (OmniPur)</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2125-500GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-4888-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0632-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 24 Well Multidish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>930-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 96 Well Multidish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 175 cm2 Flask Vented</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130-191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet Class II</td>
			<td>Microzone Corp., Canada</td>
			<td>BK-2-6-B3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Fraction V (OmniPur)</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2930-100GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-1171-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge)</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>IK1020000303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mL</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>CL1010006001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>CSC0103000102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK HeartWare for PC</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>Version 2.4.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>S-10003-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>NZ4220005001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>NZ4250005001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>NZ4270005001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11465015001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Benchtop)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar&#160;96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Binder GmbH, Germany</td>
			<td>9040-0113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A00-1-1102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>44-390-7100GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5898-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12484028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Co. USA</td>
			<td>Version 10.6.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software, LLC</td>
			<td>Version 8.4.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15170-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Sodium Salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP410-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodonitrotetrazolium chloride (INT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I10406-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium L-lactate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2250-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes (1.7 mL clear)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes (2.0 mL clear)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZMQS60001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>725-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-3</td>
			<td>PeproTech, Inc.&#160;</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9913213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, 500 g</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP922I-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00D0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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fabrication of a crystalline nanocellulose embedded agarose biomaterial ink for bone marrow-derived mast cell culture

La bioprinting tridimensionale (3D) utilizza compositi a base di idrogel (o inchiostri di biomateriali) che si depositano in un modello, formando un substrato su cui vengono depositate le cellule. Poiché molti inchiostri di biomateriali possono essere potenzialmente citotossici per le cellule primarie, è necessario determinare la biocompatibilità di questi compositi idrogel prima del loro utilizzo in costosi processi di ingegneria tissutale 3D. Alcuni metodi di coltura 3D, tra cui il bioprinting, richiedono che le cellule siano incorporate in una matrice 3D, rendendo difficile estrarre e analizzare le cellule per i cambiamenti nella vitalità e nell'espressione dei biomarcatori senza provocare danni meccanici. Questo protocollo descrive come prova di concetto, un metodo per valutare la biocompatibilità di un composito di agarosio incorporato nella nanocellulosa cristallina (CNC), fabbricato in un sistema di coltura a 24 pozzetti, con mastociti derivati dal midollo osseo di topo (BMMC) utilizzando saggi citometrici a flusso per la vitalità cellulare e l'espressione di biomarcatori.
Dopo 18 ore di esposizione alla matrice CNC/agarosio/D-mannitolo, la vitalità del BMMC è rimasta inalterata misurata dalla permeabilità allo ioduro di propidio (PI). Tuttavia, le BMMC coltivate sul substrato CNC/agarosio/D-mannitolo sembravano aumentare leggermente la loro espressione del recettore IgE ad alta affinità (FcεRI) e del recettore del fattore delle cellule staminali (Kit; CD117), anche se questo non sembra dipendere dalla quantità di CNC nel composito bioink. La fattibilità dei BMMC è stata anche valutata a seguito di un'esposizione a intervalli di idrogel fabbricati da un inchiostro di biomateriale commerciale composto da nanocellulosa fibrillare (FNC) e alginato di sodio utilizzando un bioprinter di estrusione 3D. Per un periodo di 6-48 ore, i substrati FNC/alginato non hanno influenzato negativamente la vitalità delle BMMC come determinato mediante citometria a flusso e saggi di microtitolazione (XTT e lattato deidrogenasi). Questo protocollo descrive un metodo efficiente per esaminare rapidamente la compatibilità biochimica degli inchiostri biomateriali candidati per la loro utilità come scaffold 3D per la semina post-stampa con i mastociti.

Una delle caratteristiche più cruciali di un inchiostro biomateriale di successo o di un substrato di coltura è quella della biocompatibilità. In primo luogo, il substrato non deve indurre la morte cellulare. Esistono diversi metodi citometrici a microtitolazione e a flusso per quantificare la vitalità cellulare e la necrosi; tuttavia, questi metodi non sono suscettibili di analizzare le cellule incorporate all'interno di una matrice di idrogel. In questo protocollo, la limitazione di cui sopra viene aggirata seminan...

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Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture

Questo protocollo evidenzia un metodo per valutare rapidamente la biocompatibilità di un inchiostro biomateriale idrogel composito di nanocellulosa cristallina (CNC)/agarosio con mastociti derivati dal midollo osseo di topo in termini di vitalità cellulare ed espressione fenotipica dei recettori della superficie cellulare, Kit (CD117) e recettore IgE ad alta affinità (FcεRI).

Fabbricazione di un inchiostro biomateriale di agarosio incorporato in nanocellulosa cristallina per la coltura di mastociti derivati dal midollo osseo

Three-dimensional (3D) bioprinting utilizes hydrogel-based composites (or biomaterial inks) that are deposited in a pattern, forming a substrate onto ...

Questo protocollo offre un approccio facile e rapido per lo screening di inchiostri biomateriali candidati per potenziali effetti citotossici contro cellule primarie e immunitarie sensibili prima di complessi esperimenti di bioprinting 3D. Dopo l'incubazione delle cellule immunitarie sui costrutti di inchiostro del biomateriale, le cellule possono essere facilmente recuperate dai costrutti mediante lavaggio delicato per eseguire analisi di citotossicità o biomarcatori a valle. Questo protocollo è direttamente rilevante per l'ingegneria tissutale in cui i tessuti bioprinted destinati al trapianto devono essere costruiti con cellule primarie e inchiostri biocompatibili di biomateriali.Per iniziare, preparare una cartuccia d'inchiostro bio per l'installazione sulla bioprinter INKREDIBLE + 3D. In primo luogo, rimuovere i tappi terminali blu dalla cartuccia d'inchiostro biomateriale da tre millilitri e apporre un ugello sterile per bioprinting conico calibro 22 all'estremità Luer lock della cartuccia di inchiostro bio. Collegare il tubo di alimentazione della pressione dell'aria per la testina di stampa uno o PH1 all'estremità opposta della cartuccia e inserire la cartuccia con l'ugello di bioprinting conico collegato nello slot verticale di PH1.Quindi, posizionare saldamente la cartuccia in PH1 con un ugello di bioprinting conico che si estende sotto la testina di stampa. Stringere la vite su PH1 in senso orario fino a quando non si stringe il dito per bloccare la cartuccia d'inchiostro bio in posizione. Si noti che il bioprinting 3D può essere eseguito con PH2 lasciato vuoto.Accendi la bioprinter e avvia il software bioprinter su un PC collegato al bioprinter 3D tramite un cavo USB 2.0. Nel software, fai clic sul pulsante connetti per sincronizzarlo con il bioprinter 3D. Osserva tre opzioni nel menu di controllo principale della biostampante 3D.Innanzitutto, prepara la bioprint. In secondo luogo, menu delle utilità. E terzo, schermata di stato.Seleziona l'opzione prepara bioprint, quindi scorri verso il basso e seleziona l'opzione home axes. Dopo aver eseguito correttamente la calibrazione degli assi XYZ, l'altezza del letto di stampa si abbasserà leggermente e le testine di stampa si sposteranno al di sopra del punto centrale del letto di stampa. Per procedere con la calibrazione del punto di partenza per la bioprinting in lastre a 24 pozzetti, rimuovere una piastra di coltura sterile a 24 pozzetti dal suo involucro di plastica sigillato e segnare un punto sul punto centrale del pozzo D1 sul lato inferiore della piastra con un marcatore permanente.Rimuovere il coperchio della piastra e posizionare la piastra di coltura a 24 pozzetti sul letto di stampa con il pozzetto D1 situato nell'angolo anteriore sinistro del letto di stampa. Nel menu di controllo principale, selezionare il menu utilità e quindi spostare l'asse. Spostare le testine di stampa con incrementi di un millimetro lungo gli assi X e Y fino a quando l'ugello di bioprinting conico di PH1 è direttamente sopra il punto contrassegnato sotto il pozzo D1. Se necessario, regolare la posizione dell'ugello di bioprinting conico sul punto spostando le testine di stampa con incrementi di 0,1 millimetri.Registrare le coordinate X e Y dell'ugello di bioprinting conico quando si trova direttamente sopra il centro del pozzo D1 come indicato nella schermata del pannello di controllo della bioprinter 3D e segnare le coordinate. Quindi, sollevare il letto di stampa con incrementi di un millimetro fino a quando il fondo del pozzo D1 sta quasi toccando l'ugello di bioprinting conico installato in uno della testina di stampa. Se necessario, regolate il movimento del piano di stampa con incrementi di 0,1 millimetri.Dal menu delle utilità, selezionare l'opzione di calibrazione dell'asse Z e selezionare e confermare ulteriormente l'opzione di calibrazione Z di memorizzazione. Torna al menu principale e seleziona l'opzione prepara bioprint. Scorri verso il basso e seleziona l'opzione Calibra Z.Aggiorna il codice geometrico della piastra a 24 pozzetti o il codice G con le coordinate del punto di partenza corrette. Aprire il file G-code a 24 pozzetti fornito sul software bioprint. Aggiornare le coordinate X e Y sulla riga uno con i valori ottenuti nei passaggi precedenti e salvare il file con un nuovo nome.Assicurarsi che la pompa pneumatica sia strettamente collegata alla porta di aspirazione dell'aria posteriore della bioprinter INKREDIBLE + 3D e accenderla. Estrarre la manopola di controllo in avanti situata sul lato destro della bioprinter INKREDIBLE+3D. Assicurarsi che i manometri digitali per PH1 e PH2 situati sulla parte anteriore della bioprinter leggano ciascuno vicino allo zero kilopascal.Ruotare lentamente la manopola di controllo in avanti in senso orario fino a quando la pressione indicata sul manometro sinistro per PH1 raggiunge i 12 kilopascal. Posizionare una carta velina piegata o un pezzo di pellicola sigillante impermeabile sotto l'ugello di stampa della cartuccia installata, facendo attenzione a non toccare l'ugello di stampa. Dal menu di controllo principale sulla bioprinter 3D, selezionare Prepara bioprint.Passare a e selezionare Attiva PH1. Si noti che l'inchiostro bio inizia ad estrudersi dall'ugello di stampa. Se necessario, aumentare la pressione di estrusione ruotando la manopola di controllo in senso orario fino a quando l'inchiostro biologico non viene estruso in un filamento continuo e registrare la nuova impostazione della pressione.Selezionare disattiva PH1 per interrompere l'estrusione dell'inchiostro biologico. Rimuovere la carta velina o la pellicola contenente l'inchiostro bio estruso dal piano di stampa e chiudere la porta della bioprinter. Per eseguire la bioprinting 3D di substrati di idrogel rettilineo in un formato di piastra a 24 pozzetti, selezionare il menu delle utilità dal menu di controllo principale, quindi selezionare disabilita la stampa SD che consentirà al software bioprinter di trasmettere i file G-code al bioprinter 3D per la stampa.Fare clic sul pulsante di caricamento nel software bioprinter e selezionare il file G-code della piastra a 24 pozzetti aggiornato. Nel pannello di controllo a destra del software, selezionare la scheda di anteprima di stampa e fare clic sul pulsante di stampa per iniziare la bioprinting nel pozzo D1. Al termine della bioprinting dei costrutti rettilinei, coprire la piastra a 24 pozzetti con il coperchio e spostarla in un armadio di biosicurezza di classe II. Immergere ogni costrutto rettilineo in due gocce di soluzione sterile di cloruro di calcio da 50 millimolari e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.Aspirare accuratamente la soluzione di cloruro di calcio da ciascun pozzo e risciacquare una volta in un millilitro di 1X PBS per rimuovere il cloruro di calcio in eccesso. Per prevenire la disidratazione dei costrutti idrogel bioprinted, mantenere i costrutti rettilinei bioprinted 3D in PBS 1X fresco fino a quando i mastociti derivati dal midollo osseo sono pronti per essere seminati sui costrutti. Sulla base dei parametri di dispersione avanti e laterale delle BMMC analizzate mediante citometria a flusso, è stato osservato che il substrato di idrogel con la più alta concentrazione CNC non alterava la dimensione nativa o la granularità delle BMMC rispetto alle BMMC coltivate in assenza dei substrati di idrogel D-mannitolo di agarosio CNC.L'analisi citometrica a flusso della permeabilità delle BMMC allo ioduro di propidio ha dimostrato che nessuna delle concentrazioni CNC testate ha suscitato effetti negativi sulla vitalità del BMMC. Il substrato di agarosio CNC ha aumentato l'espressione dei biomarcatori dei mastociti a concentrazioni CNC maggiori o uguali al 2,5% Tuttavia, i livelli di espressione di questi recettori sono rimasti relativamente coerenti tra il 2,5% e il 12,5% CNC, il che suggerisce un effetto indipendente dalla concentrazione di CNC. Il test XTT ha dimostrato che l'attività metabolica dei BMMC coltivati sugli scaffold di idrogel biostampati in 3D è rimasta relativamente coerente a circa il 100% in tutti i punti temporali testati.Allo stesso modo, i saggi di rilascio LDH e di esclusione del colorante PI non hanno rivelato cambiamenti significativi nella vitalità dei BMMC. Un'attenta attenzione alla selezione del misuratore dell'ugello di stampa, alla calibrazione degli assi della biostampante 3D e all'impostazione della pressione di estrusione garantirà la stampa riproducibile di costrutti 3D di alta qualità. La facilità con cui i mastociti possono essere recuperati consente loro di essere sondati da una vasta gamma di saggi biologici per studiare ulteriormente qualsiasi aspetto delle loro funzioni cellulari.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

Piattaforme microfabbricazione per coltura cellulare meccanicamente dinamica

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Ricerca

Bioingegneria

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