Name: fabrication of a crystalline nanocellulose embedded agarose biomaterial ink for bone marrow-derived mast cell culture
Uploaded: 2021-05-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture at JoVE.com

CNC/アガロース/D-マンニトールマトリックスを準備する際の技術的なアドバイスをCNCとケン・ハリスとジェヨン・チョーに提供してくれたアルバータ・イノベートに感謝します。また、INKREDIBLE+ 3Dバイオプリンターのセットアップとキャリブレーションに関する技術的なアドバイスとサポートに対して、ベン・ホフマン、ヘザー・ウィンチェル、ニコール・ディアマンタイドに感謝します。

注:このプロトコルは、(1)マウス骨髄の分離とマウス骨髄由来マスト細胞(BMMCs)の分化、(2)24ウェルシステムでCNC/アガロース/D-マンニトールヒドロゲル基質の製造および基質上のBMMCsの培養、(1)の5つのセクションで構成されています。 (3)CNC/アガロース/D-マンニトールヒドロゲル基材からのBMMCsの除去と、フローサイトメトリーを用いた生存率とバイオマーカー発現の解析 (4)市販のフィブリラー...

<ol>
	<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Drury, J. L., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+tissue+engineering:+Scaffold+design+variables+and+applications.">Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications.</a> Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).</li><li>Lee, K. Y., Mooney, D. 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K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+of+nanocellulose-reinforced+PVA+hydrogel+with+human+corneal+epithelial+cells+for+ophthalmic+applications.">Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications.</a> Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35 (2019).</li><li>Fey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+nanocellulose+as+novel+carrier+for+intestinal+epithelial+cells+in+drug+delivery+studies.">Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies.</a> Materials Science and Engineering: C. 109, 110613 (2020).</li><li>Ojansivu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wood-based+nanocellulose+and+bioactive+glass+modified+gelatin-alginate+bioinks+for+3D+bioprinting+of+bone+cells.">Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells.</a> Biofabrication. 11 (3), 035010 (2019).</li><li>Jonsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+networks+on+nanocellulose+scaffolds.">Neuronal networks on nanocellulose scaffolds.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).</li><li>Samulin Erdem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+nanocrystals+modulate+alveolar+macrophage+phenotype+and+phagocytic+function.">Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function.</a> Biomaterials. 203, 31-42 (2019).</li><li>Menas, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrillar+vs+crystalline+nanocellulose+pulmonary+epithelial+cell+responses:+Cytotoxicity+or+inflammation.">Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation.</a> Chemosphere. 171, 671-680 (2017).</li><li>Halova, I., Draberova, L., Draber, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+chemotaxis+chemoattractants+and+signaling+pathways.">Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways.</a> Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).</li><li>Groll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+definition+of+bioinks+and+their+distinction+from+biomaterial+inks.">A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks.</a> Biofabrication. 11 (1), 013001 (2019).</li><li>Schwab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printability+and+shape+fidelity+of+bioinks+in+3D+bioprinting.">Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting.</a> Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).</li><li>Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+molecular+design+criteria+for+3D+printable+hydrogels.">Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels.</a> Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).</li><li>Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+viable+and+non-viable+cells+using+propidium+iodide+in+two+color+immunofluorescence.">Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence.</a> Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).</li><li>Usov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+nanocellulose+chirality+and+structure-properties+relationship+at+the+single+fibril+level.">Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level.</a> Nature Communications. 6 (1), 7564 (2015).</li></ol>

3Dバイオミメティック組織の製造には、細胞外マトリックスの成分を模倣するバイオインクと細胞内 組織 の生理学的類似体を作り出すバイオインクの合併が成功する必要があります。これは、生理学的バイオミメティック組織を作製する際に、原細胞の使用を必要とし、形質転換されていない細胞である。しかし、マスト細胞のような一次免疫学的細胞は、特に生体インクマトリック...

最近の3D培養システムと3Dバイオプリンティングへの関心は、ヒドロゲルおよびヒドロゲル複合材料に注目されています。これらの複合材料は、粘性でありながら多孔質のバイオミメティクスとして機能し、生物学的組織に匹敵する重量で最大99%の水分含有量で構成することができます1,2,3。ヒドロゲル複合材料のこれらの特徴は、それによって、その生存率および機能に影響を与えることなく細胞の増殖を可能にする。そのような複合材料の1つは、ヒドロゲル複合材料の強化材料として使用されてきた結晶性ナノセルロース(CNC)、生体材料インプラントの開発における細胞足場、および2次元(2D)および3Dインビトロ細胞培養4,5です。ほとんどの場合、CNCからなるマトリックスは、ヒト角膜上皮細胞6、腸上皮細胞7、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞8、またはニューロン様細胞9に対してあからさやかに細胞毒性を有しない。しかし、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の代謝活性および増殖は、木材ベースのナノセルロース複合体の粘度の増加との相関性が低下し、マトリックスの組成が細胞機能に及ぼす有害な影響について注意深く試験しなければならないことを示唆している8。
同様に、CNCは、3D免疫細胞培養システム10,11において重大な影響を及ぼす可能性がある、内在化時にマクロファージにおいて炎症反応を誘発する可能性がある。実際、CNCが他の免疫細胞応答、特に肥満細胞によって開始されるアレルギー性炎症反応にどのように影響を与えるかについて、利用可能なデータはほとんどありません。マスト細胞は、アレルゲンに対する炎症反応を活性化する役割を担う高親和性IgE受容体FceRIを発現するグラニュール化白血球である。それらの増殖および分化は、チロシン受容体、キットに結合する幹細胞因子(SCF)に依存している。マスト細胞は、循環に入り、その後、すべてのヒト組織に遍在的に分散するために末梢移動する骨髄前駆細胞に由来する12。マスト細胞は3D組織環境で機能するため、in vitro 3D組織モデルで免疫学的プロセスを研究するための理想的な免疫細胞候補です。しかし、現在までに、肥満細胞を含むインビトロ3D組織モデルは存在しない。
肥満細胞の高感度性と、外部刺激に対する炎症反応を引き出す傾向があるため、3Dマトリックス構成成分と3D足場にマスト細胞を導入するバイオプリンティング法を慎重に検討することが必要である。組織構築物は、バイオインクと生体材料インクの2つの大きなカテゴリーからバイオファブリケートすることができます。この違いは、バイオインクが細胞を含むヒドロゲル複合材料であるのに対し、生体材料インクはGrollららによって定義される細胞を欠くヒドロゲル複合体であるという事実にあります。したがって、バイオインクで印刷された3Dコンストラクトにはヒドロゲルマトリックス内にあらかじめ埋め込まれた細胞が含まれていますが、生体材料インクで印刷された3Dコンストラクトはポストプリンティングの細胞で播種する必要があります。ヒドロゲルベースのバイオインク/生体材料インクからの培養スキャフォールドのバイオファブリケーションは、最も一般的に、ニューマチックまたは機械的に駆動されるピストン14を介して圧力下でマイクロスケールノズルを介してバイオインク/生体材料インクを押し出す押出3Dバイオプリンタを使用して行われます。押出バイオプリンターは、「ボトムアップ」アプローチで互いに順次積み重ねられる2D断面パターンでバイオインキを堆積させることによって、3D足場を作製する。
押出バイオプリンティングと互換性を持つためには、ヒドロゲルベースのバイオインク/バイオマテリアルインクはチキソトロピック(せん断薄化)特性を有する必要があり、それによってバイオインク/生体材料インクの構成ヒドロゲルポリマーは、せん断応力を受けるとマイクロチャネルノズルを通る流体のように流れるが、シアストレスの除去時に粘性のゲル様状態に戻る必要がある。.含水率が高いため、3Dバイオプリント構造のアーキテクチャと構造的完全性を維持するために、ヒドロゲルベースのバイオインク/生体材料インクのポリマーを物理的または共有的に架橋する必要があります。細胞を含むバイオインクの場合、細胞は架橋プロセス中に直接化学ストレスを受ける。バイオインクヒドロゲルマトリックス内にカプセル化された細胞を押し出すプロセスは、細胞を剪断応力にさせ、生存率の低下および/または細胞死につながる可能性があります。3D組織モデルがバイオプリントされると、ヒドロゲルマトリックス自体によって引き出される細胞毒性のレベルと、押出および架橋プロセスをそれぞれ区別することは困難です。これは、細胞がヒドロゲルマトリックス内に事前に埋め込まれている3D足場の文脈では特に困難であり、その後の分析のために細胞を除去することは困難であり、肥満細胞の生存率に有害である。
マスト細胞を含む3D組織構築物を生成するためのより穏やかなアプローチは、細胞培養懸濁液からプレプリントされた多孔質生体材料インク3D足場に細胞を播種することを含み、肥満細胞が循環から末梢組織に移行する先天的な能力を活用する。この細胞播種アプローチの利点は、(i)マスト細胞がそれぞれ押出および架橋プロセスからせん断および化学的ストレスを受けず、(ii)細胞を分析のために穏やかに洗浄することによって3D足場から容易に除去することができる。2Dヒドロゲルディスクとは対照的に、3Dバイオプリントされた多孔質ヒドロゲル足場上のマスト細胞の細胞生存率を播種および分析する追加の利点は、3Dバイオプリントヒドロゲル足場が 生体組織の 微小地形特徴を再現することです。このアプローチは、高価な3D組織工学実験への投資に先立ち、マスト細胞および他の免疫学的細胞に対するバイオインクヒドロゲルマトリックス候補の潜在的に壊滅的な細胞毒性効果を決定するための、適切で迅速かつ費用対効果の高いアプローチです。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid (glacial)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AX0074-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose (OmniPur)</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2125-500GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-4888-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0632-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 24 Well Multidish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>930-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 96 Well Multidish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 175 cm2 Flask Vented</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130-191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet Class II</td>
			<td>Microzone Corp., Canada</td>
			<td>BK-2-6-B3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Fraction V (OmniPur)</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2930-100GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-1171-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge)</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>IK1020000303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mL</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>CL1010006001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>CSC0103000102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK HeartWare for PC</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>Version 2.4.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>S-10003-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>NZ4220005001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>NZ4250005001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>NZ4270005001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11465015001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Benchtop)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar&#160;96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Binder GmbH, Germany</td>
			<td>9040-0113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A00-1-1102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>44-390-7100GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5898-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12484028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Co. USA</td>
			<td>Version 10.6.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software, LLC</td>
			<td>Version 8.4.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15170-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Sodium Salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP410-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodonitrotetrazolium chloride (INT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I10406-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium L-lactate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2250-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes (1.7 mL clear)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes (2.0 mL clear)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZMQS60001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>725-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-3</td>
			<td>PeproTech, Inc.&#160;</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9913213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, 500 g</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP922I-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00D0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of a crystalline nanocellulose embedded agarose biomaterial ink for bone marrow-derived mast cell culture

3次元(3D)バイオプリンティングは、パターンに堆積したヒドロゲルベースの複合材料(または生体材料インク)を利用し、細胞が堆積する基質を形成します。多くの生体材料インクは原発細胞に対して細胞毒性を持つ可能性があるため、高価な3D組織工学プロセスで使用する前に、これらのヒドロゲル複合体の生体適合性を決定する必要があります。バイオプリンティングを含む一部の3D培養法では、細胞を3Dマトリックスに埋め込む必要があり、機械的損傷を引き起すことなく生存率とバイオマーカー発現の変化について細胞を抽出して分析することが困難です。本プロトコルは、細胞生存率およびバイオマーカー発現に関するフローサイトメトリックアッセイを用いて、24ウェル培養系に作製された結晶性ナノセルロース(CNC)埋め込みアガロース複合体の生体適合性を評価する方法である概念実証として説明する。
CNC/アガロース/D-マンニトールマトリックスへの18時間の曝露後、BMMCの生存率は、ヨウ化プロピジウム(PI)透過性によって測定されるように変化しなかった。しかし、 CNC/アガロース/D-マンニトール 基質上で培養されたBMMCsは、高親和性IgE受容体(FcεRI)および幹細胞因子受容体(Kit;) の発現をわずかに増加するように見えた。CD117)は、これはバイオインク複合体中のCNCの量に依存しているようには見えないが。BMMCsの生存率は、3D押出バイオプリンターを用いてフィブリラーナノセルロース(FNC)とアルギン酸ナトリウムで構成された市販の生体材料インクから製造されたヒドロゲル足場への経時暴露後にも評価された。6-48時間の期間にわたって、FNC/アルギン酸基質は、フローサイトメトリーおよびマイクロタイターアッセイ(XTTおよび乳酸脱水素酵素)によって決定されるBMMCsの生存率に悪影響を及ぼさなかった。このプロトコルは、マスト細胞を用いたポストプリントシード用の3Dスキャフォールドとして、その有用性のためのバイオマテリアルインキ候補の生化学的適合性を迅速にスクリーニングする効率的な方法を記述する。

生体材料インクまたは培養基質の最も重要な特徴の1つは、生体適合性です。主として、基質は細胞死を誘発してはならない。細胞の生存率と壊死を定量化するいくつかのマイクロタイターベースおよびフローサイトメトリック法があります。しかし、これらの方法は、ヒドロゲルマトリックス内に埋め込まれた細胞を分析するのに適していません。このプロトコルにおいて、上記の制限は、...

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Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture

このプロトコルは、細胞の生存率および細胞表面受容体の表現型発現の観点から、マウス骨髄由来肥満細胞を有する結晶性ナノセルロース(CNC)/アガロース複合ヒドロゲル生体材料インクの生体適合性を迅速に評価する方法を強調している。

骨髄由来肥満細胞培養用結晶性ナノセルロース埋め込みアガロースバイオマテリアルインクの製造

Three-dimensional (3D) bioprinting utilizes hydrogel-based composites (or biomaterial inks) that are deposited in a pattern, forming a substrate onto ...

このプロトコルは、複雑な3Dバイオプリンティング実験の前に、敏感な一次細胞および免疫細胞に対する潜在的な細胞毒性効果のための候補生体材料インクをスクリーニングするための簡単かつ迅速なアプローチを提供する。生体物質インク構築物上の免疫細胞のインキュベーション後、細胞は下流の細胞傷害性またはバイオマーカー分析を行うために穏やかな洗浄によって構築物から容易に取り出すことができる。このプロトコルは、移植を目的としたバイオプリント組織を原細胞および生体適合性生体材料インクから構築しなければならない組織工学に直接関連する。まず、INKREDIBLE+3Dバイオプリンターにインストールするためのバイオインクカートリッジを用意します。まず、3ミリリットルの生体材料インクカートリッジから青色のエンドキャップを取り出し、滅菌22ゲージ円錐形バイオプリンティングノズルをバイオインクカートリッジのLuerロックエンドに貼り付けます。プリントヘッド1またはPH1用の空気圧供給チューブをカートリッジの反対側の端に接続し、取り付けられた円錐形バイオプリンティングノズルを取り付けたカートリッジをPH1の垂直スロットに挿入します。次に、プリントヘッドの下に伸びる円錐形のバイオプリンティングノズルを使用して、カートリッジをPH1にしっかりと装着します。PH1のネジを指が締まるまで時計回りに締め、バイオインクカートリッジを所定の位置に固定します。3Dバイオプリンティングは、PH2を空のままにして実行できることに注意してください。バイオプリンターの電源を入れ、USB 2.0ケーブルを介して3Dバイオプリンターに接続されたPCでバイオプリンターソフトウェアを起動します。ソフトウェアで、接続ボタンをクリックして、3Dバイオプリンターと同期します。3Dバイオプリンターのメインコントロールメニューの3つのオプションを観察してください。まず、バイオプリントを準備します。次に、ユーティリティメニューです。そして第三に、ステータス画面。[バイオプリントの準備] オプションを選択し、下にスクロールしてホーム軸オプションを選択します。XYZ軸のキャリブレーションが成功すると、プリントベッドの高さがわずかに下がり、プリントヘッドがプリントベッドの中心点の上に移動します。24ウェルプレートでのバイオプリンティングの開始点キャリブレーションを進めるには、密閉されたプラスチック包装から無菌の24ウェル培養プレートを取り除き、プレートの下側にあるウェルD1の中心点にドットを永久的なマーカーでマークします。プレートカバーを取り外し、プリントベッドの左前角に位置するウェルD1のプリントベッドに24ウェル培養プレートを置きます。メインコントロールメニューでユーティリティメニューを選択し、軸を移動します。PH1の円錐形バイオプリンティングノズルがウェルD1の下にマークされたドットの上に直接あるまで、X軸とY軸に沿って1ミリメートルずつプリントヘッドを移動します。必要に応じて、印刷ヘッドを 0.1 ミリメートル単位で移動して、円錐形のバイオプリンティング ノズルの位置を細かく調整します。3Dバイオプリンターのコントロールパネル画面に示されているように、ウェルD1の中心を直接上にしたときの円錐バイオプリントノズルのX座標とY座標を記録し、座標をマークダウンします。次に、プリントヘッド1に設置された円錐形バイオプリンティングノズルにウェルD1の底部がほぼ接触するまで、プリントベッドを1ミリメートルずつ上げます。必要に応じて、プリントベッドの動きを0.1ミリメートル単位で微調整します。ユーティリティメニューから Z 軸キャリブレーションオプションを選択し、さらに「Z キャリブレーション」オプションを選択して確認します。メインメニューに戻り、バイオプリントの準備オプションを選択します。スクロールダウンして、[Z の調整]オプションを選択します。24 ウェル プレートのジオメトリ コードまたは G コードを、正しい開始点座標で更新します。バイオプリントソフトウェアで提供されている24ウェルGコードファイルを開きます。1 行目の X 座標と Y 座標を、前の手順で取得した値で更新し、ファイルを新しい名前で保存します。空気圧ポンプがINKREDIBLE+3Dバイオプリンターの後部空気取り口にしっかりと接続されていることを確認し、オンにします。INKREDIBLE+3Dバイオプリンターの右側にある前方制御ノブを引き出します。バイオプリンターの前面にあるPH1とPH2のデジタル圧力計が、それぞれゼロキロパスカル近くを読むことを確認してください。PH1の左ゲージに示された圧力が12キロパスカルに達するまで、前方制御ノブを時計回りにゆっくりと回転させます。折り紙または防水シールフィルムを取り付けたカートリッジの印刷ノズルの下に、印刷ノズルに触れないように注意してください。3Dバイオプリンターのメインコントロールメニューから、バイオプリントの準備を選択します。[PH1 を有効にする] に移動して選択します。バイオインクが印刷ノズルから押し出しを開始することに注意してください。必要に応じて、バイオインクが連続フィラメントに押し出されるまでコントロールノブを時計回りに回転させることで押出圧力を高め、新しい圧力設定を記録します。[PH1 をオフにする] を選択すると、バイオインクの押し出しが停止します。押し出されたバイオインクを含むティッシュペーパーまたはフィルムをプリントベッドから取り出し、バイオプリンターのドアを閉めます。24ウェルプレート形式で直流ヒドロゲル基板の3Dバイオプリンティングを実行するには、メインコントロールメニューからユーティリティメニューを選択し、バイオプリンターソフトウェアがGコードファイルを印刷用に3Dバイオプリンターに送信できるようにするSDプリントを無効にします。バイオプリンターソフトウェアのロードボタンをクリックし、更新された24ウェルプレートGコードファイルを選択します。ソフトウェアの右側のコントロールパネルで、印刷プレビュータブを選択し、プリントボタンをクリックして、Well D1でバイオプリントを開始します。直流構造のバイオプリンティングが完了したら、蓋で24ウェルプレートを覆い、クラスIIのバイオセーフティキャビネットに移動します。各直腸構造を滅菌50ミリモルクロライド溶液の2滴に浸し、室温で5分間インキュベートします。各ウェルから慎重に塩化カルシウム溶液を吸引し、1XPBSの1ミリリットルに1回リンスして余分な塩化カルシウムを除去する。バイオプリントヒドロゲル構築物の脱水を防ぐために、骨髄由来肥満細胞が構築物に播種される準備が整うまで、新鮮な1X PBSで3Dバイオプリント直行構造を維持します。フローサイトメトリーで解析したBMMCsの前方および側散乱パラメータに基づいて、CNC濃度が最も高いヒドロゲル基板は、CNCアガロースD-マンニトールヒドロゲル基材の不在時に培養されたBMMCsと比較して、BMMCsの天然サイズまたは粒度を変化させなかったことを観察した。BMMCsのヨウ化プロピジウムへの透過性のフロー細胞測定分析は、試験されたCNC濃度のいずれもBMMC生存率に悪影響を及ぼしていないことを実証した。CNCアガロース基質は、2.5%以上のCNC濃度でマスト細胞バイオマーカーの発現を増加させたが、これらの受容体の発現レベルは、CNCの濃度とは無関係であるという効果を示唆する2.5%と12.5%CNCの間で相対的に一貫したままであった。XTTアッセイは、3Dバイオプリントヒドロゲル足場で培養されたBMMCsの代謝活性が、すべての試験された時点で約100%で比較的一貫していることを実証した。同様に、LDHリリースとPI染料除外アッセイは、BMMCsの生存率に大きな変化を明らかにしなかった。印刷ノズルゲージの選択、3Dバイオプリンターの軸のキャリブレーション、および押出圧力設定は、高品質の3D構造の再現性印刷を保証します。肥満細胞を取り出すことができる容易さは、彼らの細胞機能の任意の側面をさらに研究するために生物学的アッセイの広い範囲によって調査されることを可能にする。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

機械的にダイナミックな細胞培養のための微細加工プラットフォーム

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

アクティブな細胞培養のための形状記憶ポリマー

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

ヒト細胞培養のための回転細胞培養システム：モデルとしてのヒト栄養膜細胞

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

用絹フィルム培養システム in vitroで分析とマテリアルデザイン

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

酸化鉄ナノ粒子との機能を有する磁性細菌Nanocelluloseの作製

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Characterization of Leukocyte-platelet Rich Fibrin, A Novel Biomaterial

白血球、血小板リッチフィブリン、新規生体材料の特性評価

Autologous platelet concentrates represent promising innovative tools in the field of regenerative medicine and have been extensively used in oral ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

肝組織工学のための三次元細胞培養プラットフォーム：逆コロイド結晶ポリ（エチレングリコール）足場の作製

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

3D細胞培養のための肺細胞外マトリックスから調整可能なヒドロゲル

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

細胞播種用カスタム Agarose 井戸とティッシュ リング自己組織型の 3 D プリントを使用しての作製

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...