Name: fabrication of a crystalline nanocellulose embedded agarose biomaterial ink for bone marrow-derived mast cell culture
Uploaded: 2021-05-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture at JoVE.com

Мы благодарим Alberta Innovates за предоставление ЧПУ, а также Кена Харриса и Дже-Янг Чо за их технические консультации при подготовке матрицы CNC/agarose/D-mannitol. Мы также благодарим Бена Хоффмана, Хизер Уинчелл и Николь Диамантидес за их технические консультации и поддержку в настройке и калибровке 3D-биопринтера INKREDIBLE+.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол состоит из пяти разделов: (1) выделение костного мозга мыши и дифференцировка тучных клеток костного мозга мыши (BMMCs), (2) изготовление гидрогелевых субстратов с ЧПУ / агарозой / D-маннитом в 24-луночной системе и культура BMMC на субстратах, (3) удаление BMMC из субстрато?...

<ol>
	<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Drury, J. L., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+tissue+engineering:+Scaffold+design+variables+and+applications.">Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications.</a> Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).</li><li>Lee, K. Y., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+tissue+engineering.">Hydrogels for tissue engineering.</a> Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1879 (2001).</li><li>Halib, N., Ahmad, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanocellulose:+Insight+into+health+and+medical+applications.">Nanocellulose: Insight into health and medical applications.</a> Handbook of Ecomaterials. , 1345-1363 (2019).</li><li>Alonso-Lerma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+performance+crystalline+nanocellulose+using+an+ancestral+endoglucanase.">High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase.</a> Communications Materials. 1 (1), 57 (2020).</li><li>Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+of+nanocellulose-reinforced+PVA+hydrogel+with+human+corneal+epithelial+cells+for+ophthalmic+applications.">Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications.</a> Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35 (2019).</li><li>Fey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+nanocellulose+as+novel+carrier+for+intestinal+epithelial+cells+in+drug+delivery+studies.">Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies.</a> Materials Science and Engineering: C. 109, 110613 (2020).</li><li>Ojansivu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wood-based+nanocellulose+and+bioactive+glass+modified+gelatin-alginate+bioinks+for+3D+bioprinting+of+bone+cells.">Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells.</a> Biofabrication. 11 (3), 035010 (2019).</li><li>Jonsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+networks+on+nanocellulose+scaffolds.">Neuronal networks on nanocellulose scaffolds.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).</li><li>Samulin Erdem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+nanocrystals+modulate+alveolar+macrophage+phenotype+and+phagocytic+function.">Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function.</a> Biomaterials. 203, 31-42 (2019).</li><li>Menas, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrillar+vs+crystalline+nanocellulose+pulmonary+epithelial+cell+responses:+Cytotoxicity+or+inflammation.">Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation.</a> Chemosphere. 171, 671-680 (2017).</li><li>Halova, I., Draberova, L., Draber, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+chemotaxis+chemoattractants+and+signaling+pathways.">Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways.</a> Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).</li><li>Groll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+definition+of+bioinks+and+their+distinction+from+biomaterial+inks.">A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks.</a> Biofabrication. 11 (1), 013001 (2019).</li><li>Schwab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printability+and+shape+fidelity+of+bioinks+in+3D+bioprinting.">Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting.</a> Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).</li><li>Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+molecular+design+criteria+for+3D+printable+hydrogels.">Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels.</a> Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).</li><li>Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+viable+and+non-viable+cells+using+propidium+iodide+in+two+color+immunofluorescence.">Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence.</a> Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).</li><li>Usov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+nanocellulose+chirality+and+structure-properties+relationship+at+the+single+fibril+level.">Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level.</a> Nature Communications. 6 (1), 7564 (2015).</li></ol>

Изготовление 3D-биомиметических тканей требует успешного объединения биочернила, который имитирует компоненты внеклеточного матрикса, с клеточным компонентом (компонентами) для создания физиологических аналогов тканей in vivo . Это обусловливает необходимость использования перви?...

Недавний интерес к системам 3D-культур и 3D-биопечати сосредоточил внимание на гидрогелях и гидрогелевых композитах. Эти композиты служат вязкими, но пористыми биомиметиками и могут состоять из содержания до 99% воды по массе, что сопоставимо с биологическими тканями1,2,3. Эти особенности гидрогелевых композитов, таким образом, позволяют расти клеткам, не влияя на их жизнеспособность и функцию. Одним из таких композитов является кристаллическая наноцеллюлоза (ЧПУ), которая использовалась в качестве армирующего материала в гидрогелевых композитах, клеточных каркасах при разработке имплантатов биоматериала, а также в двумерных (2D) и 3D in vitro клеточных культурах4,5. По большей части матрицы, состоящие из ЧПУ, не являются открыто цитотоксичными для эпителиальных клеток роговицы человека6, эпителиальных клеток кишечника7, мезенхимальных стволовых клеток человеческого костного мозга8 или нейроноподобных клеток9. Однако метаболическая активность и пролиферация мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга человека, снижается в корреляции с повышенной вязкостью древесных наноцеллюлозных композитов, что позволяет предположить, что состав матрицы должен быть тщательно проверен на предмет ее вредного воздействия на функции клеток8.
Аналогичным образом, ЧПУ может вызывать воспалительные реакции у макрофагов при интернализации, что может иметь серьезные последствия в системах 3D-культуры иммунных клеток10,11. На самом деле, существует очень мало данных о том, как ЧПУ может влиять на другие иммунные клеточные реакции, особенно аллергические воспалительные реакции, которые инициируются тучными клетками. Тучные клетки представляют собой гранулированные лейкоциты, которые экспрессируют высокоаффинный рецептор IgE, FceRI, ответственный за активацию воспалительных реакций на аллергены. Их пролиферация и дифференцировка зависят от фактора стволовых клеток (SCF), который связывает тирозиновый рецептор Kit. Тучные клетки получены из клеток-предшественников костного мозга, которые входят в кровообращение и впоследствии мигрируют периферически, чтобы повсеместно рассеяться во всех тканях человека12. Поскольку тучные клетки функционируют в 3D-тканевой среде, они являются идеальным кандидатом на иммунные клетки для изучения иммунологических процессов в 3D-моделях тканей in vitro. Однако на сегодняшний день не существует жизнеспособной 3D-модели ткани in vitro, содержащей тучные клетки.
Из-за высокочувствительной природы тучных клеток и их склонности вызывать провоспалительные реакции на внешние раздражители, требуется тщательное рассмотрение составляющих 3D-матрицы и метода биопечати введения тучных клеток в 3D-каркас, как обсуждается далее. Тканевые конструкции могут быть биофабрикцинированы из двух широких категорий биоматериалов, т.е. биочернил и чернил биоматериалов. Различие заключается в том, что биочернила представляют собой насыщенные клетками гидрогелевые композиты, тогда как чернила биоматериала представляют собой гидрогелевые композиты, которые лишены клеток, как определено Groll et al.13,14. Следовательно, 3D-конструкции, напечатанные с помощью биочернил, содержат клетки, предварительно встроенные в гидрогелевую матрицу, тогда как 3D-конструкции, напечатанные чернилами биоматериала, должны быть засеяны клетками после печати. Биофабрикация культивировочных каркасов из биочернил на основе гидрогеля / чернил биоматериала чаще всего выполняется с использованием экструзионных 3D-биопринтеров, которые выдавливают чернила биочернила / биоматериала через микромасштабное сопло под давлением через пневматический или механически управляемый поршень14. Экструзионные биопринтеры изготавливают 3D-каркасы, нанося биочернила в 2D-узоры поперечного сечения, которые последовательно укладываются друг на друга в подходе «снизу вверх».
Чтобы быть совместимыми с экструзионной биопечатью, чернила на основе биочернила/биоматериала на основе гидрогеля должны обладать тиксотропными (разбавляющими сдвиг) свойствами, в результате чего составляющие гидрогелевые полимеры биочернила/биоматериала текут как жидкость через микроканальное сопло при воздействии напряжения сдвига, но возвращаются в вязкое, гелеобразное состояние при снятии напряжения сдвига15 . Из-за высокого содержания воды полимеры биочернил / чернил биоматериала на основе гидрогеля должны быть сшиты, физически или ковалентно, для поддержания архитектуры и структурной целостности 3D-биопечатной структуры. В случае биочернил, нагруженных клетками, клетки непосредственно подвергаются химическим напряжениям во время процесса сшивания. Процесс экструзии клеток, инкапсулированных в гидрогелевую матрицу биочернила, также подвергает клетки стрессу сдвига, что может привести к снижению жизнеспособности и/или гибели клеток. После того, как 3D-модель ткани была биопечатана, трудно различить уровни цитотоксичности, вызванные самой гидрогелевой матрицей, и процессами экструзии и сшивки соответственно. Это особенно сложно в контексте 3D-каркасов, где клетки предварительно встроены в гидрогелевую матрицу, что затрудняет удаление клеток для последующих анализов, что нанесет ущерб жизнеспособности тучных клеток.
Более мягкий подход к созданию 3D-тканевых конструкций, содержащих тучные клетки, включает в себя посев клеток в предварительно напечатанные, пористые чернильные 3D-каркасы биоматериала из суспензии клеточной культуры, которая использует врожденную способность тучных клеток мигрировать из циркуляции в периферические ткани. Преимущества этого подхода к посеву клеток двояки: (i) тучные клетки не подвергаются сдвиговым и химическим нагрузкам в результате процессов экструзии и сшивки соответственно, и (ii) клетки могут быть легко удалены из 3D-каркаса после воздействия путем тщательной промывки для анализа без негативного влияния на их жизнеспособность. Дополнительным преимуществом посева и анализа жизнеспособности тучных клеток на 3D-биопечатных, пористых гидрогелевых каркасах в отличие от 2D-гидрогелевых дисков является то, что 3D-биопечатные гидрогелевые каркасы рекапитулируют микромасштабные топографические особенности тканей in vivo , которые не присутствуют в объемных, 2D-плоских гидрогелевых дисках. Этот подход является подходящим, быстрым и экономически эффективным подходом к определению потенциально катастрофических цитотоксических эффектов матриц гидрогеля биочернила на тучные клетки, а также на другие иммунологические клетки до инвестирования в дорогостоящие эксперименты по 3D-тканевой инженерии.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid (glacial)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AX0074-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose (OmniPur)</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2125-500GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-4888-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0632-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 24 Well Multidish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>930-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 96 Well Multidish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 175 cm2 Flask Vented</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130-191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet Class II</td>
			<td>Microzone Corp., Canada</td>
			<td>BK-2-6-B3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Fraction V (OmniPur)</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2930-100GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-1171-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge)</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>IK1020000303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mL</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>CL1010006001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>CSC0103000102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK HeartWare for PC</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>Version 2.4.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>S-10003-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>NZ4220005001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>NZ4250005001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>NZ4270005001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11465015001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Benchtop)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar&#160;96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Binder GmbH, Germany</td>
			<td>9040-0113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A00-1-1102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>44-390-7100GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5898-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12484028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Co. USA</td>
			<td>Version 10.6.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software, LLC</td>
			<td>Version 8.4.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15170-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Sodium Salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP410-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodonitrotetrazolium chloride (INT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I10406-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium L-lactate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2250-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes (1.7 mL clear)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes (2.0 mL clear)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZMQS60001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>725-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-3</td>
			<td>PeproTech, Inc.&#160;</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9913213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, 500 g</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP922I-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00D0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of a crystalline nanocellulose embedded agarose biomaterial ink for bone marrow-derived mast cell culture

Трехмерная (3D) биопечать использует композиты на основе гидрогеля (или чернила биоматериала), которые наносятся в виде рисунка, образуя субстрат, на который наносятся клетки. Поскольку многие чернила биоматериала могут быть потенциально цитотоксичными для первичных клеток, необходимо определить биосовместимость этих гидрогелевых композитов до их использования в дорогостоящих процессах 3D-тканевой инженерии. Некоторые методы 3D-культивирования, включая биопечать, требуют, чтобы клетки были встроены в 3D-матрицу, что затрудняет извлечение и анализ клеток на предмет изменений жизнеспособности и экспрессии биомаркеров без механического повреждения. Этот протокол описывает в качестве доказательства концепции метод оценки биосовместимости кристаллической наноцеллюлозы (ЧПУ), встроенного в агарозный композит, изготовленный в 24-луночную культуральную систему, с тучными клетками, полученными из костного мозга мыши (BMMCs), с использованием проточных цитометрических анализов жизнеспособности клеток и экспрессии биомаркеров.
После 18 ч воздействия матрицы ЧПУ/агарозы/D-маннитола жизнеспособность BMMC не изменялась по проницаемости йодида пропидия (PI). Однако БММК, культивируемые на субстрате ЧПУ/агарозы/D-маннитола , по-видимому, несколько увеличивают экспрессию высокоаффинного IgE-рецептора (FcεRI) и рецептора фактора стволовых клеток (Kit; CD117), хотя это, по-видимому, не зависит от количества ЧПУ в композите биочернила. Жизнеспособность BMMC также оценивалась после воздействия гидрогелевых каркасов, которые были изготовлены из коммерческих чернил биоматериала, состоящих из фибриллярной наноцеллюлозы (FNC) и альгината натрия с использованием 3D-экструзионного биопринтера. В течение 6-48 ч субстраты FNC/alginate не оказывали неблагоприятного влияния на жизнеспособность BMMCs, определяемую проточной цитометрией и анализами микротитров (XTT и лактатдегидрогеназа). Этот протокол описывает эффективный метод быстрого скрининга биохимической совместимости чернил-кандидатов для биоматериала на предмет их полезности в качестве 3D-каркасов для послепечатного посева тучными клетками.

Одной из наиболее важных характеристик успешной биоматериалной чернил или культурального субстрата является биосовместимость. Прежде всего, субстрат не должен вызывать клеточную гибель. Существует несколько микротитров и проточных цитометрических методов количественной оценки жи?...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture at JoVE.com

Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture

Этот протокол выделяет метод быстрой оценки биосовместимости кристаллической наноцеллюлозы (ЧПУ) / агарозных композитных гидрогелевых биоматериалных чернил с тучными клетками костного мозга мыши с точки зрения жизнеспособности клеток и фенотипической экспрессии рецепторов клеточной поверхности, Kit (CD117) и высокоаффинного рецептора IgE (FcεRI).

Изготовление кристаллических наноцеллюлозных встроенных чернил агарозного биоматериала для культуры тучных клеток, полученных из костного мозга

Three-dimensional (3D) bioprinting utilizes hydrogel-based composites (or biomaterial inks) that are deposited in a pattern, forming a substrate onto ...

Этот протокол предлагает простой и быстрый подход к скринингу чернил биоматериала-кандидата на потенциальные цитотоксические эффекты против чувствительных первичных и иммунных клеток до сложных экспериментов по 3D-биопечати. После инкубации иммунных клеток на конструкциях чернил биоматериала клетки могут быть легко извлечены из конструкций путем бережного промывания для выполнения последующего анализа цитотоксичности или биомаркеров. Этот протокол имеет непосредственное отношение к тканевой инженерии, в которой биопечатные ткани, предназначенные для трансплантации, должны быть построены из первичных клеток и биосовместимых чернил биоматериала.Для начала подготовьте картридж с биочернилами для установки на биопринтер INKREDIBLE+3D. Во-первых, снимите синие торцевые колпачки с трехмиллилитрового картриджа биоматериала и прикрепите стерильную коническую биопечатную насадку 22 калибра к концу замка Luer картриджа для биочернил. Подключите трубку подачи воздуха для печатающей головки one или PH1 к противоположному концу картриджа и вставьте картридж с прикрепленным коническим соплом для биопечати в вертикальный слот PH1.Затем плотно установите картридж в PH1 с коническим соплом для биопечати, простирающимся под печатающей головкой. Затяните винт на PH1 по часовой стрелке до тех пор, пока палец не затянется, чтобы зафиксировать картридж с биочернилами на месте. Обратите внимание, что 3D-биопечать может быть выполнена с PH2, оставленным пустым.Включите биопринтер и запустите программное обеспечение биопринтера на ПК, подключенном к 3D-биопринтеру через кабель USB 2.0. В программном обеспечении нажмите кнопку подключения, чтобы синхронизировать его с 3D-биопринтером. Наблюдайте за тремя опциями в главном меню управления 3D-биопринтера.Сначала подготовьте биопечать. Во-вторых, меню утилит. И в-третьих, экран состояния.Выберите параметр подготовки биопечати, затем прокрутите вниз до и выберите параметр домашних осей. После успешной калибровки осей XYZ высота печатного слоя немного уменьшится, а печатающие головки переместятся над центральной точкой печатного слоя. Чтобы приступить к калибровке начальной точки для биопечати в 24-луночных пластинах, снимите стерильную 24-луночную культуральную пластину с ее герметичной пластиковой упаковки и отметьте точку в центральной точке скважины D1 на нижней стороне пластины постоянным маркером.Снимите крышку пластины и поместите 24-луночную культуральную пластину на печатный слой с колодцем D1, расположенным в переднем левом углу печатного слоя. В главном меню управления выберите меню утилит и переместите ось. Перемещайте печатающие головки с шагом в один миллиметр вдоль осей X и Y до тех пор, пока коническое сопло биопечати PH1 не окажется непосредственно над точкой, отмеченной под скважиной D1. При необходимости точно настройте положение конической биопечатной насадки над точкой, перемещая печатающие головки с шагом 0,1 миллиметра.Запишите координаты X и Y конической биопечатной форсунки непосредственно над центром скважины D1, как указано на экране панели управления 3D-биопринтера, и отметьте координаты. Затем поднимите печатный слой с шагом в один миллиметр до тех пор, пока дно колодца D1 почти не коснется конической биопечатной насадки, установленной в печатающей головке. При необходимости выполните тонкую настройку движения печатного слоя с шагом 0,1 миллиметра.В меню утилит выберите параметр калибровки оси Z, а затем выберите и подтвердите параметр калибровки хранилища Z. Вернитесь в главное меню и выберите опцию подготовки биопечати. Прокрутите вниз до и выберите параметр калибровки Z.Обновите геометрический код 24-луночной пластины или G-код с правильными координатами начальной точки. Откройте предоставленный файл G-кода на 24 скважины в программном обеспечении для биопечати. Обновите координаты X и Y в первой строке со значениями, полученными на предыдущих шагах, и сохраните файл под новым именем.Убедитесь, что пневматический насос плотно подключен к заднему воздухозаборному порту биопринтера INKREDIBLE+3D, и включите его. Вытащите переднюю ручку управления, расположенную на правой стороне биопринтера INKREDIBLE+3D. Убедитесь, что цифровые манометры для PH1 и PH2, расположенные на передней панели биопринтера, считывают около нуля килопаскалей.Медленно поворачивайте переднюю ручку управления по часовой стрелке, пока давление, указанное на левом манометре для PH1, не достигнет 12 килопаскалей. Поместите сложенную папиросную бумагу или кусок водонепроницаемой уплотнительной пленки под сопло для печати установленного картриджа, стараясь не прикасаться к печатному соплу. В главном меню управления на 3D-биопринтере выберите подготовить биопечать.Перейдите к пункту и выберите Включить PH1. Обратите внимание, что биочернила начинают выдавливаться из печатного сопла. При необходимости увеличьте давление экструзии, вращая ручку управления по часовой стрелке до тех пор, пока биочернила не будут экструдированы в непрерывную нить, и запишите новую настройку давления.Выберите отключить PH1, чтобы остановить экструзию биочернил. Извлеките папиросную бумагу или пленку, содержащую экструдированные биочернила, с печатного слоя и закройте дверцу биопринтера. Для выполнения 3D-биопечати прямолинейных гидрогелевых подложек в формате пластины с 24 лунками выберите меню утилит из главного меню управления, затем выберите отключить SD-печать, которая позволит программному обеспечению биопринтера передавать файлы G-кода на 3D-биопринтер для печати.Нажмите на кнопку загрузки в программном обеспечении биопринтера и выберите обновленный файл G-кода пластины на 24 скважины. На правой панели управления в программном обеспечении выберите вкладку предварительного просмотра и нажмите кнопку печати, чтобы начать биопечать в скважине D1. По завершении биопечати прямолинейных конструкций накройте крышкой 24-луночную пластину и переместите ее в шкаф биобезопасности класса II. Погрузить каждую прямолинейную конструкцию в две капли стерильного 50-миллимолярного раствора кальция хлорида и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут.Осторожно аспирируйте раствор хлорида кальция из каждой конструкции скважины и промывайте один раз в один миллилитр 1X PBS, чтобы удалить избыток хлорида кальция. Чтобы предотвратить обезвоживание биопечатных гидрогелевых конструкций, поддерживайте 3D-биопечатные прямолинейные конструкции в свежем 1X PBS до тех пор, пока тучные клетки, полученные из костного мозга, не будут готовы к посеву на конструкции. На основе параметров прямого и бокового рассеяния БММК, проанализированных с помощью проточной цитометрии, было отмечено, что гидрогелевая субстрата с самой высокой концентрацией ЧПУ не изменяет нативный размер или гранулярность БММК по сравнению с БММК, культивируемыми в отсутствие гидрогелевых субстратов С ЧПУ агарозы D-маннитола.Проточный цитометрический анализ проницаемости BMMC для йодида пропидия показал, что ни одна из протестированных концентраций чпу не оказала какого-либо неблагоприятного влияния на жизнеспособность BMMC. Агарозный субстрат с ЧПУ увеличивал экспрессию биомаркеров тучных клеток при концентрациях ЧПУ более или равных 2,5%Однако уровни экспрессии этих рецепторов оставались относительно стабильными между 2,5% и 12,5% ЧПУ, что предполагает эффект, не зависящий от концентрации ЧПУ. Анализ XTT показал, что метаболическая активность BMMMc, культивируемых на 3D-биопечатных гидрогелевых каркасах, оставалась относительно стабильной примерно на 100% во всех проверенных временных точках.Аналогичным образом, анализы высвобождения LDH и исключения красителей PI не выявили существенных изменений в жизнеспособности BMMC. Тщательное внимание к выбору датчика печати сопла, калибровке осей 3D-биопринтера и настройке давления экструзии обеспечит воспроизводимую печать высококачественных 3D-конструкций. Легкость, с которой тучные клетки могут быть извлечены, позволяет исследовать их с помощью широкого спектра биологических анализов для дальнейшего изучения любого аспекта их клеточных функций.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

Microfabricated платформы для механическим динамическим культуре клеток

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

С памятью формы полимеров для активного культуры клеток

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Вращающийся культуре клеток системы по правам культуры клеток: Человеческие клетки трофобласта в качестве модели

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Шелковый Фильм культуры система В пробирке Анализ и Дизайн биоматериала

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

Изготовление функционализированного магнитной Бактериальный Nanocellulose с оксида железа наночастицами

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Characterization of Leukocyte-platelet Rich Fibrin, A Novel Biomaterial

Характеристика лейкоцитов тромбоцитов Rich фибрина, роман биоматериала

Autologous platelet concentrates represent promising innovative tools in the field of regenerative medicine and have been extensively used in oral ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Изготовление Перевернутый коллоидный кристалл поли (этиленгликоль) строительные леса: трехмерная Cell Culture платформа для печени тканевой инженерии

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Настраиваемый гидрогели от легочного внеклеточной матрицы для 3D клеточных культур

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Изготовление пользовательских агарозы скважин для заполнения клеток и тканей кольцо самостоятельной сборки с использованием 3D-печатные формы

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Большая площадь сканирования зонд нанолитографию способствовало автоматического выравнивания и его применение для изготовления подложки для изучения культуры клеток