Name: fabrication of a crystalline nanocellulose embedded agarose biomaterial ink for bone marrow-derived mast cell culture
Uploaded: 2021-05-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture at JoVE.com

Vi tackar Alberta Innovates för att ha tillhandahållit CNC och Ken Harris och Jae-Young Cho för deras tekniska råd när de förbereder CNC / agarose / D-mannitolmatrisen. Vi tackar också Ben Hoffman, Heather Winchell och Nicole Diamantides för deras tekniska råd och support med installation och kalibrering av INKREDIBLE+ 3D bioprinter.

OBS: Detta protokoll består av fem avsnitt: (1) isolering av musbensmärg och differentiering av musbens-härledda mastceller (BMMCs), (2) tillverkning av CNC/ agaros/D-mannitol hydrogel substrat i ett 24-brunnssystem och kultur av BMMCs på substrat, (3) avlägsnande av BMMCs från CNC/ agarose/D-mannitol hydrogel substrat och analys av livskraft och biomarkör uttryck, (3) avlägsnande av BMMCs från CNC / agarose / D-mannitol hydrogel substrat och analys av livskraft och biomarkör uttryck, (3) avlägsnande av BMMCs ...

<ol>
	<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Drury, J. L., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+tissue+engineering:+Scaffold+design+variables+and+applications.">Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications.</a> Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).</li><li>Lee, K. Y., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+tissue+engineering.">Hydrogels for tissue engineering.</a> Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1879 (2001).</li><li>Halib, N., Ahmad, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanocellulose:+Insight+into+health+and+medical+applications.">Nanocellulose: Insight into health and medical applications.</a> Handbook of Ecomaterials. , 1345-1363 (2019).</li><li>Alonso-Lerma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+performance+crystalline+nanocellulose+using+an+ancestral+endoglucanase.">High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase.</a> Communications Materials. 1 (1), 57 (2020).</li><li>Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+of+nanocellulose-reinforced+PVA+hydrogel+with+human+corneal+epithelial+cells+for+ophthalmic+applications.">Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications.</a> Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35 (2019).</li><li>Fey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+nanocellulose+as+novel+carrier+for+intestinal+epithelial+cells+in+drug+delivery+studies.">Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies.</a> Materials Science and Engineering: C. 109, 110613 (2020).</li><li>Ojansivu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wood-based+nanocellulose+and+bioactive+glass+modified+gelatin-alginate+bioinks+for+3D+bioprinting+of+bone+cells.">Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells.</a> Biofabrication. 11 (3), 035010 (2019).</li><li>Jonsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+networks+on+nanocellulose+scaffolds.">Neuronal networks on nanocellulose scaffolds.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).</li><li>Samulin Erdem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+nanocrystals+modulate+alveolar+macrophage+phenotype+and+phagocytic+function.">Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function.</a> Biomaterials. 203, 31-42 (2019).</li><li>Menas, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrillar+vs+crystalline+nanocellulose+pulmonary+epithelial+cell+responses:+Cytotoxicity+or+inflammation.">Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation.</a> Chemosphere. 171, 671-680 (2017).</li><li>Halova, I., Draberova, L., Draber, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+chemotaxis+chemoattractants+and+signaling+pathways.">Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways.</a> Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).</li><li>Groll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+definition+of+bioinks+and+their+distinction+from+biomaterial+inks.">A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks.</a> Biofabrication. 11 (1), 013001 (2019).</li><li>Schwab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printability+and+shape+fidelity+of+bioinks+in+3D+bioprinting.">Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting.</a> Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).</li><li>Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+molecular+design+criteria+for+3D+printable+hydrogels.">Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels.</a> Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).</li><li>Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+viable+and+non-viable+cells+using+propidium+iodide+in+two+color+immunofluorescence.">Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence.</a> Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).</li><li>Usov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+nanocellulose+chirality+and+structure-properties+relationship+at+the+single+fibril+level.">Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level.</a> Nature Communications. 6 (1), 7564 (2015).</li></ol>

Tillverkningen av 3D biomimetiska vävnader kräver en framgångsrik sammanslagning av bioink, som efterliknar komponenter i den extracellulära matrisen, med cellulära komponenter för att skapa fysiologiska analoger av in vivo vävnader. Detta kräver användning av primära celler, och inte omvandlade celler, vid tillverkning av fysiologiska biomimetiska vävnader. Primära immunologiska celler, såsom mastceller, är dock särskilt mottagliga för cytotoxiska effekter och fenotypiska förändringar som kan ...

Den senaste tidens intresse för 3D-odlingssystem och 3D-bioprinting har fokuserat uppmärksamheten på hydrogeler och hydrogelkompositer. Dessa kompositer fungerar som trögflytande men porösa biomimetika och kan bestå av upp till 99% vattenhalt i vikt, vilket är jämförbart med biologiska vävnader1,2,3. Dessa egenskaper hos hydrogelkompositer möjliggör därmed tillväxt av celler utan att påverka deras livskraft och funktion. En sådan komposit är kristallin nanocellulosa (CNC), som har använts som ett förstärkande material i hydrogelkompositer, cellställningar i utvecklingen av biomaterialimplantat och i tvådimensionell (2D) och 3D in vitro-cellkultur4,5. För det mesta är matriser som består av CNC inte alltför cytotoxiska för mänskliga hornhinnans epitelceller6, intestinala epitelceller7, humana benmärgsbaserade mesenkymala stamceller8 eller neuronliknande celler9. Metabolisk aktivitet och spridning av humana benmärg-härledda mesenkymala stamceller minskar dock i samband med ökad viskositet av träbaserade nanocellulosa kompositer, vilket tyder på att matrisens sammansättning noggrant måste testas för dess skadliga effekter på cellfunktioner8.
På samma sätt kan CNC inducera inflammatoriska svar i makrofager vid internalisering, vilket kan få allvarliga konsekvenser i 3D-immuncellskultursystem10,11. Faktum är att det finns mycket lite data tillgängliga om hur CNC kan påverka andra immuncellsvar, särskilt allergiska inflammatoriska svar som initieras av mastceller. Mastceller är granulerade leukocyter som uttrycker den hög affinitet IgE-receptorn, FceRI, som ansvarar för att aktivera inflammatoriska reaktioner på allergener. Deras spridning och differentiering är beroende av stamcellsfaktor (SCF), som binder tyrosinreceptorn, Kit. Mastceller härleds från benmärgsprogenitorceller som kommer in i cirkulationen och därefter migrerar perifert för att sprida sig allestädes närvarande i alla mänskliga vävnader12. Eftersom mastceller fungerar i en 3D-vävnadsmiljö är de en idealisk immuncellskandidat för att studera immunologiska processer i in vitro 3D-vävnadsmodeller. Hittills finns det dock ingen livskraftig in vitro 3D-vävnadsmodell som innehåller mastceller.
På grund av mastcellernas mycket känsliga natur och deras benägenhet att framkalla proinflammatoriska svar på yttre stimuli krävs noggrant övervägande av 3D-matrisbeståndsdelarna och bioprintningsmetoden för att införa mastceller i 3D-ställningen, som diskuterats vidare. Vävnadskonstruktioner kan biofabriceras från två breda kategorier av biomaterial, det vill säga biobläck och biomaterialfärger. Skillnaden ligger i det faktum att biobläck är cellbelastade hydrogelkompositer, medan biomaterialfärger är hydrogelkompositer som saknar celler, enligt definitionen i Groll et al.13,14. Därför innehåller 3D-konstruktioner tryckta med biobläck celler förinbäddade i hydrogelmatrisen, medan 3D-konstruktioner tryckta med biomaterialfärger måste sås med celler efter utskrift. Biofabriceringen av odlingsställningar från hydrogelbaserade biobläck/biomaterialfärger utförs oftast med hjälp av extruderings-3D-bioprinters, som extruderar biobläcket/biomaterialet genom ett mikroskalemunstycke under tryck via antingen en pneumatiskt eller mekaniskt driven kolv14. Extruderingsbioprinters tillverkar 3D-byggnadsställningar genom att deponera biobläcket i 2D-tvärsnittsmönster som är sekventiellt staplade på varandra i en "bottom-up" -metod.
För att vara kompatibel med extruderingsbioprinting måste det hydrogelbaserade biobläcket ha tixotropa (skjuvningsgallring), varigenom biobläckets ingående hydrogelpolymerer flödar som en vätska genom ett mikrokanalmunstycke när det utsätts för skjuvningsstress, men återgår till ett visköst, gelliknande tillstånd vid avlägsnande av skjuvspänningen15 . På grund av deras höga vattenhalt måste polymererna i hydrogelbaserade biobläck/biomaterialfärger korsas, antingen fysiskt eller kovalent, för att upprätthålla arkitekturen och den strukturella integriteten hos den biotryckta 3D-strukturen. När det gäller cellbelastade biobläck utsätts cellerna direkt för kemiska påfrestningar under tvärbindningsprocessen. Processen med extruderande celler inkapslade i bioink hydrogel matrisen utsätter också cellerna för skjuvning stress, vilket kan leda till minskad livskraft och/eller celldöd. När 3D-vävnadsmodellen har bioprintats är det svårt att skilja mellan nivåerna av cytotoxicitet som framkallas av hydrogelmatrisen själv respektive extruderings- respektive tvärbindningsprocesserna. Detta är särskilt utmanande i samband med 3D-ställningar där cellerna är förinbäddade i hydrogelmatrisen, vilket gör det svårt att ta bort cellerna för efterföljande analyser, vilket skulle vara skadligt för mastcellernas livskraft.
Ett skonsammare tillvägagångssätt för att generera 3D-vävnadskonstruktioner som innehåller mastceller innebär att cellerna sås till förtryckta, porösa biomaterialbläck 3D-byggnadsställningar från en cellodlingsfjädring, vilket utnyttjar mastcellernas medfödda förmåga att migrera från cirkulationen till perifera vävnader. Fördelarna med denna cellsåddsmetod är tvåfaldiga: i) mastcellerna inte utsätts för skjuvning och kemiska påfrestningar från extruderings- respektive tvärbindningsprocesserna, och ii) cellerna kan lätt avlägsnas från 3D-ställningen efter exponering genom skonsam tvättning för analys utan att deras livskraft påverkas negativt. Den ytterligare fördelen med sådd och analys av cell livskraften hos mastceller på 3D bioprintade, porösa hydrogelställningar i motsats till 2D-hydrogelskivor är att 3D bioprintade hydrogelställningar rekapitulerar mikroskala topografiska egenskaper hos in vivo-vävnader , som inte finns i bulk, 2D planar hydrogelskivor. Detta tillvägagångssätt är ett lämpligt, snabbt och kostnadseffektivt tillvägagångssätt för att bestämma de potentiellt katastrofala cytotoxiska effekterna av kandidat bioink hydrogel matriser på mastceller, liksom andra immunologiska celler, före investeringar i kostsamma 3D vävnadstekniska experiment.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid (glacial)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AX0074-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose (OmniPur)</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2125-500GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-4888-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0632-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 24 Well Multidish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>930-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 96 Well Multidish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 175 cm2 Flask Vented</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130-191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet Class II</td>
			<td>Microzone Corp., Canada</td>
			<td>BK-2-6-B3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Fraction V (OmniPur)</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2930-100GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-1171-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge)</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>IK1020000303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mL</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>CL1010006001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>CSC0103000102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK HeartWare for PC</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>Version 2.4.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>S-10003-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>NZ4220005001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>NZ4250005001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G</td>
			<td>CELLINK LLC</td>
			<td>NZ4270005001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11465015001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Benchtop)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar&#160;96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Binder GmbH, Germany</td>
			<td>9040-0113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A00-1-1102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>44-390-7100GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5898-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12484028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Co. USA</td>
			<td>Version 10.6.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software, LLC</td>
			<td>Version 8.4.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15170-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Sodium Salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP410-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodonitrotetrazolium chloride (INT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I10406-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium L-lactate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2250-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes (1.7 mL clear)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes (2.0 mL clear)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZMQS60001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>566-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>725-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-3</td>
			<td>PeproTech, Inc.&#160;</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9913213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, 500 g</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP922I-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00D0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of a crystalline nanocellulose embedded agarose biomaterial ink for bone marrow-derived mast cell culture

Tredimensionell (3D) bioprinting använder hydrogelbaserade kompositer (eller biomaterialfärger) som deponeras i ett mönster och bildar ett substrat på vilket celler deponeras. Eftersom många biomaterialfärger kan vara potentiellt cytotoxiska för primärceller, är det nödvändigt att bestämma biokompatibiliteten hos dessa hydrogelkompositer innan de används i kostsamma 3D-vävnadsteknikprocesser. Vissa 3D-odlingsmetoder, inklusive bioprinting, kräver att celler bäddas in i en 3D-matris, vilket gör det svårt att extrahera och analysera cellerna för förändringar i livskraft och biomarköruttryck utan att framkalla mekanisk skada. Detta protokoll beskriver som proof of concept, en metod för att bedöma biokompatibiliteten hos en kristallin nanocellulosa (CNC) inbäddad agaroskomposit, tillverkad i ett 24-brunnskultursystem, med musbensmärgbaserade mastceller (BMMCs) med hjälp av flödescytometriska analyser för cellviabilitet och biomarköruttryck.
Efter 18 h exponering för CNC/agarose/D-mannitol matrisen, BMMC livskraft var oförändrad mätt med propidium jodid (PI) permeabilitet. BMMCs odlade på CNC/ agarose/ D-mannitol substrat tycktes dock något öka sitt uttryck för hög affinitet IgE-receptorn (FcεRI) och stamcellsfaktorreceptorn (Kit; CD117), även om detta inte verkar vara beroende av mängden CNC i biobläckkompositen. BMMCs livskraft bedömdes också efter en tidskursexponering för hydrogelställningar som tillverkades av ett kommersiellt biomaterialbläck bestående av fibrillärt nanocellulosa (FNC) och natriumalginat med hjälp av en 3D-extruderingsbioprinter. Under en period av 6-48 h påverkade FNC/alginatsubstrat inte BMMC:s livskraft negativt enligt flödescytometri och mikrotiteranalyser (XTT och laktatdehydrogenas). Detta protokoll beskriver en effektiv metod för att snabbt screena den biokemiska kompatibiliteten hos kandidat biomaterialfärger för deras användbarhet som 3D-byggnadsställningar för eftertryck sådd med mastceller.

En av de viktigaste egenskaperna hos ett framgångsrikt biomaterialbläck eller odlingssubstrat är biokompatibilitet. I första hand får substratet inte inducera cellulär död. Det finns flera mikrotiterbaserade och flödescytometriska metoder för kvantifiering av cellens livskraft och nekros; Dessa metoder är dock inte mottagliga för att analysera celler som är inbäddade i en hydrogelmatris. I detta protokoll kringgås ovannämnda begränsning genom sådd av BMMCs på hydrogelsubstratet eller den biotryckta stä...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture at JoVE.com

Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture

Detta protokoll belyser en metod för att snabbt bedöma biokompatibiliteten hos en kristallin nanocellulosa (CNC)/agaroskomposit hydrogel biomaterial bläck med mus benmärg-härledda mastceller när det gäller cell livskraft och fenotypiska uttryck av cellytan receptorer, Kit (CD117) och hög affinitet IgE receptor (FcεRI).

Tillverkning av en kristallin nanocellulosa inbäddad agarose biomaterialbläck för benmärgsbaserad mastcellskultur

Three-dimensional (3D) bioprinting utilizes hydrogel-based composites (or biomaterial inks) that are deposited in a pattern, forming a substrate onto ...

Detta protokoll erbjuder ett enkelt och snabbt tillvägagångssätt för screen kandidat biomaterial bläck för potentiella cytotoxiska effekter mot känsliga primära och immunceller före komplexa 3D bioprinting experiment. Efter inkubation av immuncellerna på biomaterialbläckkonstruktionerna kan cellerna enkelt hämtas från konstruktionerna genom skonsam tvättning för att utföra cytotoxicitets- eller biomarköranalyser nedströms. Detta protokoll är direkt relevant för vävnadsteknik där biotryckta vävnader som är avsedda för transplantation måste konstrueras av primärceller och biokompatibla biomaterialfärger.Till att börja med förbereder du en biobläckpatron för installation på INKREDIBLE+3D-bioprintern. Ta först bort de blå ändlocken från den tre milliliter biomaterialbläckpatronen och fäst ett sterilt koniskt bioprintmunstycke med 22 gauge på Luer-låsänden på biobläckpatronen. Anslut lufttrycksrören för skrivhuvud ett eller PH1 till motsatt ände av patronen och sätt in patronen med dess bifogade koniska bioprintmunstycke i den vertikala öppningen på PH1.Placera sedan patronen ordentligt i PH1 med ett koniskt bioprintmunstycke som sträcker sig under skrivhuvudet. Dra åt skruven på PH1 medurs tills fingret sitter tätt för att låsa biobläckpatronen på plats. Observera att 3D-bioprintingen kan utföras med PH2 tom.Slå på bioprintern och starta bioprinterprogramvaran på en dator som är ansluten till 3D-bioprintern via en USB 2.0-kabel. I programvaran klickar du på anslutningsknappen för att synkronisera den med 3D-bioprintern. Observera tre alternativ i huvudkontrollmenyn på 3D-bioprintern.Förbered först bioprint. För det andra, verktygsmenyn. Och för det tredje, statusskärmen.Välj alternativet förbered bioprint och bläddra sedan nedåt till och välj alternativet hemaxlar. Efter lyckad kalibrering av XYZ-axlarna sänks utskriftsbäddens höjd något och skrivarhuvudena flyttas till ovanför utskriftsbäddens mittpunkt. För att fortsätta med startpunktskalibreringen för bioprinting i 24-brunnsplattor, ta bort en steril 24-välsodlingsplatta från dess förseglade plastfolie och markera en punkt på mitten av brunn D1 på undersidan av plattan med en permanent markör.Ta bort plåtskyddet och placera 24-brunnsodlingsplattan på tryckbädden med väl D1 placerad längst fram till vänster i tryckbädden. Välj verktygsmenyn på huvudkontrollmenyn och flytta sedan axeln. Flytta skrivarhuvudena i steg om en millimeter längs X- och Y-axlarna tills ph1:s koniska bioprintmunstycke är direkt över pricken som är markerad under brunnen D1. Finjustera vid behov positionen för det koniska bioprintingmunstycket över pricken genom att flytta skrivarhuvudena i steg om 0,1 millimeter.Registrera X- och Y-koordinaterna för det koniska bioprintingmunstycket direkt över mitten av brunnen D1 enligt 3D-bioprinterns kontrollpanelskärm och markera koordinaterna. Höj sedan utskriftsbädden i steg om en millimeter tills botten av brunnen D1 nästan vidrör det koniska bioprintingmunstycket som är installerat i skrivhuvud ett. Finjustera utskriftsbäddens rörelse i steg om 0,1 millimeter om det behövs.Välj kalibreringsalternativet Z-axeln på verktygsmenyn och välj och bekräfta kalibreringsalternativet för butiken Z ytterligare. Gå tillbaka till huvudmenyn och välj alternativet förbered bioprint. Rulla nedåt till och välj alternativet kalibrera Z.Uppdatera den geometriska koden för 24-brunnsplattan eller G-koden med rätt startpunktskoordinater. Öppna den medföljande 24-brunns G-kodfilen på bioprintprogramvaran. Uppdatera X- och Y-koordinaterna på rad ett med de värden som erhållits i tidigare steg och spara filen under ett nytt namn.Se till att den pneumatiska pumpen är ordentligt ansluten till den bakre luftintagsporten på INKREDIBLE+3D-bioprintern och slå på den. Dra ut den främre styrknappen på höger sida av INKREDIBLE+3D-bioprintern. Se till att de digitala tryckmätare för PH1 och PH2 som finns på bioprinterns framsida avläste var och en nära noll kilopascal.Vrid långsamt den främre kontrollratten medurs tills trycket som anges på den vänstra mätaren för PH1 når 12 kilopascals. Placera ett vikt vävnadspapper eller en bit vattentät tätningsfilm under den installerade patronens utskriftsmunstycke, var försiktig så att du inte rör utskriftsmunstycket. Välj förbered bioprint på huvudkontrollmenyn på 3D-bioprintern.Navigera till och välj aktivera PH1. Observera att biobläcket börjar extrudera från utskriftsmunstycket. Öka vid behov extruderingstrycket genom att vrida kontrollvredet medurs tills biobläcket extruderas i en kontinuerlig glödtråd och registrera den nya tryckinställningen.Välj Stäng av PH1 för att stoppa extrudering av biobläcket. Ta bort silkespapper eller film som innehåller det extruderade biobläcket från tryckbädden och stäng bioprinterdörren. För att utföra 3D-bioprinting av rätlinjära hydrogelsubstrat i ett 24-brunnsplåtformat, välj verktygsmenyn från huvudkontrollmenyn och välj sedan inaktivera SD-utskrift som gör det möjligt för bioprinterprogramvaran att överföra G-kodfiler till 3D-bioprintern för utskrift.Klicka på laddningsknappen i bioprinter-programvaran och välj den uppdaterade 24-brunnsplattan G-kodfil. På den högra kontrollpanelen i programvaran väljer du fliken förhandsgranskning och klickar på utskriftsknappen för att påbörja bioprinting i brunn D1. När bioprintningen av de rätlinjiga konstruktionerna är klar, täck 24-brunnsplattan med locket och flytta den till ett klass II-biosäkerhetsskåp. Sänk ned varje rätlinjiga konstruktion i två droppar steril 50 millimolar kalciumkloridlösning och inkubera vid rumstemperatur i fem minuter.Aspirera försiktigt kalciumkloridlösningen från varje brunn konstruera och skölj en gång i en milliliter av 1X PBS för att avlägsna överskott av kalciumklorid. För att förhindra uttorkning av de bioprintade hydrogelkonstruktionerna, behåll de biotryckta rätlinliniska konstruktionerna i färsk 1X PBS tills de benmärgsbaserade mastcellerna är redo att sås på konstruktionerna. Baserat på de främre och sidospridningsparametrarna för BMMCs analyserade av flödescytometri observerades det att hydrogelsubstratet med den högsta CNC-koncentrationen inte ändrade BMMCs ursprungliga storlek eller granularitet jämfört med BMMCs odlade i avsaknad av CNC-agaros D-mannitol hydrogelsubstrat.Flöde cytometrisk analys av BMMCs permeabilitet till propidium jodid visade att ingen av de CNC-koncentrationer som testades framkallade någon negativ effekt på BMMC livskraft. CNC-agarossubstratet ökade uttrycket av mastcellsbiomarkörerna vid CNC-koncentrationer större än eller lika med 2,5%Men uttrycksnivåerna för dessa receptorer förblev relativt konsekventa mellan 2,5% och 12,5%CNC vilket tyder på en effekt som är oberoende av koncentrationen av CNC. XTT-analysen visade att den metaboliska aktiviteten hos BMMCs odlade på 3D bioprinted hydrogelställningar förblev relativt konsekventa på cirka 100%över alla testade tidspunkter.På samma sätt visade LDH-utgåvan och PI-färguteslutningsanalyserna inga betydande förändringar i BMMCs lönsamhet. Den lätthet med vilken mastcellerna kan hämtas gör det möjligt för dem att undersökas av ett brett spektrum av biologiska analyser för att ytterligare studera någon aspekt av deras cellulära funktioner.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

Mikrofabricerade Plattformar för Mekaniskt Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Shape Memory Polymers för Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Roterande Cell Culture System för mänskliga Cell Culture: Mänskliga trofoblasten Celler som modell

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk Film Kultur System för In vitro Analys och Biomaterial design

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

Tillverkning av en funktionaliserad Magnetic bakteriell Nanocellulosa med järnoxid nanopartiklar

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Characterization of Leukocyte-platelet Rich Fibrin, A Novel Biomaterial

Karakterisering av leukocyt-blodplättrik Fibrin, A Novel Biomaterial

Autologous platelet concentrates represent promising innovative tools in the field of regenerative medicine and have been extensively used in oral ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Tillverkning av Inverted kolloidalt Crystal Poly (etylenglykol) Scaffold: En tredimensionell cellkultur plattform för levervävnad Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Avstämbar Hydrogeler från Lung Extracellulär Matrix för 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Tillverkning av anpassade agaros brunnar för Cell sådd och vävnad Ring självmontering med 3D-tryckt formar

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...