Name: artificial intelligence approaches to assessing primary cilia
Uploaded: 2021-05-01T14:00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases R01 DK114008 til NFB og American Heart Association Fellowship Grant #18PRE34020122 til RB. Vi takker Rich Gruskin General Manager for Nikon Software, Melissa Bentley, Courtney Haycraft og Teresa Mastracci for indsigtsfulde kommentarer til manuskriptet.

1. Erhverve rå billeder
<ol><li>Fix og immunlabel prøver efter behov20.<ol>
<li>Billede cilia ved hjælp af en konfokal mikroskop på maksimal bit dybde ved hjælp af den samme pixel størrelse med Nyquist opløsning.</li>
		<li>Eksporter billeder som .tif-filer (monokromt billedformat). BEMÆRK: Denne protokol skitserer, hvordan du bruger Ai-modulet specifikt i NIS Elements-software. Hvis billeder blev anskaffet som .nd2-filer, er det ikke nødvendigt at eksportere billeder som .tif filer, og brugeren kan gå direkte til trin 2.3. Hvis billeder blev anskaffet på et andet system, kan en NIS Elements-licens købes separat, og .tif filer kan konverteres som beskrevet i de næste trin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Træn Ai for at identificere cilier
<ol><li>Åbn træningsdatasættet.<ol>
<li>Vælg ca. 50 eksempelbilleder med mindst étcilium pr. ramme for at træne softwaren og kopiere dem i en enkelt mappe. Denne mappe bruges til at styre softwaren, når du åbner billederne. Åbn disse 50 rammer i et enkelt ND2-dokument med mindst étcilium pr. billede. Vælg Fil > Importer/eksporter > Opret ND-fil fra filsekvens.</li>
		<li>Vælg den mappe, der indeholder træningsdatasættet. Dette åbner listen over filer i midten af dialogvinduet. Definer manuelt organiseringen af filerne ved hjælp af mindst én indstilling i rullemenuen ovenfor. Indstillingerne er multipoint (for flere maksimale projektion filer), Z-serien (for en z stack billede), tid (for en time-lapse billede), og bølgelængde (for filer fra flere kanaler).</li>
		<li>Angiv de tilsvarende numeriske værdier under hver valgt indstilling. Vælg Ingen, hvor indstillingerne ikke er markeret. Klik på Konverter for at åbne ND-dokumentet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kalibrer billeder.<ol>
<li>Angiv pixelstørrelsen i nederste venstre hjørne af billedet: Højreklik på Ikke-kalibreret > Kalibrer dokument > Pixelstørrelse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identificer cilier.<ol>
<li>Håndidentificer cilieren ved præcist at spore individuelle ciliarystrukturer på alle de åbnede rammer ved hjælp af enten AutoDetect eller Draw Object på den binære værktøjslinje. Dette vil trække binære masker på objekter af interesse. Disse binære filer vil tjene som eksempelobjekter til træning af softwaren til at identificere cilier om pixelbaserede egenskaber i fremtidig eksperimentel billedanalyse. Vælg Vis > analysekontrolelementer > binær værktøjslinje > tegneobjekt. BEMÆRK: Fjern enhver ramme, der ikke har nogen binære filer, da softwaren ikke vil begynde at træne, medmindre den er i stand til at registrere binære filer på alle de åbnede rammer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Træn ai.<ol>
<li>Begynd at træne softwaren. Dette vil åbne toget Segment.ai boks. Vælg NIS.ai > Train Segment.ai.</li>
		<li>Vælg den kildekanal, der skal bruges til træning, i feltet Tog Segment.ai. Hvis filer fra flere kanaler er åbne, skal du kun vælge én kanal som kildekanal. Vælg derefter de relevante jord sandhed binære filer til at træne Ai. Endelig vælge antallet af iterationer er nødvendige for at træne Ai afhængigt af størrelsen og fordelingen af binære filer. BEMÆRK: Hvis binære filer let kan detekteres fra omgivelserne og er godt fordelt i hele billedet, kan softwaren have brug for mindre end 1000 gentagelser for at blive uddannet til at identificere billederne. Hvis billederne har et lavt signal-til-støj-forhold, er det ideelt at køre mindst 1000 gentagelser under træning for at gøre det muligt for Ai at identificere cilier i testprøver med høj tillid.</li>
		<li>Vælg destinationsmappen for at gemme den uddannede Ai-fil (.sai), og klik på Træn for at træne softwaren. Softwaren vil nu fortsætte med at træne sig selv for at identificere cilier baseret på de sporede binære filer. Denne proces tager flere timer. BEMÆRK: Når du træner, viser softwaren en graf, der viser træningstab. Grafen vil i første omgang vise en spike før tilspidsning til ideelt omkring 1% tab, hvor det plateauer for resten af uddannelsen. Gem grafen som fremtidig reference ved at markere afkrydsningsfeltet Gem graf screenshot på toget Segment.ai boksen (Supplerende figur 1).</li>
		<li>Hvis yderligere raffinement til uddannelsen er påkrævet, derefter fortsætte uddannelsen på samme datasæt. Alternativt kan du træne på et nyt datasæt med nøjagtig de samme parametre. Det er ikke tilrådeligt at træne en allerede uddannet Ai på et nyt datasæt med forskellige parametre eller forskellige genstande af interesse. Vælg Segment.ai > Fortsæt træningen på > Vælg uddannet ai-fil.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Identificer cilier ved hjælp af uddannet Ai
<ol><li>Åbn det eksperimentelle datasæt.<ol>
<li>Åbn de eksperimentelle confocal billeder af cilier i softwaren ved at konvertere prøven .tif filer til .nd2 filer, svarende til trin 2.1. Vælg Fil > Importer/eksporter > Opret ND-fil fra filsekvens. BEMÆRK: Billederne skal være af samme pixelstørrelse som dem, der bruges til træning af Ai. Hvis billederne allerede er i ND2-format, skal du gå til trin 3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kalibrer billeder.<ol>
<li>Angiv pixelstørrelsen i nederste venstre hjørne af billedet. Højreklik på Ikke-kalibreret > Kalibrer dokument > pixelstørrelse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kør den trænede Ai på de åbnede filer.<ol>
<li>Begynd at identificere cilier ved hjælp af Ai. Softwaren vil nu trække binære filer på cilier baseret på den uddannelse, den modtog i det foregående trin. Denne proces vil tage et par sekunder. Vælg NIS.ai > Segment.ai. BEMÆRK: Softwaren vil bede om at vælge kanalen, hvis flere kanaler er åbne. Kanaler er opført ved deres respektive navne her. Hvis ikke, markeres feltet med navnet 'Mono' automatisk.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tjek billeder for fejlidentificerede binære filer.<ol>
<li>Når Ai har identificeret cilier og tegnede binære filer, skal du kontrollere billederne for eventuelle fejlagtigt identificerede objekter. Hvis det ønskes, skal du manuelt slette fejlidentificerede binære filer. Vælg Vis > analysekontrolelementer > binær værktøjslinje > Slet objekt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Måling af cilier længde og intensitet
<ol><li>Opret en ny generel analyse 3 (GA3) opskrift.<ol>
<li>Nu, hvor cilier er blevet identificeret og segmenteret, fortsætte med at analysere forskellige parametre for cilier såsom længder og intensiteter ved hjælp af GA3 værktøj. Dette åbner et nyt vindue med et tomt mellemrum i midten, hvor analysen defineres. Vælg Billede > ny GA3-opskrift. 
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vælg de binære filer, der skal analyseres.<ol>
<li>Da cilier allerede er segmenteret ved hjælp af Segment.ai, vil GA3 automatisk registrere de binære filer korrekt mærket i henhold til Ai og omfatte noden. Vælg'Binære filer > automatisk Detect_AI' eller 'Binære filer > Tegn Object_AI'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vælg de kanaler, der kræves til analyse. GA3 registrerer også automatisk kanalerne på billederne og viser deres faner under Kanaler.</li>
	<li>Fjern objekter, der rører rammens kant.<ol>
<li>Da Ai vil segmentere alle cilier som objekter i rammen, vil det også opdage ufuldstændige cilier langs kanterne af rammen. Disse objekter kan enten fjernes manuelt i trin 3.4, eller de kan fjernes automatisk i GA3. Vælg Binær behandling > Fjerne objekter > Berøring af kanter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vælg parametre, der skal måles cilia.<ol>
<li>Træk og slip parametrene for atmåle,f.eks. Forbind noderne med den relevante binære node (forbindelse A) og kanalnoder (forbindelse B). Hold markøren over nodeforbindelsen for et værktøjstip for at vise, hvilken forbindelse noden tilhører. Vælg Måling > objektstørrelse > længde og måling > objektintensitet > Sum Obj-intensitet. BEMÆRK: Noden Længde opretter kun forbindelse til den binære node, mens Sum Obj Intensity opretter forbindelse til både den binære og kanalnoder.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tilføj målingerne i en enkelt tabel.<ol>
<li>Kombiner alle målingerne i en enkelt outputtabel ved at trække og slippe noden Tilføj kolonne til analyseplandiagrammet, og forbind den med målenoder, Længde og Sum Obj Intensity. Vælg datastyring > basic > tilføj kolonne.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mål cilier.<ol>
<li>Mål cilier ved at klikke på Kør. Denne proces tager et par øjeblikke at måle alle de cilier i de eksperimentelle billeder. Længderne og intensiteterne vises i et nyt vindue analyseresultater. BEMÆRK: Tabellen kan undertiden indeholde data fra masker, som Ai genkendte som cilier, men som var for små til at blive opdaget af det menneskelige øje og elimineret i trin 3.4. Disse objekter kan fjernes fra datasættet ved hjælp af et filter før statistisk analyse. Her blev der anvendt et filter på 1 μm til in vitro cilia-længdemålinger i figur 2 og 2 μm for in vivo cilia. Dette kan gøres, før du eksporterer data ved hjælp af nedenstående vej. Vinduet Analyseresultater > Definer filter > Angiv værdi > brugsfilter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eksporter data til statistisk analyse.</li>
</ol>5. Colocalization undersøgelser
BEMÆRK: Colocalization analyse kan indgå i den samme GA3 opskrift, der anvendes til målinger af cilier længde og intensitet analyse. Hvis du bruger den samme opskrift, skal du åbne filer som beskrevet nedenfor og måle længder og intensiteter af begge kanaler sammen med colocalization-koefficienterne i samme analysepipeline.
<ol><li>Åbn det eksperimentelle datasæt.<ol>
<li>Åbn de eksperimentelle confocal billeder af cilier i softwaren ved at konvertere prøven .tif filer til .nd2 filer. Vælg Fil > Importer/eksporter > Opret ND-fil fra filsekvens.</li>
		<li>I pop op-vinduet skal du vælge de 16-bit dybde monokrome filer fra alle kanaler af interesse fra vinduesstifinderen, der er placeret i den første kolonne i pop op-vinduet. Vælg Multipoint- eller Z-serie i den første rullemenu, og angiv en værdi, der svarer til det samlede antal billeder eller stakke.</li>
		<li>Vælg Bølgelængde i den anden rulleliste, og skift værdien til det samlede antal kanaler i mappen. Softwaren låser automatisk op for et Wavelength-valgvindue, der er placeret nederst til højre i pop op-vinduet. Brug rullemenuen Farve til at vælge farven på hver kanal. Giv hver kanal et andet navn under kolonnen Navn. Når alle oplysninger er opdateret, skal du klikke på Konverter. Softwaren genererer automatisk en Alle billedfil overlejret med alle de enkelte billeder fra alle de valgte kanaler.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalibrer billeder.<ol>
<li>Angiv pixelstørrelsen i nederste venstre hjørne af billedet. Højreklik på Ikke-kalibreret > Kalibrer dokument > pixelstørrelse.</li>
	</ol></li>
	<li>Kør den trænede Ai på den første kanal.<ol>
<li>Begynd at identificere cilier på en af de åbne kanaler (f.eks ACIII; Figur 5A) ved hjælp af Ai. Softwaren vil nu trække binære filer på ACIII mærket cilier baseret på den uddannelse, den har modtaget for denne kanal. Denne proces vil tage et par sekunder. Vælg NIS.ai > Segment.ai > Kildekanaler > ACIII.</li>
	</ol></li>
	<li>Kør den trænede Ai på den anden kanal.<ol>
<li>Begynd at identificere cilier på den anden åbnede kanal (f.eks MCHR1; Figur 5B) ved hjælp af Ai. Softwaren vil nu trække binære filer på MCHR1 mærket cilier baseret på den uddannelse, den har modtaget for denne kanal. Denne proces vil tage et øjeblik. Vælg NIS.ai > Segment.ai > Kildekanaler > MCHR1.</li>
	</ol></li>
	<li>Tjek billeder for fejlidentificerede binære filer.<ol>
<li>Når Ai har identificeret cilier og tegnede binære filer, skal du kontrollere billederne for eventuelle fejlidentificerede objekter. Slet eventuelle fejlidentificerede binære filer manuelt, hvis det er nødvendigt. Vælg Vis > analysekontrolelementer > binær værktøjslinje > Slet objekt.
</li>
	</ol></li>
	<li>Opret ny GA3 opskrift.<ol>
<li>Nu, hvor cilia er blevet identificeret og segmenteret, gå videre til colocalization analyse ved hjælp af GA3 værktøj. Dette åbner et nyt vindue med et tomt mellemrum i midten, hvor analysen defineres. Der genereres et vindue med alle identificerede binære filer og kanaler. Kontroller, at alle ønskede kanaler og binære filer, der kræves til analyse, er til stede og valgt. Vælg Billede > ny GA3-opskrift.</li>
	</ol></li>
	<li>Fjern objekter, der rører rammens kant.<ol>
<li>Da Ai vil segmentere alle cilia-lignende objekter i rammen, vil det også opdage ufuldstændige cilier langs rammens kanter. Disse objekter kan enten fjernes manuelt i trin 5.5, eller de kan fjernes automatisk i GA3. Vælg Binær behandling > Fjerne objekter > Berøring af kanter.
</li>
	</ol></li>
	<li>Konfigurer colocalization-stien i GA3.<ol>
<li>Hvis du vil måle overlapningen af de to kanaler i cilier, skal du bruge Manders koefficientkorrelation. Træk og slip Manders Koefficient noden i det tomme rum i GA3 opskrift og forbinde den til de relevante binære og kanaler. Her forbinder 'forbindelse A' med ACIII binære, 'forbindelse B' med MCHR1-kanalen og 'forbindelse C' med ACIII-kanalen for at bestemme overlapningen af MCHR1 inden for ACIII-binær. Vælg måling > objektforholdsmetri > Manders-koefficient. BEMÆRK: Softwaren giver mulighed for at måle colocalization ved hjælp af Pearson Coefficient Korrelation ved hjælp af de samme trin som beskrevet i denne protokol40.</li>
	</ol></li>
	<li>Tilføj målingerne i en enkelt tabel.<ol>
<li>Kombiner alle målingerne i en enkelt outputtabel. Vælg datastyring > basic > tilføj kolonne.</li>
	</ol></li>
	<li>Mål colocalization.<ol>
<li>Mål cilier ved at klikke på Kør. Denne proces tager et par øjeblikke at måle alle de cilier i de eksperimentelle billeder. Dataene vises i et nyt vindue til analyseresultater.</li>
	</ol></li>
	<li>Eksporter data til statistisk analyse.</li>
</ol>

Medforfatter Wesley Lewis er ansat i Nikon. Der er ingen finansielle oplysninger.

Længde- og intensitetsmålinger er almindelige måder, hvorpå primær cilier analyseres, men der er ikke en standardiseret konventionel metode, der anvendes i marken. Identifikation og kvantificering af primær cilier ved hjælp af software som ImageJ er tidskrævende og tilbøjelig til at brugeren bias og fejl. Dette gør det vanskeligt præcist at analysere store datasæt. Her viser vi, at ved hjælp af et Ai-program kan overvinde mange af disse udfordringer, der gør høj gennemløbsanalyse af primær cilier opnåelig. Heri beskriver vi proceduren for træning af et Ai-baseret program til at genkende primær cilier og skitsere de trin, der kræves for at analysere længde og intensitet.
Mens den indledende træning af Ai til at genkende cilier kræver betydelig tid fra brugeren, når den er afsluttet, kan den bruges på ethvert datasæt, der er erhvervet med de samme parametre. Den binære maske, der genereres af Ai, kan ændres, så eventuelle fejl kan rettes. Fejl i cilia-identifikationen skal dog signalere brugeren, at Ai'en skal trænes yderligere med yderligere billeder. En stor fordel ved denne metode er, at Ai kan trænes til at genkende cilier i forskellige prøvetyper i både 2D og 3D. Tidligere analysemetoder, der genereres i laboratorier, har forskelligebegrænsninger,herunder krav om manuel tærskelværdi for identifikation og problemer med at identificere cilier, der er afbildet fra vævssektioner, hvor celletætheden er høj36,46,47. Disse metoder er også specialiseret til cilia analyse, mens analyse ved hjælp af NIS Elements software kan evaluere flere aspekter af billederne samtidigt. Fordi Ai beskrevet her er en del af NIS Elements softwarepakke, billeder erhvervet ved hjælp af et Nikon mikroskop kan let fortsættes igennem til analyse. Billedbehandling med Nikon er dog ikke påkrævet for at bruge denne metode. Uanset det hentede raw datafilformat kan ".tif" filer åbnes af NIS Elements, der kan bruges i Ai.
Denne Ai-applikation inden for NIS Elements er bredt tilgængelig og muligvis allerede en del af billedanalysesoftware i brug af laboratorier, der studerer primær cilier. Med udbredelsen af Ai-teknologi ekspanderende, andre billedbehandling software kan udvide deres analysemuligheder til at omfatte en lignende Ai modul. Anvendelse ai analyse til cilier identifikation kan bruges til flere forskellige aspekter af cilier analyse. Mens vi skitserede metoder til nogle få enkle analyser som længde (figur 2 og 3), intensitet (Figur 4) og colocalization (Figur 5) mere sofistikeret analyse kan føjes til GA3 analyse workflow som i figur 6. I stedet for at måle intensiteten af et fuldstændigtcilium kan forskelle i intensitet inden for et underområde af etcilium f.eks. være af interesse i at vurdere sub-ciliary lokalisering. Forskelle i intensitet i en subregion af et cilium kan indikere, at proteinet akkumuleres ved spidsen eller bunden afciliet, såsom hvordan Gli-proteiner beriges ved spidsen af cilia48. Derudover kan denne Ai-applikation bruges til let at identificere forskelle mellem genotyper eller behandlingsgrupper. Mens vores laboratorium primært bruger denne metode til at analysere cilia afbildet fra hjerne sektioner eller neuronale kulturer, det kan anvendes til billeder erhvervet fra forskellige cellelinjer eller andre vævstyper. Den fleksibilitet af prøvetype, som denne applikation kan anvendes på, gør denne analysemetode værdifuld for mange forskellige grupper, der studerer primær cilier eller enhver diskret organelle, der vurderes, såsom mitokondrier, kerne eller ER.

Primære cilia er sensoriske organeller, der stikker ud fra de fleste pattedyrscelletyper1,2,3,4. De er generelt ensomme vedhæng, der er afgørende for koordinering af forskellige cellesignaleringsveje ved at integrere ekstracellulære signaler5,6,7. Primær cilier spiller vigtige roller under embryonal udvikling og voksen væv homøostase, og afbrydelse af deres funktion eller morfologi er forbundet med flere genetiske lidelser, som kollektivt kaldes ciliopatier. På grund af cilias næsten allestedsnærværende karakter er ciliopatier forbundet med en bred vifte af kliniske funktioner, der kan påvirke alle organsystemer8,9,10,11,12. I dyremodeller af ciliopatier manifesterer tab af ciliary-struktur eller signalkapacitet sig i flere klinisk relevante fænotyper, herunder hyperfagirelateret fedme3,13,14,15. I mange modelsystemer har ændringer i cilierlængden vist sig at påvirke deres signalkapacitet og funktioner16,17,18,19. Der er dog flere tidskrævende og tekniske udfordringer forbundet med nøjagtigt og reproducerbar vurdering af cilier længde og sammensætning.
Det voksne pattedyrs centralnervesystem (CNS) er en biologisk kontekst, der har udgjort en udfordring for at forstå cilia morfologi og funktion. Mens det ser ud til, at neuroner og celler i hele CNS besidder cilier, på grund af de begrænsede værktøjer og evner til at observere og analysere disse cilier en forståelse af deres funktioner forbliver undvigende20. For eksempel, den prototypiske cilia markør, acetyleret α-tubulin, ikke mærke neuronal cilia20. Vanskeligheden ved at studere disse cilier blev delvist løst med opdagelsen af flere G protein-koblede receptorer (GPCR), signalmaskiner og membran tilknyttede proteiner, der er beriget på membranen af neuronal cilia21,22. Alle disse enkle grundlæggende observationer antyder vigtigheden og mangfoldigheden af CNS-cilier, som hidtil synes uden sidestykke af andre væv. For eksempel kan variation i cilier længde og GPCR lokalisering observeres i hele hjernen, med længder i visse neuronale kerner er forskellige sammenlignet med andre kerner19,23. Tilsvarende viser deres GPCR-indhold og signalmaskiner kompliment mangfoldighed baseret på neuroanatomisk placering og neuronal type2,24,25,26,27,28,29. Disse enkle observationer viser, at pattedyr CNS cilia længde og sammensætning er stramt reguleret, ligesom i model organismer, som Chlamydomonas reinhardtii, men virkningen af disse længde forskelle på cilier funktion, signalering og i sidste ende adfærd er fortsat uklart16,30,31,32.
Nøjagtig måling af cilia længde og sammensætning viser sig at være en teknisk udfordring tilbøjelige til brugerfejl og uigenkaldelighed. I øjeblikket cilier in vivo og in vitro er oftest identificeret ved hjælp af immunofluorescent tilgange, mærkning ciliary proteiner eller cilia-beriget fluorescerende reporter alleler33,34,35. Længden af disse fluorescerende mærkede cilier måles derefter fra et 2-dimensionelt (2D) billede ved hjælp af linjemålingsværktøjer i billedanalyseprogrammer som ImageJ36. Denne proces er ikke kun kedelig og arbejdskrævende, men også tilbøjelig til bias og fejl. De samme forhindringer opstår ved måling af cilia intensiteter, som hjælper med at indikere ændringer i cilier struktur37. For at minimere uoverensstemmelserne i disse typer billedanalyser bliver programmer til kunstig intelligens (Ai) mere udbredte og overkommelige muligheder38.
Ai er udviklingen af computersystemer, der bruger fordelen ved computeralgoritmer og programmering til at udføre opgaver, der normalt ville kræve menneskelig intelligens39. Ai-enheder lærer at opfatte tilbagevendende mønstre, parametre og egenskaber og træffe foranstaltninger for at maksimere oddsene for at skabe vellykkede resultater. Ai er alsidig og kan trænes til at genkende specifikke objekter eller strukturer af interesse, såsom cilier, og derefter programmeres til at køre en række analyser på de identificerede objekter. Derfor kan komplekse billeddata hurtigt og reproducerbar genereres af Ai38. Automatisering og Ai-analyse af optagne billeder vil øge effektiviteten og samtidig begrænse eventuelle menneskelige fejl og bias39. Etablering af en Ai-baseret metode til cilia-identifikation skaber en ensartet måde for alle forskergrupper at analysere og fortolke cilia-data på.
Her bruger vi et Ai-modul til at identificere cilier både in vivo og in vitro på 2D-billeder. Ved hjælp af et sæt prøvebilleder trænes Ai'en til at identificere cilier. Når træningen er færdig, bruges den udpegede Ai til at anvende en binær maske over Ai-identificeret cilier i et billede. De binære filer, der anvendes af Ai er modificerbare, hvis det er nødvendigt, for at sikre, at alle cilier i billederne er korrekt identificeret og ikke-specifik identifikation er elimineret. Efter at have udnyttet Ai til at identificere cilier, specialbygget generelle analyse (GA) programmer bruges til at udføre forskellige analyser såsom måling cilier længde og fluorescens intensitet. De indsamlede data eksporteres til en tabel, der let kan læses, fortolkes og bruges til statistiske analyser (Figur 1). Brugen af automatiseret teknologi og Ai til at identificere cilier og opnå specifikke målinger mellem eksperimentelle grupper vil støtte i fremtidige undersøgelser med henblik på at forstå virkningen af CNS cilia funktion og morfologi på celle-celle kommunikation og adfærd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Intel Xeon, 3.6 GHz, 32GB RAM</td>
			<td>Intel Corporation</td>
			<td>W-2123</td>
			<td>Processor used for running NIS Elements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements Software</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Ai and GA3 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadro RTX 4000 Graphics card</td>
			<td>NVIDIA Corporation</td>
			<td>Quadro RTX 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10 Professional 64-bit</td>
			<td>Microsoft Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Operating system used for running NIS Elements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Workstation</td>
			<td>HP Development Company, L.P.</td>
			<td>HP&#160;Z4G4</td>
			<td>Workstation used for running NIS Elements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

artificial intelligence approaches to assessing primary cilia

Cilia er mikrotubule baseret cellulære vedhæng, der fungerer som signalering centre for en mangfoldighed af signalering veje i mange pattedyr celletyper. Cilia længde er meget bevaret, stramt reguleret, og varierer mellem forskellige celletyper og væv og har været involveret i direkte at påvirke deres signalkapacitet. For eksempel har cilia vist sig at ændre deres længder som reaktion på aktivering af ciliary G protein-koblede receptorer. Men nøjagtigt og reproducerbar måling af længden af talrige cilier er en tidskrævende og arbejdskrævende procedure. Nuværende tilgange er også fejl og bias tilbøjelige. Kunstig intelligens (Ai) programmer kan udnyttes til at overvinde mange af disse udfordringer på grund af kapaciteter, der tillader assimilering, manipulation og optimering af omfattende datasæt. Her viser vi, at et Ai-modul kan trænes til at genkende cilier i billeder fra både in vivo- og in vitro-prøver. Efter at have brugt den uddannede Ai til at identificere cilier, er vi i stand til at designe og hurtigt udnytte applikationer, der analyserer hundredvis af cilier i en enkelt prøve for længde, fluorescensintensitet og co-lokalisering. Denne upartiske tilgang øgede vores tillid og stringens, når vi sammenligner prøver fra forskellige primære neuronale preps in vitro såvel som på tværs af forskellige hjerneområder inden for et dyr og mellem dyr. Desuden kan denne teknik bruges til pålideligt at analysere cilia dynamik fra enhver celletype og væv i en high-throughput måde på tværs af flere prøver og behandlingsgrupper. I sidste ende vil Ai-baserede tilgange sandsynligvis blive standard, da de fleste områder bevæger sig i retning af mindre partiske og mere reproducerbare tilgange til billedopsamling og -analyse.

Watch this Scientific Journal Video about Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia at JoVE.com

Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia

Brugen af kunstig intelligens (Ai) til at analysere billeder er ved at opstå som en kraftfuld, mindre forudindtaget og hurtig tilgang sammenlignet med almindeligt anvendte metoder. Her trænede vi Ai til at genkende en cellulær organelle, primær cilier, og analysere egenskaber som længde og farvning intensitet i en streng og reproducerbar måde.

Kunstig intelligens tilgange til vurdering af primære cilier

Cilia are microtubule based cellular appendages that function as signaling centers for a diversity of signaling pathways in many mammalian cell types. ...

Nuværende metoder til cilia analyse er arbejdskrævende og tilbøjelige til fejl og bias. Vores tilgang har til formål at strømline tid og kræfter og samtidig afbøde potentielle fejl. Den største fordel, at denne teknik tilbyder, er øget stringens og reproducerbarhed og kvantitativ billedanalyse.Denne type tilgang er ikke kun relevant for cilia-analyse, men kan i vid udstrækning anvendes på mange cellebiologiske spørgsmål, herunder dem, der beskæftiger sig med andre organeller og cytoskeletale proteiner. Du kan begynde med at åbne træningsdatasættet, vælge filen i menuen, klikke på importeksport og vælge opret ND-fil fra filsekvensen. Vælg den mappe, der indeholder uddannelsesdatasættet, og listen over filer åbnes midt i dialogvinduet.Definer manuelt organiseringen af filer ved hjælp af mindst én indstilling i rullemenuen. Angiv de tilsvarende numeriske værdier under hver valgt indstilling, og vælg ingen, hvor indstillingerne ikke er markeret. Klik på konverter for at åbne ND-dokumentet.Hvis du vil kalibrere billedet, skal du højreklikke på den ikke-kalibrerede indstilling i nederste venstre hjørne af billedet. Klik på kalibrer dokumentet, klik derefter på pixelstørrelse, angiv værdien, og klik på okay. Vælg visningsanalysekontrolelementer, åbn den binære værktøjslinje, og vælg automatisk registrering eller tegn objekt ved at identificere cilier ved præcist at spore individuelle ciliarystrukturer på alle åbnede rammer.Vælg nis til træning af AI'en. ai, skal du klikke på togsegmentet. ai for at åbne togsegmentet.ai-boksen, og vælg derefter den kildekanal, der skal bruges til træning. Vælg de relevante GroundTruth binære filer til at træne AI. Vælg det nødvendige antal gentagelser for at træne AI'en afhængigt af den binære størrelse og distribution, vælg derefter destinationsmappen for at gemme den uddannede AI-fil, og klik på træn for at træne softwaren. Denne proces tager flere timer.Åbn de eksperimentelle konfokale billeder af cilier som beskrevet før ved at konvertere prøven. TIF filer til ND2 filer. Vælg flere point i den første rullemenu i pop op-vinduet, og angiv en værdi, der svarer til det samlede antal billeder.Vælg bølgelængde i den anden rulleliste, og ret værdien til det samlede antal kanaler i mappen. Softwaren låser automatisk op for et bølgelængdevalgsvindue, der er placeret nederst, til højre for pop op-vinduet. Brug rullemenuen farve i vinduet bølgelængdevalg til at vælge farven på hver kanal.Giv hver kanal et andet navn under navnekolonnen. Når alle oplysninger er opdateret, skal du klikke på konvertit. Kalibrer billederne som beskrevet før.Kontroller, at pixelstørrelsen på det eksperimentelle datasæt er i overensstemmelse med træningsdatasættets. Identificer cilier på den første kanal ved hjælp af den uddannede AI fra det foregående trin. Åbn nis.ai fra menuen, skal du vælge segment. ai, skal du vælge AC3 i kildekanalerne. Identificer derefter cilier på den anden kanal ved at vælge MCHR1 i kildekanalerne.Softwaren vil tegne binære filer på mærket cilier. Kontroller derefter billederne for fejlidentificerede binære filer. Vælg slet objekt på den binære værktøjslinje for manuelt at slette de fejlidentificerede binære filer.Når cilier er blevet identificeret og segmenteret, analysere forskellige cilier parametre, såsom længder og intensiteter, ved hjælp af den generelle analyse tre værktøj. Vælg billede i menuen, og klik på ny GA3-opskrift. Et nyt vindue med et tomt mellemrum i midten åbnes.GA3 registrerer automatisk de binære filer, der er passende mærket i henhold til AI'en, og inkluderer den tilsvarende node. GA3 registrerer også automatisk kanalerne på billederne og viser deres faner under kanaler. AI vil segmentere alle cilier som objekter i rammen og opdage ufuldstændige cilier langs kanterne af rammen.Hvis du vil fjerne dem, skal du markere binær behandling, fjerne objekter og derefter trække den rørende kantnode til det tomme område og forbinde noden med de relevante binære filer. Hvis du vil måle cilia-længden, skal du vælge måleobjektstørrelsen og derefter længden. Træk og slip parameteren til midten, og opret forbindelse til den relevante binære node.Hvis du vil måle cilia-intensiteter, skal du vælge en objektintensitet. Træk og slip parameteren til midten, og opret forbindelse til den relevante binære node og interessekanal. I målemenuen skal du gå til objektrelationmetri og vælge Manders koefficient for at oprette colocalization-stien i GA3 ved at måle overlapningen af to kanaler inden for individuelle cilier.Træk og slip Manders koefficientnode i det tomme rum, og tilslut den til den relevante binære fil og de relevante kanaler. ApEn målingerne og den enkelte tabel ved at åbne datastyringsmenuen. Vælg kolonnen ApEn i basiskategorien, og klik derefter på Kør nu for at måle cilier.Alle målinger vises i en enkelt outputtabel. De repræsentative billeder viser, at den uddannede AI korrekt identificeret cilier in vitro i billederne af IMCD celler, primære hypothalamic kulturer og hippocampal kulturer, men ingen andre ikke ciliary strukturer såsom cytokinetiske broer. Længden af cilier varierede fra 0,5 til 4,5 mikrometer i IMCD celler og to til 12 mikrometer i hypothalamus og hippocampal kultur.AI målte længderne af AC3 mærket cilia in vivo i billederne af vores arcuate kerne, paraventrikulær kerne og cornu ammonis en regioner. Ifølge analysen varierede hypothalamus cilia in vivo fra et til 15 mikrometer, som det ses i hvide og brune stænger. Mens cilier og cornu ammonis regionen varierede fra et til 10 mikrometer, som det ses i grå barer.Interessant nok var intensiteten af den ciliære MCHR1 stærkere i den paraventrikulære kerne end i arcuatekernen. Mchr1's intensitet i forhold til AC3 blev planlagt til at måle deres overlapning. De fleste cilier var positive for begge markører, mens nogle cilier var positive for enten AC3 eller MCHR1.For at kvantificere colocalization af MTHR1 inden for AC3 blev Manders overlapningskoefficient målt, og der var en betydelig stigning i overlapningen i paraventrikulær kerne end i arcuatekernen. For at måle intensiteten langs cilierens længde blev cilier polaritet defineret ved hjælp af Centrin2-GFP som den basale kropsmarkør. Dette gjorde det muligt at skelne bunden af cilier fra spidsen af ARL13B-M kirsebær positive cilier.Ændringer i ARL13B intensitet langs længden af cilier blev observeret, hvor ARL13B intensitet var højere i bunden end på spidsen af cilium i arcuate kerne, set til venstre, samt PVN, som ses til højre. Når du analyserer data med denne tilgang, er det vigtigt at sikre, at kvaliteten og opløsningen af det eksperimentelle datasæt er i overensstemmelse med det, der bruges til at træne AI. Det vigtigste værktøj ved denne tilgang er efter at have opdaget cilier af AI, kan brugeren være kreativ om, hvilke egenskaber der analyseres ved at tilpasse analysearbejdsgangen integreret i softwaren.

Research

JoVE Journal

Biology

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals.  Peromyscus species are used in a wide range of research ...

Experimental Approaches to Tissue Engineering

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Analyse af genfunktioner og Visualisering af Cilia er genereret Fluid Flow i Kupffer s vesikel

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Vurdere artsspecifikke bidrag til kraniofaciale Development Brug Quail-ænder kimærer

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Eksperimentelle tilgange til at studere mitokondrie Lokalisering og funktion af en nuklear Cell Cycle kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Brug mikrofluidenheder til måling Levetid og cellefænotyper i Single Spirende gærceller

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro og In Vivo tilgange til at bestemme Intestinal epitelcelle permeabilitet

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetisk aktiveret celle sortering strategier for at isolere og rense Synovial væske-afledte mesenkymale stamceller fra en kanin Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Simpel påvisning af primær cilier ved immunofluorescens

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...