Name: artificial intelligence approaches to assessing primary cilia
Uploaded: 2021-05-01T14:00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases R01 DK114008 aan NFB en de American Heart Association Fellowship Grant #18PRE34020122 aan RB. We bedanken Rich Gruskin General Manager van Nikon Software, Melissa Bentley, Courtney Haycraft en Teresa Mastracci voor inzichtelijke opmerkingen over het manuscript.

1. Raw-afbeeldingen verkrijgen
<ol><li>Fixeer en immunolabel monsters indien nodig20.<ol>
<li>Beeld trilharen met behulp van een confocale microscoop op maximale bitdiepte met dezelfde pixelgrootte met Nyquist-resolutie.</li>
		<li>Exporteer afbeeldingen als monochrome .tif bestanden (Tagged Image Format). OPMERKING: In dit protocol wordt beschreven hoe u de Ai-module specifiek binnen NIS Elements-software kunt gebruiken. Als afbeeldingen zijn verkregen als .nd2-bestanden, is het exporteren van afbeeldingen als .tif bestanden niet nodig en kan de gebruiker direct doorgaan naar stap 2.3. Als installatiekopieën op een ander systeem zijn verkregen, kan een NIS Elements-licentie afzonderlijk worden aangeschaft en kunnen .tif bestanden worden geconverteerd zoals beschreven in de volgende stappen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Train Ai om trilhaartjes te identificeren
<ol><li>Open de trainingsdataset.<ol>
<li>Selecteer ongeveer 50 voorbeeldafbeeldingen met ten minste één cilium per frame om de software te trainen en kopieer ze in één map. Deze map wordt gebruikt om de software te sturen bij het openen van de afbeeldingen. Open deze 50 frames binnen één ND2-document met ten minste één cilium per frame. Selecteer Bestand > Importeren/exporteren > ND-bestand maken van bestandsvolgorde.</li>
		<li>Selecteer de map met de trainingsgegevensset. Hiermee wordt de lijst met bestanden in het midden van het dialoogvenster geopend. Definieer handmatig de organisatie van de bestanden met behulp van ten minste één optie in het vervolgkeuzemenu hierboven. De opties zijn multipoint (voor meerdere maximale projectiebestanden), Z-serie (voor een z-stackafbeelding), tijd (voor een time-lapse-afbeelding) en golflengte (voor bestanden van meerdere kanalen).</li>
		<li>Voer de bijbehorende numerieke waarden in onder elke geselecteerde optie. Selecteer Geen wanneer opties niet zijn geselecteerd. Klik op Converteren om het ND-document te openen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kalibreer afbeeldingen.<ol>
<li>Voer de pixelgrootte in de linkerbenedenhoek van de afbeelding in: Klik met de rechtermuisknop op Niet-gekalibreerde > Document kalibreren > Pixelgrootte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identificeer trilharen.<ol>
<li>Identificeer de trilharen met de hand door individuele ciliaire structuren op alle geopende frames nauwkeurig te traceren met behulp van AutoDetect of Draw Object in de binaire werkbalk. Dit zal binaire maskers tekenen op de objecten van belang. Deze binaire bestanden zullen dienen als voorbeeldobjecten voor het trainen van de software om trilharen op pixelgebaseerde kenmerken te identificeren in toekomstige experimentele beeldanalyse. Selecteer Besturingselementen voor > analyse weergeven > binaire werkbalk > object tekenen. OPMERKING: Verwijder elk frame dat geen binaire bestanden heeft, omdat de software niet begint met trainen tenzij het binaire bestanden kan detecteren op alle geopende frames.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trein Ai.<ol>
<li>Begin met het trainen van de software. Hiermee wordt de trein Segment.ai doos geopend. Selecteer NIS.ai > Train Segment.ai.</li>
		<li>Selecteer in het vak Train Segment.ai het bronkanaal dat u voor training wilt gebruiken. Als bestanden van meerdere kanalen zijn geopend, selecteert u slechts één kanaal als bronkanaal. Selecteer vervolgens de juiste grondwaarheidsdubbelstenen waarop u de Ai wilt trainen. Selecteer ten slotte het aantal iteraties dat nodig is om de Ai te trainen, afhankelijk van de grootte en verdeling van de binaire bestanden. OPMERKING: Als de binaire bestanden gemakkelijk detecteerbaar zijn vanuit de omgeving en goed verspreid zijn over de afbeelding, heeft de software mogelijk minder dan 1000 iteraties nodig om getraind te worden om de afbeeldingen te identificeren. Als de beelden een lage signaal-ruisverhouding hebben, is het ideaal om tijdens de training minstens 1000 iteraties uit te voeren om de Ai in staat te stellen trilharen in testmonsters met hoge betrouwbaarheid te identificeren.</li>
		<li>Selecteer de doelmap om het getrainde Ai-bestand (.sai) op te slaan en klik op Trainen om de software te trainen. De software gaat nu verder met het trainen van zichzelf om trilharen te identificeren op basis van de getraceerde binaries. Dit proces duurt enkele uren. OPMERKING: Tijdens het trainen geeft de software een grafiek weer met trainingsverlies. De grafiek zal in eerste instantie een piek laten zien voordat deze afbouwt tot idealiter ongeveer 1% verlies waar het plateaus voor de rest van de training. Sla de grafiek op voor toekomstig gebruik door het selectievakje Grafiekschermafbeelding opslaan in het vak Segment.ai opsteken (Aanvullende afbeelding 1).</li>
		<li>Als verdere verfijning van de training nodig is, ga dan verder met trainen op dezelfde dataset. U kunt ook trainen op een nieuwe gegevensset met exact dezelfde parameters. Het is niet aan te raden om een reeds getrainde Ai te trainen op een nieuwe dataset met verschillende parameters of verschillende objecten van belang. Selecteer Train segment.ai > Continue Training On > Selecteer Trained Ai File.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Identificeer trilharen met behulp van getrainde Ai
<ol><li>Open de experimentele gegevensset.<ol>
<li>Open de experimentele confocale afbeeldingen van trilharen in de software door het voorbeeld .tif bestanden te converteren naar .nd2-bestanden, vergelijkbaar met stap 2.1. Selecteer Bestand > Importeren/exporteren > ND-bestand maken van bestandsvolgorde. OPMERKING: De afbeeldingen moeten dezelfde pixelgrootte hebben als die welke worden gebruikt voor het trainen van de Ai. Als de afbeeldingen al de ND2-indeling hebben, gaat u verder met stap 3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kalibreer afbeeldingen.<ol>
<li>Voer de pixelgrootte in de linkerbenedenhoek van de afbeelding in. Klik met de rechtermuisknop op Niet-gekalibreerde > document kalibreer > pixelgrootte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voer de getrainde Ai uit op de geopende bestanden.<ol>
<li>Begin met het identificeren van de trilharen met behulp van Ai. De software tekent nu binaries op de trilharen op basis van de training die het in de vorige stap heeft gekregen. Dit proces duurt enkele seconden. Selecteer NIS.ai > Segment.ai. OPMERKING: De software vraagt om het kanaal te selecteren als er meerdere kanalen zijn geopend. Kanalen worden hier vermeld met hun respectieve namen. Als dit niet het geval is, wordt het vakje 'Mono' automatisch geselecteerd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Controleer afbeeldingen op verkeerd geïdentificeerde binaire bestanden.<ol>
<li>Zodra de Ai trilharen en getekende binaire bestanden heeft geïdentificeerd, controleert u de afbeeldingen op ten onrechte geïdentificeerde objecten. Verwijder desgewenst handmatig verkeerd geïdentificeerde binaire bestanden. Selecteer Weergave > analysebesturingselementen > binaire werkbalk > Object verwijderen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Meten van trilharen lengte en intensiteit
<ol><li>Maak een nieuw ga3-recept (General Analysis 3).<ol>
<li>Nu de trilharen zijn geïdentificeerd en gesegmenteerd, gaat u verder met het analyseren van verschillende parameters van trilharen zoals lengtes en intensiteiten met behulp van GA3-tool. Dit opent een nieuw venster met een lege ruimte in het midden waar de analyse wordt gedefinieerd. Selecteer Afbeelding > nieuw GA3-recept.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecteer de binaire bestanden die u wilt analyseren.<ol>
<li>Omdat de trilharen al zijn gesegmenteerd met behulp van Segment.ai, detecteert GA3 automatisch de binaire bestanden die op de juiste manier zijn gelabeld volgens de Ai en bevatten ze het knooppunt. Selecteer'Binaire > automatisch Detect_AI' of 'Binaire > teken Object_AI'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecteer de kanalen die nodig zijn voor analyse. GA3 detecteert ook automatisch de kanalen in de afbeeldingen en geeft hun tabbladen weer onder Kanalen.</li>
	<li>Verwijder objecten die de rand van het kader raken.<ol>
<li>Omdat de Ai alle trilharenachtige objecten in het frame zal segmenteren, zal het ook onvolledige trilharen langs de randen van het frame detecteren. Deze objecten kunnen handmatig worden verwijderd in stap 3.4 of ze kunnen automatisch worden verwijderd in GA3. Selecteer Binaire verwerking > Objecten verwijderen > Randen aanraken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecteer parameters om trilharen te meten.<ol>
<li>Sleep de parameters om te meten, zoals de lengte van de trilharen(lengte)en de intensiteiten(somobjectintensiteit). Verbind de knooppunten met het juiste binaire knooppunt (verbinding A) en kanaalknooppunten (verbinding B). Plaats de muisaanwijzer op de knooppuntverbinding voor knopinfo om aan te geven tot welke verbinding het knooppunt behoort. Selecteer Meting > objectgrootte > lengte en meting > objectintensiteit > Obj-intensiteit optellen. OPMERKING: De knooppuntlengte maakt alleen verbinding met het binaire knooppunt, terwijl Sum Obj Intensity verbinding maakt met zowel de binaire als de kanaalknooppunten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg de metingen toe aan één tabel.<ol>
<li>Combineer alle metingen in één uitvoertabel door het knooppunt Kolom toevoegen aan het analysestroomdiagram te slepen en neer te zetten en het te verbinden met de meetknooppunten, Lengte en Som Obj-intensiteit. Selecteer Gegevensbeheer > basis > kolom toevoegen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Meet trilharen.<ol>
<li>Meet trilharen door op Uitvoerente klikken. Dit proces duurt enkele ogenblikken om alle trilharen in de experimentele beelden te meten. De lengtes en intensiteiten worden weergegeven in een nieuw venster Analyseresultaten. OPMERKING: De tabel kan soms gegevens bevatten van maskers die Ai herkende als trilharen, maar te klein waren om door het menselijk oog te worden gedetecteerd en geëlimineerd in stap 3.4. Deze objecten kunnen uit de gegevensset worden verwijderd met behulp van een filter voordat statistische analyse wordt uitgevoerd. Hier werd een filter van 1 μm gebruikt voor in vitro cilia lengtemetingen in figuur 2 en 2 μm voor in vivo cilia. Dit kan worden gedaan voordat gegevens worden geëxporteerd met behulp van het onderstaande pad. Selecteer venster Analyseresultaten > Filter definiëren > Waarde invoeren > Filter gebruiken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exporteer gegevens voor statistische analyse.</li>
</ol>5. Colocalisatie studies
OPMERKING: Colocalisatie-analyse kan worden opgenomen in hetzelfde GA3-recept dat wordt gebruikt voor metingen van trilharenlengte en intensiteitsanalyse. Als u hetzelfde recept gebruikt, opent u bestanden zoals hieronder beschreven en meet u de lengtes en intensiteiten van beide kanalen, samen met de colocalisatiecoëfficiënten in dezelfde analysepijplijn.
<ol><li>Open de experimentele gegevensset.<ol>
<li>Open de experimentele confocale afbeeldingen van trilharen in de software door het voorbeeld .tif bestanden te converteren naar .nd2 bestanden. Selecteer Bestand > Importeren/exporteren > ND-bestand maken van bestandsvolgorde.</li>
		<li>Selecteer in het pop-upvenster de monochrome bestanden met een 16-bits diepte uit alle interessante kanalen in de vensterverkenner in de eerste kolom van het pop-upvenster. Selecteer Multipoint of Z-serie in het eerste vervolgkeuzemenu en voer een waarde in die overeenkomt met het totale aantal afbeeldingen of stapels.</li>
		<li>Selecteer in de tweede vervolgkeuzelijst Golflengte en wijzig de waarde in het totale aantal kanalen in de map. De software ontgrendelt automatisch een golflengteselectievenster rechtsonder in het pop-upvenster. Gebruik het vervolgkeuzemenu Kleur om de kleur van elk kanaal te selecteren. Geef elk kanaal een andere naam in de kolom Naam. Zodra alle informatie is bijgewerkt, klikt u op Converteren. De software genereert automatisch een alle afbeeldingsbestand bedekt met alle individuele afbeeldingen van alle geselecteerde kanalen.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalibreer afbeeldingen.<ol>
<li>Voer de pixelgrootte in de linkerbenedenhoek van de afbeelding in. Klik met de rechtermuisknop op Niet-gekalibreerde > document kalibreer > pixelgrootte.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer de getrainde Ai uit op het eerste kanaal.<ol>
<li>Begin met het identificeren van de trilharen op een van de geopende kanalen (bijv. ACIII; Figuur 5A) met behulp van Ai. De software tekent nu binaries op ACIII-gelabelde trilharen op basis van de training die het voor dit kanaal heeft gekregen. Dit proces duurt enkele seconden. Selecteer NIS.ai > Segment.ai > bronkanalen > ACIII.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer de getrainde Ai uit op het tweede kanaal.<ol>
<li>Begin met het identificeren van de trilharen op het andere geopende kanaal (bijv. MCHR1; Figuur 5B) met behulp van Ai. De software tekent nu binaries op MCHR1-gelabelde trilharen op basis van de training die het voor dit kanaal heeft gekregen. Dit proces zal enkele ogenblikken duren. Selecteer NIS.ai > Segment.ai > bronkanalen > MCHR1.</li>
	</ol></li>
	<li>Controleer afbeeldingen op verkeerd geïdentificeerde binaire bestanden.<ol>
<li>Zodra de Ai trilharen en getekende dubbelsterren heeft geïdentificeerd, controleert u de afbeeldingen op verkeerd geïdentificeerde objecten. Verwijder indien nodig handmatig verkeerd geïdentificeerde binaire bestanden. Selecteer Weergave > analysebesturingselementen > binaire werkbalk > Object verwijderen.
</li>
	</ol></li>
	<li>Maak een nieuw GA3-recept.<ol>
<li>Nu de trilharen zijn geïdentificeerd en gesegmenteerd, gaat u verder met de colocalisatieanalyse met behulp van de GA3-tool. Dit opent een nieuw venster met een lege ruimte in het midden waar de analyse wordt gedefinieerd. Er wordt een venster gegenereerd met alle geïdentificeerde binaire bestanden en kanalen. Controleer of alle gewenste kanalen en binaire bestanden die nodig zijn voor analyse aanwezig en geselecteerd zijn. Selecteer Afbeelding > nieuw GA3-recept.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwijder objecten die de rand van het kader raken.<ol>
<li>Omdat de Ai alle trilharenachtige objecten in het frame zal segmenteren, zal het ook onvolledige trilharen langs de randen van het frame detecteren. Deze objecten kunnen handmatig worden verwijderd in stap 5.5 of ze kunnen automatisch worden verwijderd in GA3. Selecteer Binaire verwerking > Objecten verwijderen > Randen aanraken.
</li>
	</ol></li>
	<li>Stel het colocalisatietraject in GA3 in.<ol>
<li>Om de overlap van de twee kanalen binnen trilharen te meten, gebruikt u Mander's Coefficient Correlation. Sleep het knooppunt Manders-coëfficiënt naar de lege ruimte van het GA3-recept en verbind het met de juiste binaire en kanalen. Hier verbindt 'verbinding A' met het ACIII-binaire, 'verbinding B' met het MCHR1-kanaal en 'verbinding C' met het ACIII-kanaal om de overlap van MCHR1 binnen ACIII-binaire te bepalen. Selecteer Meting > objectverhoudingsmetrie > Manders-coëfficiënt. OPMERKING: De software maakt het mogelijk om colocalisatie te meten met behulp van Pearson Coefficient Correlation met behulp van dezelfde stappen als beschreven in dit protocol40.</li>
	</ol></li>
	<li>Voeg de metingen toe aan één tabel.<ol>
<li>Combineer alle metingen in één uitvoertabel. Selecteer Gegevensbeheer > basis > kolom toevoegen.</li>
	</ol></li>
	<li>Meet colocalisatie.<ol>
<li>Meet trilharen door op Uitvoerente klikken. Dit proces duurt enkele ogenblikken om alle trilharen in de experimentele beelden te meten. De gegevens worden weergegeven in een nieuw venster analyseresultaten.</li>
	</ol></li>
	<li>Exporteer gegevens voor statistische analyse.</li>
</ol>

Co-auteur Wesley Lewis is een medewerker van Nikon. Er zijn geen financiële toelichtingen.

Lengte- en intensiteitsmetingen zijn gebruikelijke manieren waarop primaire trilharen worden geanalyseerd, maar er is geen gestandaardiseerde conventionele methode die in het veld wordt gebruikt. Identificatie en kwantificering van primaire trilharen met behulp van software zoals ImageJ is tijdrovend en gevoelig voor gebruikersbias en fouten. Dit maakt het moeilijk om grote datasets nauwkeurig te analyseren. Hier laten we zien dat het gebruik van een Ai-programma veel van deze uitdagingen kan overwinnen, waardoor een hoge doorvoeranalyse van primaire trilharen haalbaar is. Hierin beschrijven we de procedure voor het trainen van een Ai-gebaseerde applicatie om primaire trilharen te herkennen en schetsen we de stappen die nodig zijn om lengte en intensiteit te analyseren.
Hoewel de initiële training van de Ai om trilharen te herkennen veel tijd van de gebruiker vereist, kan deze, eenmaal voltooid, worden gebruikt op elke dataset die met dezelfde parameters is verkregen. Het binaire masker dat door de Ai wordt gegenereerd, kan zodanig worden gewijzigd dat eventuele fouten kunnen worden gecorrigeerd. Fouten in de identificatie van trilharen moeten de gebruiker echter het signaal geven dat de Ai verder moet worden getraind met extra beelden. Een groot voordeel van deze methode is dat de Ai getraind kan worden om trilhaartjes in verschillende monstertypen te herkennen in zowel 2D als 3D. Eerdere analysemethoden die in laboratoria zijn gegenereerd, hebben verschillende beperkingen, waaronder het vereisen van handmatige drempels voor identificatie en problemen met het identificeren van trilharen die zijn afgebeeld uit weefselsecties waar de celdichtheid hoog is36,46,47. Deze methoden zijn ook gespecialiseerd voor trilharenanalyse, terwijl analyse met behulp van NIS Elements-software verschillende aspecten van de beelden tegelijkertijd kan evalueren. Omdat de hier beschreven Ai deel uitmaakt van het NIS Elements-softwarepakket, kunnen beelden die met een Nikon-microscoop zijn verkregen, eenvoudig worden voortgezet tot analyse. Beeldvorming met Nikon is echter niet vereist voor het gebruik van deze methode. Ongeacht het vastgelegde raw data-bestandsformaat, kunnen ".tif" -bestanden door NIS Elements worden geopend om te gebruiken in de Ai.
Deze Ai-toepassing binnen NIS Elements is breed beschikbaar en mogelijk al onderdeel van beeldanalysesoftware die wordt gebruikt door laboratoria die primaire trilharen bestuderen. Nu de prevalentie van Ai-technologie toeneemt, kunnen andere beeldvormingssoftware hun analyseopties uitbreiden met een vergelijkbare Ai-module. Het toepassen van Ai-analyse op trilharenidentificatie kan worden gebruikt voor verschillende aspecten van trilharenanalyse. Hoewel we methoden hebben geschetst voor een paar eenvoudige analyses zoals lengte(figuur 2 en 3),intensiteit(figuur 4)en colocalisatie(figuur 5),kan meer geavanceerde analyse worden toegevoegd aan de GA3-analyseworkflow zoals in figuur 6. In plaats van bijvoorbeeld de intensiteit van een volledig cilium te meten, kunnen verschillen in intensiteit binnen een subregio van een cilium van belang zijn om subciliaire lokalisatie te beoordelen. Verschillen in intensiteit binnen een subregio van een cilium kunnen erop wijzen dat het eiwit zich ophoopt aan de punt of de basis van het cilium, zoals hoe Gli-eiwitten worden verrijkt aan de punt van trilharen48. Bovendien kan deze Ai-toepassing worden gebruikt om gemakkelijk verschillen tussen genotypen of behandelingsgroepen te identificeren. Hoewel ons laboratorium deze methode voornamelijk gebruikt om trilharen uit hersensecties of neuronale culturen te analyseren, kan deze worden toegepast op afbeeldingen die zijn verkregen uit verschillende cellijnen of andere weefseltypen. De flexibiliteit van het monstertype waarop deze toepassing kan worden gebruikt, maakt deze analysemethode waardevol voor veel verschillende groepen die primaire trilharen of afzonderlijke organellen bestuderen die worden beoordeeld, zoals mitochondriën, kern of ER.

Primaire trilharen zijn sensorische organellen die uitsteken uit de meeste zoogdierceltypen1,2,3,4. Het zijn over het algemeen solitaire aanhangsels die cruciaal zijn voor het coördineren van diverse celsignaleringsroutes door extracellulairesignalen 5,6,7te integreren. Primaire trilharen spelen een belangrijke rol tijdens de embryonale ontwikkeling en de homeostase van volwassen weefsel, en verstoring van hun functie of morfologie wordt geassocieerd met verschillende genetische aandoeningen, die gezamenlijk ciliopathieën worden genoemd. Vanwege de bijna alomtegenwoordige aard van trilharen, worden ciliopathieën geassocieerd met een breed scala aan klinische kenmerken die van invloed kunnen zijn op alle orgaansystemen8,9,10,11,12. In diermodellen van ciliopathieën manifesteert verlies van ciliaire structuur of signaleringscapaciteit zich in verschillende klinisch relevante fenotypen, waaronder hyperfagie-geassocieerde obesitas3,13,14,15. In veel modelsystemen is aangetoond dat veranderingen in de lengte van trilharen van invloed zijn op hun signaleringscapaciteit en functies16,17,18,19. Er zijn echter verschillende tijdrovende en technische uitdagingen verbonden aan het nauwkeurig en reproduceerbaar beoordelen van de lengte en samenstelling van trilharen.
Het volwassen centrale zenuwstelsel van zoogdieren (CZS) is een biologische context die een uitdaging heeft gevormd voor het begrijpen van de morfologie en functie van trilharen. Hoewel het erop lijkt dat neuronen en cellen in het hele CZS trilharen bezitten, blijft vanwege de beperkte hulpmiddelen en mogelijkheden om deze trilharen te observeren en te analyseren een begrip van hun functies ongrijpbaar20. Bijvoorbeeld, de prototypische cilia marker, geacetyleerd α-tubuline, labelt geen neuronale cilia20. De moeilijkheid van het bestuderen van deze trilharen werd gedeeltelijk opgelost met de ontdekking van verschillende G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR), signaleringsmachines en membraangeassocieerde eiwitten die zijn verrijkt op het membraan van neuronale trilharen21,22. Al deze eenvoudige basiswaarnemingen wijzen op het belang en de diversiteit van CZS-trilharen, die tot nu toe ongeëvenaard lijken door andere weefsels. Variatie in trilharenlengte en GPCR-lokalisatie kan bijvoorbeeld in de hele hersenen worden waargenomen, waarbij lengtes in bepaalde neuronale kernen anders zijn in vergelijking met andere kernen19,23. Evenzo tonen hun GPCR-inhoud en signaleringsmachines diversiteit op basis van neuroanatomische locatie en neuronaal type2,24,25,26,27,28,29. Deze eenvoudige waarnemingen tonen aan dat de lengte en samenstelling van zoogdier-cilia's strak gereguleerd zijn, net als bij modelorganismen, zoals Chlamydomonas reinhardtii, maar de impact van deze lengteverschillen op de functie, signalering en uiteindelijk gedrag van trilharen blijft onduidelijk16,30,31,32.
Het nauwkeurig meten van de lengte en samenstelling van trilharen blijkt een technische uitdaging te zijn die gevoelig is voor gebruikersfouten en onherleidbaarheid. Momenteel worden trilharen in vivo en in vitro meestal geïdentificeerd met behulp van immunofluorescente benaderingen die ciliaire eiwitten of met trilharen verrijkte fluorescerende reporter-allelenlabelen 33,34,35. De lengtes van deze fluorescerend getagde trilharen worden vervolgens gemeten vanaf een 2-dimensionaal (2D) beeld met behulp van lijnmeetinstrumenten in beeldanalyseprogramma's zoals ImageJ36. Dit proces is niet alleen vervelend en arbeidsintensief, maar ook vatbaar voor vooringenomenheid en fouten. Dezelfde obstakels doen zich voor bij het meten van trilharenintensiteiten, die helpen bij het aangeven van veranderingen in de trilharenstructuur37. Om de inconsistenties in dit soort beeldanalyses te minimaliseren, worden kunstmatige intelligentie (Ai) -programma's steeds vaker voorkomende en betaalbare opties38.
Ai is de vooruitgang van computersystemen die het voordeel van computeralgoritmen en programmering gebruiken om taken uit te voeren die normaal gesproken menselijke intelligentie vereisen39. Ai-apparaten worden geleerd om terugkerende patronen, parameters en kenmerken waar te nemen en acties te ondernemen om de kans op het creëren van succesvolle resultaten te maximaliseren. Ai is veelzijdig en kan worden getraind om specifieke objecten of interessante structuren, zoals trilharen, te herkennen en vervolgens worden geprogrammeerd om een verscheidenheid aan analyses op de geïdentificeerde objecten uit te voeren. Daarom kunnen complexe beeldgegevens snel en reproduceerbaar worden gegenereerd door Ai38. Automatisering en Ai-analyse van vastgelegde beelden zullen de effectiviteit en efficiëntie verhogen en tegelijkertijd mogelijke menselijke fouten en vooringenomenheid beperken39. Het opzetten van een op Ai gebaseerde methodologie voor de identificatie van trilharen creëert een consistente manier voor alle onderzoeksgroepen om trilharengegevens te analyseren en te interpreteren.
Hier gebruiken we een Ai-module om trilharen zowel in vivo als in vitro op 2D-beelden te identificeren. Met behulp van een set voorbeeldbeelden wordt de Ai getraind om trilharen te identificeren. Zodra de training is voltooid, wordt de aangewezen Ai gebruikt om een binair masker toe te passen op Ai-geïdentificeerde trilharen in een afbeelding. De door de Ai aangebrachte binaries zijn indien nodig aanpasbaar om ervoor te zorgen dat alle trilharen in de afbeeldingen correct worden geïdentificeerd en niet-specifieke identificatie wordt geëlimineerd. Na het gebruik van de Ai om trilharen te identificeren, worden op maat gemaakte algemene analyseprogramma's (GA) gebruikt om verschillende analyses uit te voeren, zoals het meten van de lengte van de trilharen en de fluorescentie-intensiteit. De verzamelde gegevens worden geëxporteerd naar een tabel die gemakkelijk kan worden gelezen, geïnterpreteerd en gebruikt voor statistische analyses(figuur 1). Het gebruik van geautomatiseerde technologie en Ai om trilharen te identificeren en specifieke metingen tussen experimentele groepen te verkrijgen, zal helpen bij toekomstige studies die gericht zijn op het begrijpen van de impact van de Cilia-functie en morfologie van het CZS op cel-celcommunicatie en -gedrag.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Intel Xeon, 3.6 GHz, 32GB RAM</td>
			<td>Intel Corporation</td>
			<td>W-2123</td>
			<td>Processor used for running NIS Elements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements Software</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Ai and GA3 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadro RTX 4000 Graphics card</td>
			<td>NVIDIA Corporation</td>
			<td>Quadro RTX 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10 Professional 64-bit</td>
			<td>Microsoft Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Operating system used for running NIS Elements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Workstation</td>
			<td>HP Development Company, L.P.</td>
			<td>HP&#160;Z4G4</td>
			<td>Workstation used for running NIS Elements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

artificial intelligence approaches to assessing primary cilia

Trilharen zijn op microtubuli gebaseerde cellulaire aanhangsels die functioneren als signaleringscentra voor een verscheidenheid aan signaalroutes in veel zoogdierceltypen. De lengte van trilharen is sterk geconserveerd, strak gereguleerd en varieert tussen verschillende celtypen en weefsels en is betrokken bij het direct beïnvloeden van hun signaalcapaciteit. Van trilharen is bijvoorbeeld aangetoond dat ze hun lengte veranderen als reactie op activering van ciliaire G-eiwitgekoppelde receptoren. Het nauwkeurig en reproduceerbaar meten van de lengte van talrijke trilharen is echter een tijdrovende en arbeidsintensieve procedure. De huidige benaderingen zijn ook fout- en vooringenomenheidsgevoelig. Kunstmatige intelligentie (Ai) -programma's kunnen worden gebruikt om veel van deze uitdagingen te overwinnen vanwege mogelijkheden die assimilatie, manipulatie en optimalisatie van uitgebreide datasets mogelijk maken. Hier laten we zien dat een Ai-module getraind kan worden om trilharen te herkennen in beelden van zowel in vivo als in vitro monsters. Na het gebruik van de getrainde Ai om trilharen te identificeren, zijn we in staat om toepassingen te ontwerpen en snel te gebruiken die honderden trilharen in één monster analyseren op lengte, fluorescentie-intensiteit en co-lokalisatie. Deze onbevooroordeelde benadering verhoogde ons vertrouwen en onze strengheid bij het vergelijken van monsters van verschillende primaire neuronale preps in vitro en in verschillende hersengebieden binnen een dier en tussen dieren. Bovendien kan deze techniek worden gebruikt om de trilharendynamiek van elk celtype en weefsel betrouwbaar te analyseren op een high-throughput manier over meerdere monsters en behandelingsgroepen. Uiteindelijk zullen ai-gebaseerde benaderingen waarschijnlijk standaard worden, omdat de meeste velden evolueren naar minder bevooroordeelde en meer reproduceerbare benaderingen voor beeldacquisitie en -analyse.

Watch this Scientific Journal Video about Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia at JoVE.com

Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia

Het gebruik van kunstmatige intelligentie (Ai) om beelden te analyseren is in opkomst als een krachtige, minder bevooroordeelde en snelle aanpak in vergelijking met veelgebruikte methoden. Hier hebben we Ai getraind om een cellulair organel, primaire trilharen te herkennen en eigenschappen zoals lengte en kleurintensiteit op een rigoureuze en reproduceerbare manier te analyseren.

Kunstmatige intelligentie benaderingen voor het beoordelen van primaire trilharen

Cilia are microtubule based cellular appendages that function as signaling centers for a diversity of signaling pathways in many mammalian cell types. ...

De huidige methoden voor trilharenanalyse zijn arbeidsintensief en gevoelig voor fouten en vertekening. Onze aanpak is erop gericht om tijd en moeite te stroomlijnen en tegelijkertijd potentiële fouten te beperken. Het belangrijkste voordeel dat deze techniek biedt, is verhoogde striktheid en reproduceerbaarheid en kwantitatieve beeldanalyse.Dit type benadering is niet alleen relevant voor de analyse van trilharen, maar kan ook breed worden toegepast op veel celbiologische vragen, waaronder die welke betrekking hebben op andere organellen en cytoskeletale eiwitten. Open om te beginnen de trainingsset, selecteer bestand in het menu, klik op exporteren importeren en selecteer ND-bestand maken uit bestandsvolgorde. Selecteer de map met de trainingsgegevensset en de lijst met bestanden wordt in het midden van het dialoogvenster geopend.Definieer handmatig de organisatie van bestanden met ten minste één optie in het vervolgkeuzemenu. Voer de bijbehorende numerieke waarden in onder elke geselecteerde optie en selecteer geen wanneer er geen opties zijn geselecteerd. Klik op Converteren om het ND-document te openen.Om de afbeelding te kalibreren, klikt u met de rechtermuisknop op de niet-gekalibreerde optie in de linkerbenedenhoek van de afbeelding. Klik op Document kalibreren, klik vervolgens op Pixelgrootte, voer de waarde in en klik op OK. Selecteer weergaveanalysebesturingselementen, open de binaire werkbalk en selecteer automatisch detecteren of tekenobject om trilharen met de hand te identificeren door individuele ciliaire structuren op alle geopende frames nauwkeurig te traceren.Voor het trainen van de AI selecteert u nis. ai, klik trein segment. ai om het treinsegment te openen.ai box en selecteer vervolgens het bronkanaal dat moet worden gebruikt voor training. Selecteer de juiste GroundTruth-binaire bestanden om de AI te trainen. Selecteer het vereiste aantal iteraties om de AI te trainen, afhankelijk van de binaire grootte en distributie, selecteer vervolgens de doelmap om het getrainde AI-bestand op te slaan en klik op trainen om de software te trainen. Dit proces duurt enkele uren.Open de experimentele confocale afbeeldingen van trilharen zoals eerder beschreven door het monster om te zetten. TIF-bestanden naar ND2-bestanden. Selecteer in het pop-upvenster meerdere punten in het eerste vervolgkeuzemenu en voer een waarde in die overeenkomt met het totale aantal afbeeldingen.Selecteer in de tweede vervolgkeuzelijst golflengte en wijzig de waarde in het totale aantal kanalen in de map. De software ontgrendelt automatisch een golflengteselectievenster, dat zich aan de onderkant, rechterkant van het pop-upvenster bevindt. Gebruik in het golflengteselectievenster het vervolgkeuzemenu kleur om de kleur van elk kanaal te selecteren.Geef elk kanaal een andere naam onder de naamkolom. Zodra alle informatie is bijgewerkt, klikt u op Converteren. Kalibreer de afbeeldingen zoals eerder beschreven.Zorg ervoor dat de pixelgrootte van de experimentele gegevensset overeenkomt met die van de trainingsgegevensset. Identificeer trilharen op het eerste kanaal met behulp van de getrainde AI uit de vorige stap. Open nis.ai selecteer in het menu segment. ai en selecteer vervolgens AC3 in de bronkanalen. Identificeer vervolgens de trilharen op het tweede kanaal door MCHR1 te selecteren in de bronkanalen.De software tekent binaire bestanden op de gelabelde trilharen. Controleer vervolgens de afbeeldingen op verkeerd geïdentificeerde binaire bestanden. Selecteer object verwijderen op de binaire werkbalk om de verkeerd geïdentificeerde binaire bestanden handmatig te verwijderen.Zodra de trilharen zijn geïdentificeerd en gesegmenteerd, analyseert u verschillende trilharenparameters, zoals lengtes en intensiteiten, met behulp van de algemene analyse drie tool. Selecteer afbeelding in het menu en klik op nieuw GA3-recept. Er wordt een nieuw venster geopend met een lege ruimte in het midden.GA3 detecteert automatisch de binaire bestanden die op de juiste manier zijn gelabeld volgens de AI en bevat het bijbehorende knooppunt. GA3 detecteert ook automatisch de kanalen in de afbeeldingen en geeft hun tabbladen weer onder kanalen. De AI segmenteert alle trilharenachtige objecten in het frame en detecteert onvolledige trilharen langs de randen van het frame.Als u ze wilt verwijderen, selecteert u binaire verwerking, verwijdert u objecten en sleept u het knooppunt met aanraakranden naar de lege ruimte en verbindt u het knooppunt met de juiste binaire bestanden. Als u de lengte van trilharen wilt meten, selecteert u de grootte van het meetobject en vervolgens de lengte. Sleep de parameter naar het midden en maak verbinding met het juiste binaire knooppunt.Als u trilharenintensiteiten wilt meten, selecteert u een objectintensiteit. Sleep de parameter naar het midden en maak verbinding met het juiste binaire knooppunt en het juiste interessante kanaal. Ga in het meetmenu naar objectratiometrie en selecteer de coëfficiënt van Mander om de colocalisatieroute in GA3 in te stellen door de overlap van twee kanalen binnen individuele trilharen te meten.Sleep het coëfficiëntknooppunt van de Mander in de lege ruimte en sluit het aan op de juiste binaire en kanalen. Verontschuldig de metingen en de enkele tabel door het menu gegevensbeheer te openen. Selecteer in de basiscategorie de kolom ApEn en klik vervolgens op Nu uitvoeren om trilharen te meten.Alle metingen worden weergegeven in één uitvoertabel. De representatieve beelden laten zien dat de getrainde AI in vitro trilharen goed identificeerde in de beelden van IMCD-cellen, primaire hypothalamische culturen en hippocampusculturen, maar geen andere niet-ciliaire structuren zoals cytokinetische bruggen. De lengte van de trilharen varieerde van 0,5 tot 4,5 micrometer in IMCD-cellen en twee tot 12 micrometer in de hypothalamische en hippocampuscultuur.De AI mat de lengtes van AC3 gelabelde trilharen in vivo in de beelden van onze boogvormige kern, paraventriculaire kern en cornu ammonis één regio. Volgens de analyse varieerden hypothalamische trilharen in vivo van één tot 15 micrometer, zoals te zien in witte en bruine balken. Terwijl trilharen en het cornu ammonis-gebied varieerden van één tot 10 micrometer, zoals te zien in grijze balken.Interessant is dat de intensiteit van de ciliaire MCHR1 sterker was in de paraventriculaire kern dan die in de boogvormige kern. De intensiteiten van MCHR1 tegen AC3 werden uitgezet om hun overlap te meten. De meerderheid van de trilharen was positief voor beide markers, terwijl sommige trilharen positief waren voor AC3 of MCHR1.Om de colokalisatie van MTHR1 binnen AC3 te kwantificeren, werd de overlapcoëfficiënt van Mander gemeten en was er een significante toename van de overlap in de paraventriculaire kern dan in de boogvormige kern. Om de intensiteit langs de lengte van de trilharen te meten, werd de polariteit van trilharen gedefinieerd met behulp van Centrin2-GFP als de basale lichaamsmarker. Dit maakte het mogelijk om de basis van trilharen te onderscheiden van de uiteinden van ARL13B-M kersenpositieve trilharen.Veranderingen in ARL13B-intensiteit langs de lengte van trilharen werden waargenomen waarbij de ARL13B-intensiteit hoger was aan de basis dan aan de punt van het cilium in boogvormige kern, gezien aan de linkerkant, evenals PVN, zoals te zien aan de rechterkant. Bij het analyseren van gegevens met deze aanpak is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de kwaliteit en resolutie van de experimentele dataset consistent is met die welke wordt gebruikt om AI te trainen. Het belangrijkste nut van deze aanpak is dat na het detecteren van trilharen door AI, de gebruiker creatief kan zijn over welke eigenschappen worden geanalyseerd door de analyseworkflow aan te passen die in de software is geïntegreerd.

Research

JoVE Journal

Biology

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

Oogsten Sperma en kunstmatige inseminatie van Muizen

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals.  Peromyscus species are used in a wide range of research ...

Experimental Approaches to Tissue Engineering

Experimentele benaderingen van Tissue Engineering

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Voorbereiding van de Kunstmatige dubbellagen voor Elektrofysiologie Experimenten

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Analyse van gen-functie en visualisatie van Cilia-gegenereerde Fluid Flow in Blaasjes Kupffer&#39;s

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Het beoordelen Soortspecifieke Bijdragen aan craniofaciale ontwikkeling met behulp van Quail-eend Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Experimentele benaderingen om te studeren mitochondriale lokalisatie en functie van een nucleair celcyclus Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Met behulp van microfluïdische apparaten te meten Levensduur en Cellulaire Phenotypes in Single Budding gistcellen

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro en In Vivo benaderingen te bepalen van intestinale epitheliale cel permeabiliteit

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetische-geactiveerde cel sorteren van strategieën om te isoleren en zuiveren van de synoviale vloeistof afkomstige mesenchymale stamcellen uit het Model van een konijn

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Eenvoudige detectie van primaire trilharen door immunofluorescentie

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...