Name: artificial intelligence approaches to assessing primary cilia
Uploaded: 2021-05-01T14:00:00
Duration: 8 min 58 s
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Diese Arbeit wurde vom National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases R01 DK114008 an NFB und dem American Heart Association Fellowship Grant #18PRE34020122 an RB finanziert. Wir danken Rich Gruskin, General Manager von Nikon Software, Melissa Bentley, Courtney Haycraft und Teresa Mastracci für aufschlussreiche Kommentare zum Manuskript.

1. Raw-Bilder erfassen
<ol><li>Fixieren und immunomarkieren Sie Proben nach Bedarf20.<ol>
<li>Bildzilien mit einem konfokalen Mikroskop bei maximaler Bittiefe bei gleicher Pixelgröße mit Nyquist-Auflösung.</li>
		<li>Exportieren Sie Bilder als monochrome Tagged Image Format (.tif)-Dateien. HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt, wie das Ai-Modul speziell in der NIS Elements-Software verwendet wird. Wenn Bilder als .nd2-Dateien aufgenommen wurden, ist es nicht erforderlich, Bilder als .tif Dateien zu exportieren, und der Benutzer kann direkt mit Schritt 2.3 fortfahren. Wenn Bilder auf einem anderen System erworben wurden, kann eine NIS Elements-Lizenz separat erworben werden und .tif Dateien können wie in den nächsten Schritten beschrieben konvertiert werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Trainiere Ai, um Zilien zu identifizieren
<ol><li>Öffnen Sie das Trainingsdataset.<ol>
<li>Wählen Sie ca. 50 Beispielbilder mit mindestens einem Cilium pro Frame aus, um die Software zu trainieren und in einen einzigen Ordner zu kopieren. Dieser Ordner wird verwendet, um die Software beim Öffnen der Bilder zu leiten. Öffnen Sie diese 50 Frames innerhalb eines einzelnen ND2-Dokuments mit mindestens einem Cilium pro Frame. Wählen Sie Datei > Importieren/Exportieren > ND-Datei aus Dateisequenz erstellen.</li>
		<li>Wählen Sie den Ordner aus, der das Trainingsdataset enthält. Dadurch wird die Liste der Dateien in der Mitte des Dialogfensters geöffnet. Definieren Sie die Organisation der Dateien manuell mit mindestens einer Option im Dropdown-Menü oben. Die Optionen sind Multipoint (für mehrere maximale Projektionsdateien), Z-Serie (für ein Z-Stapelbild), Zeit (für ein Zeitrafferbild) und Wellenlänge (für Dateien aus mehreren Kanälen).</li>
		<li>Geben Sie die entsprechenden numerischen Werte unter jeder ausgewählten Option ein. Wählen Sie Keine aus, wenn die Optionen nicht ausgewählt sind. Klicken Sie auf Konvertieren, um das ND-Dokument zu öffnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kalibrieren Sie Bilder.<ol>
<li>Geben Sie die Pixelgröße in die untere linke Ecke des Bildes ein: Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Unkalibrierte > Dokument > Pixelgröße kalibrieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identifizieren Sie Zilien.<ol>
<li>Identifizieren Sie die Zilien von Hand, indem Sie einzelne Ziliarstrukturen auf allen geöffneten Frames mitHilfe von AutoDetect oder Draw Object in der Binären Symbolleistepräzise nachzeichnen. Dadurch werden binäre Masken auf die Objekte von Interesse gezogen. Diese Binärdateien werden als Beispielobjekte dienen, um die Software zu trainieren, Zilien anhand pixelbasierter Merkmale in zukünftigen experimentellen Bildanalysen zu identifizieren. Wählen Sie > Analysesteuerelemente > binären Symbolleiste > Objekt zeichnen aus. HINWEIS: Entfernen Sie alle Frames, die keine Binärdateien haben, da die Software nicht mit dem Training beginnt, es sei denn, sie ist in der Lage, Binärdateien auf allen geöffneten Frames zu erkennen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zug Ai.<ol>
<li>Beginnen Sie mit dem Training der Software. Dadurch wird die Segment.ai-Box des Zuges geöffnet. Wählen Sie NIS.ai > Train Segment.aiaus.</li>
		<li>Wählen Sie im Feld Segment.ai trainieren den Quellkanal aus, der für das Training verwendet werden soll. Wenn Dateien aus mehreren Kanälen geöffnet sind, wählen Sie nur einen Kanal als Quellkanal aus. Wählen Sie dann die entsprechenden Ground-Truth-Binärdateien aus, auf denen Sie die Ai trainieren möchten. Wählen Sie schließlich die Anzahl der Iterationen aus, die zum Trainieren der AI erforderlich sind, abhängig von der Größe und Verteilung der Binärdateien. HINWEIS: Wenn die Binärdateien in der Umgebung leicht erkennbar und gut über das Bild verteilt sind, benötigt die Software möglicherweise weniger als 1000 Iterationen, um zur Identifizierung der Bilder trainiert zu werden. Wenn die Bilder ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis aufweisen, ist es ideal, während des Trainings mindestens 1000 Iterationen auszuführen, damit die Ai Zilien in Testproben mit hoher Zuverlässigkeit identifizieren kann.</li>
		<li>Wählen Sie den Zielordner aus, um die trainierte AI-Datei (.sai) zu speichern, und klicken Sie auf Trainieren, um die Software zu trainieren. Die Software trainiert nun selbst, um Zilien anhand der verfolgten Binärdateien zu identifizieren. Dieser Vorgang dauert mehrere Stunden. HINWEIS: Während des Trainings zeigt die Software ein Diagramm an, das den Trainingsverlust anzeigt. Die Grafik zeigt zunächst eine Spitze, bevor sie sich auf idealerweise etwa 1% Verlust verjüngt, wo sie für den Rest des Trainings ein Plateau erreicht. Speichern Sie das Diagramm zur späteren Bezugnahme, indem Sie das Kontrollkästchen Diagramm-Screenshot speichern im Feld Train Segment.ai aktivieren (Ergänzende Abbildung 1).</li>
		<li>Wenn eine weitere Verfeinerung des Trainings erforderlich ist, setzen Sie das Training mit demselben Datensatz fort. Alternativ können Sie an einem neuen Datensatz mit genau denselben Parametern trainieren. Es ist nicht ratsam, eine bereits trainierte Ai an einem neuen Datensatz mit unterschiedlichen Parametern oder unterschiedlichen Objekten von Interesse zu trainieren. Wählen Sie Train segment.ai > Continue Training On > Wählen Sie Trained AI Fileaus.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Identifizieren Sie Zilien mit trainiertem Ai
<ol><li>Öffnen Sie das experimentelle Dataset.<ol>
<li>Öffnen Sie die experimentellen konfokalen Bilder von Zilien in der Software, indem Sie die Beispieldateien .tif in .nd2-Dateien konvertieren, ähnlich wie in Schritt 2.1. Wählen Sie Datei > Importieren/Exportieren > ND-Datei aus Dateisequenz erstellen. HINWEIS: Die Bilder sollten die gleiche Pixelgröße haben wie diejenigen, die für das Training der Ai verwendet werden. Wenn Bilder bereits im ND2-Format vorliegen, fahren Sie mit Schritt 3.3 fort.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kalibrieren Sie Bilder.<ol>
<li>Geben Sie die Pixelgröße in der unteren linken Ecke des Bildes ein. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf unkalibrierte > Dokument > Pixelgröße kalibrieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie die trainierte Ai für die geöffneten Dateien aus.<ol>
<li>Beginnen Sie, die Zilien mit Ai zu identifizieren. Die Software zeichnet nun Binärdateien auf den Zilien basierend auf dem Training, das sie im vorherigen Schritt erhalten hat. Dieser Vorgang dauert einige Sekunden. Wählen Sie NIS.ai > Segment.aiaus. HINWEIS: Die Software fordert Sie auf, den Kanal auszuwählen, wenn mehrere Kanäle geöffnet sind. Kanäle werden hier nach ihren jeweiligen Namen aufgelistet. Wenn nicht, wird das Kästchen "Mono" automatisch ausgewählt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Überprüfen Sie Bilder auf falsch identifizierte Binärdateien.<ol>
<li>Sobald die Ai Zilien identifiziert und Binärdateien gezeichnet hat, überprüfen Sie die Bilder auf falsch identifizierte Objekte. Löschen Sie bei Bedarf alle falsch identifizierten Binärdateien manuell. Wählen Sie > Analysesteuerelemente > binären Symbolleiste > Objekt löschen aus.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Messung der Länge und Intensität der Zilien
<ol><li>Erstellen Sie ein neues Allgemeines Analyse 3 (GA3)-Rezept.<ol>
<li>Nachdem die Zilien identifiziert und segmentiert wurden, analysieren Sie verschiedene Parameter der Zilien wie Längen und Intensitäten mit dem GA3-Tool. Dadurch wird ein neues Fenster mit einem leeren Feld in der Mitte geöffnet, in dem die Analyse definiert wird. Wählen Sie Bild > Neues GA3-Rezeptaus. 
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wählen Sie die zu analysierenden Binärdateien aus.<ol>
<li>Da die Zilien bereits mit Segment.ai segmentiert sind, erkennt GA3 automatisch die entsprechend dem Ai gekennzeichneten Binärdateien und schließt den Knoten ein. Wählen Sie'Binaries > Auto Detect_AI' oder 'Binaries > Draw Object_AI'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wählen Sie die für die Analyse erforderlichen Kanäle aus. GA3 erkennt auch automatisch die Kanäle in den Bildern und zeigt ihre Registerkarten unter Kanäle an.</li>
	<li>Entfernen Sie Objekte, die den Rahmen des Rahmens berühren.<ol>
<li>Da die Ai alle Zilien wie Objekte im Rahmen segmentiert, erkennt sie auch unvollständige Zilien entlang der Ränder des Rahmens. Diese Objekte können entweder manuell in Schritt 3.4 oder automatisch in GA3 entfernt werden. Wählen Sie Binärverarbeitung > Objekte entfernen > Rahmen berühren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wählen Sie Parameter aus, um Zilien zu messen.<ol>
<li>Ziehen Sie die zu messenden Parameter wie Zilienlänge (Länge) und Intensitäten (Summe Objektintensität) per Drag & Drop ab. Verbinden Sie die Knoten mit dem entsprechenden Binärknoten (Verbindung A) und Kanalknoten (Verbindung B). Bewegen Sie den Mauszeiger über die Knotenverbindung, um eine QuickInfo anzuzeigen, zu welcher Verbindung der Knoten gehört. Wählen Sie "Messung > Objektgröße > -länge" und "Messung" > "Objektintensität > "Summe Obj-Intensität"aus. HINWEIS: Die Knotenlänge verbindet sich nur mit dem Binärknoten, während Sum Obj Intensity sowohl mit dem Binär- als auch mit dem Kanalknoten verbunden ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie die Maße in einer einzigen Tabelle an.<ol>
<li>Kombinieren Sie alle Messungen in einer einzigen Ausgabetabelle, indem Sie den Knoten ziehen und ablegen Spalte an das Analyseflussdiagramm anhängen und mit den Messknoten Länge und Summe Obj Intensitätverbinden. Wählen Sie Data Management > Spalte Basic > Append aus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Messen Sie Zilien.<ol>
<li>Messen Sie Zilien, indem Sie auf Ausführenklicken. Dieser Prozess dauert einige Augenblicke, um alle Zilien in den experimentellen Bildern zu messen. Die Längen und Intensitäten werden in einem neuen Fenster Analyseergebnisse angezeigt. HINWEIS: Die Tabelle kann manchmal Daten von Masken enthalten, die Ai als Zilien erkannte, aber zu klein waren, um vom menschlichen Auge erkannt und in Schritt 3.4 eliminiert zu werden. Diese Objekte können vor der statistischen Analyse mithilfe eines Filters aus dem Datensatz entfernt werden. Hier wurde ein Filter von 1 μm für In-vitro-Zilienlängenmessungen in Abbildung 2 und 2 μm für In-vivo-Zilien verwendet. Dies kann vor dem Exportieren von Daten über den folgenden Pfad erfolgen. Wählen Sie das Fenster Analyseergebnisse > Filter definieren > Wert eingeben > Filter verwenden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exportieren Sie Daten für statistische Analysen.</li>
</ol>5. Kolokalisierungsstudien
HINWEIS: Die Kolokalisationsanalyse kann in dasselbe GA3-Rezept aufgenommen werden, das für Messungen der Zilienlängen- und Intensitätsanalyse verwendet wird. Wenn Sie dasselbe Rezept verwenden, öffnen Sie dateien wie unten beschrieben und messen Sie die Längen und Intensitäten beider Kanäle zusammen mit den Kolokalisierungskoeffizienten in derselben Analysepipeline.
<ol><li>Öffnen Sie das experimentelle Dataset.<ol>
<li>Öffnen Sie die experimentellen konfokalen Bilder von Zilien in der Software, indem Sie die Beispieldateien .tif in .nd2-Dateien konvertieren. Wählen Sie Datei > Importieren/Exportieren > ND-Datei aus Dateisequenz erstellen.</li>
		<li>Wählen Sie im Popup-Fenster die Monochrom-Dateien mit 16 Bit Tiefe aus allen gewünschten Kanälen aus dem Fenster-Explorer aus, der sich in der ersten Spalte des Popup-Fensters befindet. Wählen Sie Multipoint oder Z Series aus dem ersten Dropdown-Menü und geben Sie einen Wert ein, der der Gesamtzahl der Bilder bzw. Stacks entspricht.</li>
		<li>Wählen Sie im zweiten Dropdown-Feld Wellenlänge aus, und ändern Sie den Wert in die Gesamtzahl der Kanäle im Ordner. Die Software entsperrt automatisch ein Wellenlängenauswahlfenster am unteren rechten Ende des Popup-Fensters. Verwenden Sie das Dropdown-Menü Farbe, um die Farbe der einzelnen Kanäle auszuwählen. Geben Sie jedem Kanal in der Spalte Name einen anderen Namen an. Sobald alle Informationen aktualisiert wurden, klicken Sie auf Konvertieren. Die Software generiert automatisch eine All-Image-Datei, die mit allen einzelnen Bildern aus allen ausgewählten Kanälen überlagert ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalibrieren Sie Bilder.<ol>
<li>Geben Sie die Pixelgröße in der unteren linken Ecke des Bildes ein. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf unkalibrierte > Dokument > Pixelgröße kalibrieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie die trainierte AI auf dem ersten Kanal aus.<ol>
<li>Beginnen Sie mit der Identifizierung der Zilien auf einem der geöffneten Kanäle (z. B. ACIII; Abbildung 5A) mit Ai. Die Software zeichnet nun Binärdateien auf ACIII-gekennzeichneten Zilien basierend auf dem Training, das sie für diesen Kanal erhalten hat. Dieser Vorgang dauert einige Sekunden. Wählen Sie NIS.ai > Segment.ai > Quellkanäle > ACIIIaus.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie das trainierte Ai auf dem zweiten Kanal aus.<ol>
<li>Beginnen Sie mit der Identifizierung der Zilien auf dem anderen geöffneten Kanal (z. B. MCHR1; Abbildung 5B) mit Ai. Die Software zeichnet nun Binärdateien auf MCHR1-gekennzeichneten Zilien basierend auf dem Training, das sie für diesen Kanal erhalten hat. Dieser Vorgang wird einige Augenblicke in Anspruch nehmen. Wählen Sie NIS.ai > Segment.ai > Quellkanäle > MCHR1aus.</li>
	</ol></li>
	<li>Überprüfen Sie Bilder auf falsch identifizierte Binärdateien.<ol>
<li>Sobald die Ai Zilien identifiziert und Binärdateien gezeichnet hat, überprüfen Sie die Bilder auf falsch identifizierte Objekte. Löschen Sie bei Bedarf alle falsch identifizierten Binärdateien manuell. Wählen Sie > Analysesteuerelemente > binären Symbolleiste > Objekt löschenaus.
</li>
	</ol></li>
	<li>Erstellen Sie ein neues GA3-Rezept.<ol>
<li>Nachdem die Zilien identifiziert und segmentiert wurden, fahren Sie mit der Kolokalisierungsanalyse mit dem GA3-Tool fort. Dadurch wird ein neues Fenster mit einem leeren Feld in der Mitte geöffnet, in dem die Analyse definiert wird. Ein Fenster mit allen identifizierten Binärdateien und Kanälen wird generiert. Stellen Sie sicher, dass alle gewünschten Kanäle und Binärdateien, die für die Analyse erforderlich sind, vorhanden und ausgewählt sind. Wählen Sie Bild > Neues GA3-Rezeptaus.</li>
	</ol></li>
	<li>Entfernen Sie Objekte, die den Rahmen des Rahmens berühren.<ol>
<li>Da die Ai alle zilienartigen Objekte im Rahmen segmentiert, erkennt sie auch unvollständige Zilien entlang der Ränder des Rahmens. Diese Objekte können entweder manuell in Schritt 5.5 oder automatisch in GA3 entfernt werden. Wählen Sie Binärverarbeitung > Objekte entfernen > Rahmen berührenaus.
</li>
	</ol></li>
	<li>Richten Sie den Kolokalisierungspfad in GA3 ein.<ol>
<li>Um die Überlappung der beiden Kanäle innerhalb der Zilien zu messen, verwenden Sie manders Koeffizientenkorrelation. Ziehen Sie den Knoten Manders Coefficient per Drag & Drop in den leeren Raum des GA3-Rezepts und verbinden Sie ihn mit der entsprechenden Binärdatei und den entsprechenden Kanälen. Hier verbindet sich "Verbindung A" mit der ACIII-Binärdatei, "Verbindung B" mit dem MCHR1-Kanal und "Verbindung C" mit dem ACIII-Kanal, um die Überlappung von MCHR1 innerhalb der ACIII-Binärdatei zu bestimmen. Wählen Sie "Messung > Objektverhältnismetrie" > "Manders-Koeffizient"aus. HINWEIS: Die Software ermöglicht die Messung der Kolokalisation unter Verwendung der Pearson-Koeffizienten-Korrelation mit den gleichen Schritten wie in diesem Protokollbeschrieben 40.</li>
	</ol></li>
	<li>Fügen Sie die Maße in einer einzigen Tabelle an.<ol>
<li>Kombinieren Sie alle Messungen in einer einzigen Ausgabetabelle. Wählen Sie Data Management > Spalte Basic > Append aus.</li>
	</ol></li>
	<li>Messen Sie die Kolokalisierung.<ol>
<li>Messen Sie Zilien, indem Sie auf Ausführenklicken. Dieser Prozess dauert einige Augenblicke, um alle Zilien in den experimentellen Bildern zu messen. Die Daten werden in einem neuen Fenster Analyseergebnisse angezeigt.</li>
	</ol></li>
	<li>Exportieren Sie Daten für statistische Analysen.</li>
</ol>

Co-Autor Wesley Lewis ist ein Mitarbeiter von Nikon. Es gibt keine finanziellen Offenlegungen.

Längen- und Intensitätsmessungen sind gängige Methoden zur Analyse primärer Zilien, es gibt jedoch keine standardisierte konventionelle Methode, die im Feld verwendet wird. Die Identifizierung und Quantifizierung primärer Zilien mit Software wie ImageJ ist zeitaufwendig und anfällig für Benutzerverzerrungen und -fehler. Dies macht es schwierig, große Datensätze genau zu analysieren. Hier zeigen wir, dass die Verwendung eines AI-Programms viele dieser Herausforderungen überwinden kann, so dass eine Hochdurchsatzanalyse der primären Zilien möglich ist. Hierin beschreiben wir das Verfahren zum Trainieren einer Ai-basierten Anwendung zur Erkennung primärer Zilien und skizzieren die Schritte, die zur Analyse von Länge und Intensität erforderlich sind.
Während das anfängliche Training der Ai zur Erkennung von Zilien viel Zeit vom Benutzer erfordert, kann es nach Abschluss für jeden Datensatz verwendet werden, der mit den gleichen Parametern erfasst wurde. Die von der Ai erzeugte Binärmaske ist so veränderbar, dass Fehler korrigiert werden können. Fehler bei der Identifizierung von Zilien sollten dem Benutzer jedoch signalisieren, dass die AI mit zusätzlichen Bildern weiter trainiert werden muss. Ein großer Vorteil dieser Methode ist, dass die Ai trainiert werden kann, Zilien in verschiedenen Probentypen sowohl in 2D als auch in 3D zu erkennen. Frühere Analysemethoden, die in Laboren generiertwurden,haben verschiedene Einschränkungen, einschließlich der Anforderung manueller Schwellenwerte zur Identifizierung und Problemen bei der Identifizierung von Zilien, die aus Gewebeschnitten mit hoher Zelldichte von36,46,47 abgebildetwurden. Diese Methoden sind auch auf die Zilienanalyse spezialisiert, während die Analyse mit der NIS Elements-Software mehrere Aspekte der Bilder gleichzeitig auswerten kann. Da das hier beschriebene Ai Teil des NIS Elements-Softwarepakets ist, können Bilder, die mit einem Nikon-Mikroskop aufgenommen wurden, einfach bis zur Analyse fortgesetzt werden. Für die Verwendung dieser Methode ist jedoch keine Bildgebung mit Nikon erforderlich. Unabhängig vom erfassten Rohdatendateiformat können ".tif"-Dateien von NIS Elements geöffnet werden, um sie in der Ai zu verwenden.
Diese AI-Anwendung innerhalb von NIS Elements ist weit verbreitet und möglicherweise bereits Teil der Bildanalysesoftware, die von Labors verwendet wird, die primäre Zilien untersuchen. Mit der zunehmenden Verbreitung der AI-Technologie können andere Bildgebungssoftware ihre Analyseoptionen um ein ähnliches AI-Modul erweitern. Die Anwendung der Ai-Analyse zur Identifizierung von Zilien kann für verschiedene Aspekte der Zilienanalyse verwendet werden. Während wir Methoden für einige einfache Analysen wie Länge (Abbildung 2 und 3), Intensität (Abbildung 4) und Kolokalisierung (Abbildung 5) skizziert haben, kann dem GA3-Analyse-Workflow wie in Abbildung 6eine ausgefeiltere Analyse hinzugefügt werden. Anstatt beispielsweise die Intensität eines vollständigen Ciliums zu messen, können Intensitätsunterschiede innerhalb einer Subregion eines Ciliums von Interesse sein, um die subziliare Lokalisation zu beurteilen. Intensitätsunterschiede innerhalb einer Subregion eines Ciliums könnten darauf hindeuten, dass sich das Protein an der Spitze oder an der Basis des Ciliums ansammelt, wie z.B. wie Gli-Proteine an der Spitze der Zilien angereichert sind48. Darüber hinaus kann diese Ai-Anwendung verwendet werden, um Unterschiede zwischen Genotypen oder Behandlungsgruppen leicht zu identifizieren. Während unser Labor diese Methode hauptsächlich zur Analyse von Zilien verwendet, die aus Hirnschnitten oder neuronalen Kulturen stammen, kann sie auf Bilder aus verschiedenen Zelllinien oder anderen Gewebetypen angewendet werden. Die Flexibilität des Probentyps, für den diese Anwendung verwendet werden kann, macht diese Analysemethode für viele verschiedene Gruppen wertvoll, die primäre Zilien oder diskrete Organellen untersuchen, die bewertet werden, wie Mitochondrien, Kern oder ER.

Primäre Zilien sind Sinnesorganellen, die aus den meisten Säugetierzelltypen1,2,3,4herausragen. Sie sind im Allgemeinen einzelgängerische Anhängsel, die für die Koordination verschiedener Zellsignalwege durch die Integration extrazellulärer Signale5,6,7entscheidend sind. Primäre Zilien spielen eine wichtige Rolle während der Embryonalentwicklung und der Homöostase des erwachsenen Gewebes, und eine Störung ihrer Funktion oder Morphologie ist mit mehreren genetischen Störungen verbunden, die zusammen als Ziliopathien bezeichnet werden. Aufgrund der nahezu allgegenwärtigen Natur von Zilien sind Ziliopathien mit einer Vielzahl von klinischen Merkmalen verbunden, die alle Organsysteme beeinflussen können8,9,10,11,12. In Tiermodellen von Ziliopathien manifestiert sich der Verlust der Ziliarstruktur oder Signalfähigkeit in mehreren klinisch relevanten Phänotypen, einschließlich Hyperphagie-assoziierter Adipositas3,13,14,15. In vielen Modellsystemen wurde gezeigt, dass Änderungen der Zilienlänge ihre Signalfähigkeit und Funktionenbeeinflussen 16,17,18,19. Es gibt jedoch mehrere zeitaufwändige und technische Herausforderungen, die mit der genauen und reproduzierbaren Beurteilung der Länge und Zusammensetzung der Zilien verbunden sind.
Das zentralnervöse System (ZNS) der erwachsenen Säugetiere ist ein biologischer Kontext, der eine Herausforderung für das Verständnis der Morphologie und Funktion der Zilien darstellt. Während es scheint, dass Neuronen und Zellen im gesamten ZNS Zilien besitzen, bleibt aufgrund der begrenzten Werkzeuge und Fähigkeiten, diese Zilien zu beobachten und zu analysieren, ein Verständnis ihrer Funktionen schwer fassbar20. Zum Beispiel markiert der prototypische Zilienmarker, acetyliertes α-Tubulin, keine neuronalen Zilien20. Die Schwierigkeit, diese Zilien zu untersuchen, wurde teilweise durch die Entdeckung mehrerer G-Protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCR), Signalmaschinen und membranassoziierter Proteine gelöst, die auf der Membran neuronaler Zilien angereichert sind21,22. All diese einfachen Grundbeobachtungen deuten auf die Bedeutung und Vielfalt der ZNS-Zilien hin, die bisher von anderen Geweben beispiellos zu sein scheint. Zum Beispiel kann eine Variation der Zilienlänge und der GPCR-Lokalisation im gesamten Gehirn beobachtet werden, wobei die Längen in bestimmten neuronalen Kernen im Vergleich zu anderen Kernen unterschiedlich sind19,23. In ähnlicher Weise zeigen ihr GPCR-Gehalt und ihre Signalmaschinerie eine Vielfalt basierend auf der neuroanatomischen Lage und dem neuronalen Typ2,24,25,26,27,28,29. Diese einfachen Beobachtungen zeigen, dass die Länge und Zusammensetzung der ZILIEN bei Säugetieren streng reguliert ist, genau wie in Modellorganismen wie Chlamydomonas reinhardtii, aber der Einfluss dieser Längenunterschiede auf die Zilienfunktion, die Signalgebung und letztendlich das Verhalten bleibt unklar16,30,31,32.
Die genaue Messung der Länge und Zusammensetzung der Zilien erweist sich als technische Herausforderung, die anfällig für Benutzerfehler und Irreproduzierbarkeit ist. Derzeit werden Zilien in vivo und in vitro am häufigsten mit immunfluoreszierenden Ansätzen identifiziert, die Ziliarproteine oder mit Zilien angereicherte fluoreszierende Reporterallele33,34,35markieren. Die Längen dieser fluoreszenzmarkierten Zilien werden dann aus einem 2-dimensionalen (2D) Bild mit Linienmesswerkzeugen in Bildanalyseprogrammen wie ImageJ36gemessen. Dieser Prozess ist nicht nur mühsam und arbeitsintensiv, sondern auch anfällig für Verzerrungen und Fehler. Dieselben Hindernisse treten bei der Messung der Zilienintensitäten auf, die auf Veränderungen in der Zilienstruktur hinweisen37. Um die Inkonsistenzen bei diesen Arten von Bildanalysen zu minimieren, werden Programme der künstlichen Intelligenz (AI) immer häufiger und erschwingliche Optionen38.
Ai ist die Weiterentwicklung von Computersystemen, die den Vorteil von Computeralgorithmen und Programmierung nutzen, um Aufgaben auszuführen, die normalerweise menschliche Intelligenz erfordern würden39. KI-Geräten wird beigebracht, wiederkehrende Muster, Parameter und Merkmale wahrzunehmen und Maßnahmen zu ergreifen, um die Chancen auf erfolgreiche Ergebnisse zu maximieren. Ai ist vielseitig und kann trainiert werden, um bestimmte Objekte oder Strukturen von Interesse, wie z. B. Zilien, zu erkennen und dann so programmiert zu werden, dass eine Vielzahl von Analysen an den identifizierten Objekten durchgeführt werden. Daher können komplexe Bilddaten durch Ai38schnell und reproduzierbar erzeugt werden. Automatisierung und KI-Analyse der aufgenommenen Bilder erhöhen die Effizienz und Effizienz und begrenzen gleichzeitig potenzielle menschliche Fehler undVerzerrungen 39. Die Etablierung einer Ai-basierten Methodik zur Identifizierung von Zilien schafft eine konsistente Möglichkeit für alle Forschungsgruppen, Ziliendaten zu analysieren und zu interpretieren.
Hier verwenden wir ein Ai-Modul, um Zilien sowohl in vivo als auch in vitro auf 2D-Bildern zu identifizieren. Anhand einer Reihe von Beispielbildern wird die Ai darauf trainiert, Zilien zu identifizieren. Sobald das Training abgeschlossen ist, wird das designierte Ai verwendet, um eine binäre Maske über Ai identifizierte Zilien in einem Bild anzuwenden. Die von der AI angebrachten Binärdateien können bei Bedarf geändert werden, um sicherzustellen, dass alle Zilien in den Bildern ordnungsgemäß identifiziert werden und eine unspezifische Identifizierung ausgeschlossen wird. Nach der Verwendung der Ai zur Identifizierung von Zilien werden maßgeschneiderte allgemeine Analyseprogramme (GA) verwendet, um verschiedene Analysen wie die Messung der Zilienlänge und der Fluoreszenzintensität durchzuführen. Die gesammelten Daten werden in eine Tabelle exportiert, die leicht gelesen, interpretiert und für statistische Analysen verwendet werden kann (Abbildung 1). Der Einsatz von automatisierter Technologie und Ai zur Identifizierung von Zilien und zur Erzielung spezifischer Messungen zwischen experimentellen Gruppen wird zukünftige Studien unterstützen, die darauf abzielen, den Einfluss der ZNS-Zilienfunktion und -morphologie auf die Zell-Zell-Kommunikation und das Zellverhalten zu verstehen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Intel Xeon, 3.6 GHz, 32GB RAM</td>
			<td>Intel Corporation</td>
			<td>W-2123</td>
			<td>Processor used for running NIS Elements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements Software</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Ai and GA3 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadro RTX 4000 Graphics card</td>
			<td>NVIDIA Corporation</td>
			<td>Quadro RTX 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10 Professional 64-bit</td>
			<td>Microsoft Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Operating system used for running NIS Elements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Workstation</td>
			<td>HP Development Company, L.P.</td>
			<td>HP&#160;Z4G4</td>
			<td>Workstation used for running NIS Elements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

artificial intelligence approaches to assessing primary cilia

Zilien sind auf Mikrotubuli basierende zelluläre Anhängsel, die als Signalzentren für eine Vielzahl von Signalwegen in vielen Säugetierzelltypen fungieren. Die Zilienlänge ist stark konserviert, streng reguliert und variiert zwischen verschiedenen Zelltypen und Geweben und wurde direkt mit deren Signalfähigkeit in Verbindung gebracht. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass Zilien ihre Länge als Reaktion auf die Aktivierung von Ziliar-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren verändern. Die genaue und reproduzierbare Messung der Längen zahlreicher Zilien ist jedoch ein zeit- und arbeitsintensiver Vorgang. Aktuelle Ansätze sind auch fehler- und verzerrungsanfällig. Programme für künstliche Intelligenz (Ai) können verwendet werden, um viele dieser Herausforderungen aufgrund von Fähigkeiten zu bewältigen, die die Assimilation, Manipulation und Optimierung umfangreicher Datensätze ermöglichen. Hier zeigen wir, dass ein Ai-Modul trainiert werden kann, um Zilien in Bildern von in vivo- und in vitro-Proben zu erkennen. Nachdem wir das trainierte Ai zur Identifizierung von Zilien verwendet haben, sind wir in der Lage, Anwendungen zu entwerfen und schnell zu nutzen, die Hunderte von Zilien in einer einzigen Probe auf Länge, Fluoreszenzintensität und Co-Lokalisation analysieren. Dieser unvoreingenommene Ansatz erhöhte unser Selbstvertrauen und unsere Strenge beim Vergleich von Proben aus verschiedenen primären neuronalen Preps in vitro sowie über verschiedene Gehirnregionen innerhalb eines Tieres und zwischen Tieren. Darüber hinaus kann diese Technik verwendet werden, um die Ziliendynamik aus jedem Zelltyp und Gewebe mit hohem Durchsatz über mehrere Proben und Behandlungsgruppen hinweg zuverlässig zu analysieren. Letztendlich werden Ki-basierte Ansätze wahrscheinlich zum Standard werden, da sich die meisten Bereiche in Richtung weniger voreingenommener und reproduzierbarerer Ansätze für die Bildaufnahme und -analyse bewegen.

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Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia

Der Einsatz von künstlicher Intelligenz (Ai) zur Analyse von Bildern entwickelt sich im Vergleich zu häufig verwendeten Methoden zu einem leistungsfähigen, weniger voreingenommenen und schnellen Ansatz. Hier trainierten wir Ai, eine zelluläre Organelle, primäre Zilien zu erkennen und Eigenschaften wie Länge und Färbeintensität rigoros und reproduzierbar zu analysieren.

Künstliche Intelligenz Ansätze zur Beurteilung primärer Zilien

Cilia are microtubule based cellular appendages that function as signaling centers for a diversity of signaling pathways in many mammalian cell types. ...

Aktuelle Methoden der Zilienanalyse sind arbeitsintensiv und anfällig für Fehler und Verzerrungen. Unser Ansatz zielt darauf ab, Zeit und Aufwand zu rationalisieren und gleichzeitig potenzielle Fehler zu minimieren. Der Hauptvorteil, den diese Technik bietet, ist eine erhöhte Strenge und Reproduzierbarkeit und quantitative Bildanalyse.Diese Art von Ansatz ist nicht nur für die Zilienanalyse relevant, sondern kann auch auf viele zellbiologische Fragen angewendet werden, einschließlich derjenigen, die sich mit anderen Organellen und Zytoskelettproteinen befassen. Öffnen Sie zunächst das Trainings-Dataset, wählen Sie Datei aus dem Menü aus, klicken Sie auf Export importieren und wählen Sie ND-Datei aus Dateisequenz erstellen. Wählen Sie den Ordner aus, der den Trainingsdatensatz enthält, und die Liste der Dateien wird in der Mitte des Dialogfensters geöffnet.Definieren Sie die Organisation von Dateien manuell mit mindestens einer Option im Dropdown-Menü. Geben Sie die entsprechenden numerischen Werte unter jeder ausgewählten Option ein und wählen Sie keine aus, wenn optionen nicht ausgewählt sind. Klicken Sie auf Konvertieren, um das ND-Dokument zu öffnen.Um das Bild zu kalibrieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die option unkalibriert in der unteren linken Ecke des Bildes. Klicken Sie auf Dokument kalibrieren, klicken Sie dann auf Pixelgröße, geben Sie den Wert ein und klicken Sie auf OK. Wählen Sie die Steuerelemente für die Ansichtsanalyse aus, öffnen Sie die binäre Symbolleiste und wählen Sie automatische Erkennung oder Objekt zeichnen, um Zilien von Hand zu identifizieren, indem Sie einzelne Ziliarstrukturen auf allen geöffneten Rahmen präzise nachzeichnen.Um die KI zu trainieren, wählen Sie nis. ai, klicken Sie auf Zugsegment. ai, um das Zugsegment zu öffnen.ai box und wählen Sie dann den Quellkanal aus, der für das Training verwendet werden soll. Wählen Sie die entsprechenden GroundTruth-Binärdateien aus, um die KI zu trainieren. Wählen Sie die erforderliche Anzahl von Iterationen aus, um die KI in Abhängigkeit von der binären Größe und Verteilung zu trainieren, wählen Sie dann den Zielordner aus, um die trainierte KI-Datei zu speichern, und klicken Sie auf Trainieren, um die Software zu trainieren. Dieser Vorgang dauert mehrere Stunden.Öffnen Sie die experimentellen konfokalen Bilder von Zilien wie zuvor beschrieben, indem Sie die Probe konvertieren. TIF-Dateien in ND2-Dateien. Wählen Sie im Popup-Fenster Multipoint aus dem ersten Dropdown-Menü aus und geben Sie einen Wert ein, der der Gesamtzahl der Bilder entspricht.Wählen Sie im zweiten Dropdown-Feld Wellenlänge aus und ändern Sie den Wert in die Gesamtzahl der Kanäle im Ordner. Die Software entsperrt automatisch ein Wellenlängenauswahlfenster, das sich unten am rechten Ende des Popup-Fensters befindet. Verwenden Sie im Wellenlängenauswahlfenster das Dropdown-Menü Farbe, um die Farbe jedes Kanals auszuwählen.Geben Sie jedem Kanal unter der Spalte Name einen anderen Namen an. Sobald alle Informationen aktualisiert wurden, klicken Sie auf Konvertieren. Kalibrieren Sie die Bilder wie zuvor beschrieben.Stellen Sie sicher, dass die Pixelgröße des experimentellen Datasets mit der des Trainingsdatasets übereinstimmt. Identifizieren Sie Zilien auf dem ersten Kanal, indem Sie die trainierte KI aus dem vorherigen Schritt verwenden. Öffne nis.ai aus dem Menü, wählen Sie Segment. ai, und wählen Sie dann AC3 in den Quellkanälen aus. Identifizieren Sie dann die Zilien auf dem zweiten Kanal, indem Sie MCHR1 in den Quellkanälen auswählen.Die Software zeichnet Binärdateien auf den beschrifteten Zilien. Überprüfen Sie als Nächstes die Bilder auf falsch identifizierte Binärdateien. Wählen Sie objekt löschen in der binären Symbolleiste aus, um die falsch identifizierten Binärdateien manuell zu löschen.Sobald die Zilien identifiziert und segmentiert wurden, analysieren Sie verschiedene Zilienparameter wie Längen und Intensitäten mit dem allgemeinen Analyse-Drei-Tool. Wählen Sie das Bild aus dem Menü aus und klicken Sie auf Neues GA3-Rezept. Ein neues Fenster mit einem Leerzeichen in der Mitte wird geöffnet.GA3 erkennt automatisch die Binärdateien, die entsprechend der KI entsprechend gekennzeichnet sind, und schließt den entsprechenden Knoten ein. GA3 erkennt auch automatisch die Kanäle in den Bildern und zeigt ihre Registerkarten unter den Kanälen an. Die KI segmentiert alle Zilien wie Objekte im Rahmen und erkennt unvollständige Zilien entlang der Ränder des Rahmens.Alle Messungen werden in einer einzigen Ausgabetabelle angezeigt. Die repräsentativen Bilder zeigen, dass die trainierte KI Zilien in vitro in den Bildern von IMCD-Zellen, primären Hypothalamuskulturen und Hippocampuskulturen richtig identifiziert hat, aber keine anderen nicht-ziliarischen Strukturen wie zytokinetische Brücken. Die Länge der Zilien reichte von 0,5 bis 4,5 Mikrometern in IMCD-Zellen und zwei bis 12 Mikrometern in der Hypothalamus- und Hippocampuskultur.Die KI maß die Längen von AC3-markierten Zilien in vivo in den Bildern unseres bogenförmigen Kerns, paraventrikulären Kerns und Cornu Ammonis einer Region. Laut der Analyse reichten hypothalamische Zilien in vivo von einem bis 15 Mikrometern, wie in weißen und braunen Balken zu sehen. Während Zilien und die Cornu Ammonis-Region zwischen einem und 10 Mikrometern lagen, wie in grauen Balken zu sehen ist.Interessanterweise war die Intensität des Ziliar-MCHR1 im paraventrikulären Kern stärker als die im Bogenkern. Die Intensitäten von MCHR1 gegenüber AC3 wurden aufgetragen, um ihre Überlappung zu messen. Die Mehrheit der Zilien war für beide Marker positiv, während einige Zilien entweder für AC3 oder MCHR1 positiv waren.Um die Kolokalisation von MTHR1 innerhalb von AC3 zu quantifizieren, wurde manders Überlappungskoeffizient gemessen und es gab eine signifikante Zunahme der Überlappung im paraventrikulären Kern als im bogenförmigen Kern. Um die Intensität entlang der Länge der Zilien zu messen, wurde die Polarität der Zilien mit Centrin2-GFP als Basalmarker definiert. Dies ermöglichte es, die Basis der Zilien von den Spitzen der ARL13B-M Kirschpositivilien zu unterscheiden.Änderungen der ARL13B-Intensität entlang der Länge der Zilien wurden beobachtet, wobei die ARL13B-Intensität an der Basis höher war als an der Spitze des Ciliums im Bogenkern, links zu sehen, sowie PVN, wie rechts zu sehen. Bei der Analyse von Daten mit diesem Ansatz ist es wichtig sicherzustellen, dass die Qualität und Auflösung des experimentellen Datensatzes mit derjenigen übereinstimmt, die zum Trainieren der KI verwendet wird. Der Hauptnutzen dieses Ansatzes besteht darin, dass der Benutzer nach der Erkennung von Zilien durch KI kreativ sein kann, welche Eigenschaften analysiert werden, indem er den in die Software integrierten Analyse-Workflow anpasst.

Research

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