Name: artificial intelligence approaches to assessing primary cilia
Uploaded: 2021-05-01T14:00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia at JoVE.com

עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות R01 DK114008 ל- NFB ומענק מלגת איגוד הלב האמריקאי #18PRE34020122 ל- RB. אנו מודים לריץ' גרוסקין, המנהל הכללי של ניקון תוכנה, מליסה בנטלי, קורטני הייקראפט ותרזה מסלאצ'י על הערות תובנות על כתב היד.

1. לרכוש תמונות גולמיות
<ol><li>לתקן ודגימות אימונובל לפי הצורך20.<ol>
<li>ריסים של תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי בעומק סיביות מרבי באמצעות אותו גודל פיקסל עם רזולוציית Nyquist.</li>
		<li>יצא תמונות כקבצים בתבנית תמונה מתויגת בשחור-לבן (.tif). הערה: פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במודול AI במיוחד בתוך תוכנת רכיבי NIS. אם תמונות נרכשו כקבצי .nd2, ייצוא תמונות כקבצי .tif אינו נחוץ והמשתמש יכול להמשיך ישירות לשלב 2.3. אם נרכשו תמונות במערכת אחרת, ניתן לרכוש רישיון רכיבי NIS בנפרד וניתן להמיר קבצי .tif כמתואר בשלבים הבאים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. לאמן Ai לזהות cilia
<ol><li>פתח את ערכת נתוני האימון.<ol>
<li>בחר כ- 50 תמונות לדוגמה עם לפחותסיליום אחד לכל מסגרת כדי לאמן את התוכנה ולהעתיק אותן בתיקיה אחת. תיקיה זו משמשת לכוון את התוכנה בעת פתיחת התמונות. פתח 50 מסגרות אלה במסמך ND2 יחיד עם לפחותסיליום אחד לכל מסגרת. בחר קובץ > ייבוא/ייצוא > יצירת קובץ ND מרצף קבצים.</li>
		<li>בחר את התיקיה המכילה את ערכת נתוני האימון. פעולה זו תפתח את רשימת הקבצים במרכז חלון הדו-שיח. הגדר באופן ידני את ארגון הקבצים באמצעות אפשרות אחת לפחות בתפריט הנפתח לעיל. האפשרויות הן ריבוי נקודות (עבור קבצי הקרנה מרביים מרובים), סדרת Z (לתמונת מחסנית z), זמן (לתמונה של זמן-לשגות) ואורך גל (עבור קבצים מערוצים מרובים).</li>
		<li>הזן את הערכים המספריים המתאימים תחת כל אפשרות שנבחרה. בחר ללא בכל מקום שבו לא נבחרו אפשרויות. לחץ על המר כדי לפתוח את מסמך ND.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כייל תמונות.<ol>
<li>הזנת גודל הפיקסלים בפינה השמאלית התחתונה של התמונה: לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על מסמך > לכייל מסמך > גודל פיקסל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>זהה ריסים.<ol>
<li>זהה את הריסים באופן ידני על-ידי מעקב מדויק אחר מבני סילארי בודדים בכל המסגרות הפתוחות באמצעות זיהוי אוטומטי או ציור אובייקט בסרגל הכלים הבינארי. פעולה זו תמשוך מסיכות בינאריות על אובייקטי העניין. קבצים הבינאריים האלה ישמשו כאובייקטים לדוגמה לאימון התוכנה לזיהוי ריסים על מאפיינים מבוססי פיקסלים בניתוח תמונה ניסיוני עתידי. בחר הצג פקדי ניתוח > > סרגל הכלים הבינארי > צייר אובייקט. הערה: הסר כל מסגרת שאין בה מסגרות הקבצים הבינאריים מכיוון שהתוכנה לא תתחיל להתאמן אלא אם כן היא מסוגלת לזהות מסגרות ינריות בכל המסגרות הפתוחות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>רכבת Ai.<ol>
<li>התחל לאמן את התוכנה. זה יפתח את תיבת Segment.ai הרכבת. בחר Segment.ai רכבת NIS.ai >.</li>
		<li>בתיבה Segment.ai רכבת, בחר את ערוץ המקור שישמש להכשרה. אם קבצים מערוצים מרובים פתוחים, בחר ערוץ אחד בלבד כערוץ המקור. לאחר מכן בחר את הקבצים הבינאריים המתאימים של האמת הקרקעית שעליהם יש לאמן את הבינה מלאכותית. לבסוף בחר את מספר האיטרציות הדרושות כדי לאמן את ה- Ai בהתאם לגודל ולהתפלגות של הקבצים הבינאריים. הערה: אם הקבצים הבינאריים ניתנים לזיהוי בקלות מהסביבה ומופצים היטב ברחבי התמונה, ייתכן שהתוכנה תזדקק לפחות מ-1000 איטרציות כדי לעבור הכשרה לזיהוי התמונות. אם לתמונות יש יחס אות לרעש נמוך, מומלץ להפעיל לפחות 1000 איטרציות תוך כדי אימון כדי לאפשר ל- Ai לזהות ריסים בדגימות בדיקה בביטחון גבוה.</li>
		<li>בחר את תיקיית היעד כדי לשמור את קובץ ה- Ai המאומן ( .sai) ולחץ על התאמן כדי לאמן את התוכנה. התוכנה תמשיך כעת לאמן את עצמה לזהות ריסים בהתבסס על הקבצים הבינאריים במעקב. תהליך זה אורך מספר שעות. הערה: בעת אימון, התוכנה תציג גרף המציג אובדן אימון. הגרף יציג בתחילה עלייה חדה לפני התחדדות באופן אידיאלי סביב 1% הפסד שבו הוא מישורים למשך שארית האימונים. שמור את הגרף לעיון עתידי על-ידי סימון התיבה עבור שמור גרף צילום מסך בתיבה Segment.ai רכבת(איור משלים 1).</li>
		<li>אם נדרש שיפור נוסף בהכשרה, המשך להתאמן באותה ערכת נתונים. לחלופין, התאמן על ערכת נתונים חדשה עם אותם פרמטרים בדיוק. לא מומלץ להכשיר Ai שכבר הוכשר על ערכת נתונים חדשה עם פרמטרים שונים או אובייקטים שונים של עניין. בחר segment.ai > התאמן המשך להתאמן > בחר קובץ Ai מאומן.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. לזהות ריסים באמצעות Ai מאומן
<ol><li>פתח את ערכת הנתונים הניסיונית.<ol>
<li>פתח את תמונות הקונפוקליות הניסיוניות של cilia בתוכנה על-ידי המרת קבצי .tif לדוגמה לקבצי .nd2, בדומה לשלב 2.1. בחר קובץ > ייבוא/ייצוא > יצירת קובץ ND מרצף קבצים. הערה: התמונות צריכות להיות באותו גודל פיקסל כמו אלה המשמשות לאימון ה- Ai. אם התמונות כבר בתבנית ND2, דלג לשלב 3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כייל תמונות.<ol>
<li>הזינו את גודל הפיקסלים בפינה השמאלית התחתונה של התמונה. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על מסמך > לכייל > גודל פיקסל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפעל את ה- Ai המאומן בקבצים הפתוחים.<ol>
<li>התחל לזהות את הריסים באמצעות Ai. התוכנה תצייר כעת binaries על cilia בהתבסס על ההכשרה שהיא קיבלה בשלב הקודם. תהליך זה ייקח כמה שניות. בחר NIS.ai > Segment.ai. הערה: התוכנה תתבקש לבחור את הערוץ אם ערוצים מרובים פתוחים. הערוצים רשומים בשמותיהם כאן. אם לא, התיבה המסומנת 'מונו' תיבחר באופן אוטומטי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בדוק תמונות עבור עבירות עבירות מזוהות שגויות.<ol>
<li>לאחר שה- Ai זיהה ריסים ומסמכים binaries מצוירים, בדוק את התמונות עבור כל אובייקטים שזוהו בטעות. אם תרצה, מחק באופן ידני כל הקבצים הבינאריים שלא זוהו באופן שגוי. בחר הצג פקדי ניתוח > > סרגל הכלים הבינארי > מחק אובייקט.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. מדידת אורך ועוצמה של ריסים
<ol><li>צור מתכון חדש לניתוח כללי 3 (GA3).<ol>
<li>כעת, לאחר שהריסים זוהו ומפולחים, המשיכו לנתח פרמטרים שונים של ריסים כגון אורכים ועוצמות באמצעות הכלי GA3. פעולה זו תפתח חלון חדש עם שטח ריק במרכז שבו יוגדר הניתוח. בחר תמונה > מתכון GA3 חדש. 
</li>
	</ol>
</li>
	<li>בחר את הקבצים הבינאריים לניתוח.<ol>
<li>מכיוון שהריסים כבר מפולחים באמצעות Segment.ai, GA3 יזהה באופן אוטומטי את הקבצים הבינאריים המסומנים כראוי בהתאם ל- Ai ויכלול את הצומת. בחר'מסגרות הקבצים הבינאריים > Detect_AI אוטומטית' או 'מסגרות בין-אריות > צייר Object_AI'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בחר את הערוצים הדרושים לניתוח. GA3 גם יזהה באופן אוטומטי את הערוצים בתמונות ויציג את הכרטיסיות שלהם תחת ערוצים.</li>
	<li>הסר אובייקטים הנוגעים בגבול המסגרת.<ol>
<li>מאז Ai יהיה לפלח את כל cilia כמו אובייקטים במסגרת, זה גם יזהה cilia שלם לאורך הקצוות של המסגרת. ניתן להסיר אובייקטים אלה באופן ידני בשלב 3.4 או להסיר אותם באופן אוטומטי ב- GA3. בחר עיבוד בינארי > הסר אובייקטים > גבולות נוגעים ללב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בחר פרמטרים למדידת ריסים.<ol>
<li>גרור ושחרר את הפרמטרים כדי למדוד כגון אורך ריסים (אורך) ועוצמות (סיכום עוצמת אובייקט). חבר את הצמתים לצומת הבינארי המתאים (חיבור A) ולצומת הערוצים (חיבור B). רחף מעל חיבור הצומת עבור תיאור כלי כדי להציג לאיזה חיבור שייך הצומת. בחרו 'מדידה' > גודל עצם > אורך ומדידה > עוצמת העצם > 'עוצמת Obj של Sum Obj' . הערה: אורך הצומת מתחבר רק לצומת הבינארי, ואילו עוצמת Sum Obj מתחברת הן לצמתי הבינארי והן לצמתי הערוץ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>צרף את המידות לטבלה אחת.<ol>
<li>שלב את כל המידות בטבלת פלט בודדת על-ידי גרירה ושחרור של הצומת הוסף עמודה לתרשים זרימת הניתוח וחבר אותה לצמתי המדידה, אורך ועוצמת Obj Sum. בחר > > בסיסית .</li>
	</ol>
</li>
	<li>למדוד ריסים.<ol>
<li>מדוד ריסים על-ידי לחיצה על הפעל. תהליך זה לוקח כמה רגעים כדי למדוד את כל cilia בתמונות ניסיוניות. האורכים והמעוצמות יופיעו בחלון תוצאות ניתוח חדש. הערה: הטבלה יכולה לפעמים לכלול נתונים ממסכות ש- Ai זיהה כריסים אך היו קטנות מכדי להתגלות על ידי העין האנושית וחוסלו בשלב 3.4. ניתן להסיר אובייקטים אלה מערכת הנתונים באמצעות מסנן לפני ניתוח סטטיסטי. כאן, מסנן של 1 מיקרומטר שימש למדידות אורך במבחנה בסיליה באיור 2 ו-2 מיקרומטר עבור cilia in vivo. ניתן לעשות זאת לפני ייצוא נתונים באמצעות המסלול שלהלן. בחר חלון תוצאות ניתוח > הגדר מסנן > הזן ערך > השתמש במסנן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>יצא נתונים לניתוח סטטיסטי.</li>
</ol>5. לימודי קולוקליזציה
הערה: ניתוח Colocalization יכול להיכלל באותו מתכון GA3 המשמש למדידות של אורך cilia וניתוח אינטנסיביות. אם משתמשים באותו מתכון, פתחו קבצים כמתואר להלן ומדדו את האורכים והמשעי של שני הערוצים יחד עם מקדמי הלוקסלציה באותו צינור ניתוח.
<ol><li>פתח את ערכת הנתונים הניסיונית.<ol>
<li>פתח את תמונות הקונפוקליות הניסיוניות של ריסים בתוכנה על-ידי המרת קבצי .tif לדוגמה לקבצי .nd2. בחר קובץ > ייבוא/ייצוא > יצירת קובץ ND מרצף קבצים.</li>
		<li>בחלון המוקפץ, בחר את קבצי המונוכרום בעומק של 16 סיביות מכל ערוצי העניין מסייר החלונות הממוקם בעמודה הראשונה של החלון המוקפץ. בחר ריבוי נקודות או סדרת Z מהתפריט הנפתח הראשון והזן ערך המתאים למספר הכולל של תמונות או ערימות, בהתאמה.</li>
		<li>בתיבה הנפתחת השניה, בחר אורך גל ושנה את הערך למספר הערוצים הכולל בתיקיה. התוכנה תבטל באופן אוטומטי חלון בחירה של Waveleleth הממוקם בקצה השמאלי התחתון של החלון המוקפץ. השתמש בתפריט הנפתח צבע כדי לבחור את הצבע של כל ערוץ. ספק לכל ערוץ שם אחר תחת העמודה שם. לאחר עדכון כל המידע, לחץ על המר. התוכנה תיצור באופן אוטומטי קובץ תמונה כל כיסוי עם כל התמונות הבודדות מכל הערוצים שנבחרו.</li>
	</ol></li>
	<li>כייל תמונות.<ol>
<li>הזינו את גודל הפיקסלים בפינה השמאלית התחתונה של התמונה. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על מסמך > לכייל > גודל פיקסל.</li>
	</ol></li>
	<li>הפעל את Ai מאומן בערוץ הראשון.<ol>
<li>התחל לזהות את הריסים באחד הערוצים הפתוחים (למשל, ACIII; איור 5א) באמצעות Ai. התוכנה תצייר כעת binaries על ACIII שכותרתו cilia בהתבסס על ההכשרה שהיא קיבלה עבור ערוץ זה. תהליך זה ייקח כמה שניות. בחר NIS.ai > Segment.ai > ערוצי מקור > ACIII.</li>
	</ol></li>
	<li>הפעל את Ai מאומן בערוץ השני.<ol>
<li>התחל לזהות את הריסים בערוץ הפתוח האחר (למשל, MCHR1; איור 5B) באמצעות Ai. התוכנה תצייר כעת binaries על MCHR1 שכותרתו cilia בהתבסס על ההכשרה שהיא קיבלה עבור ערוץ זה. תהליך זה ייקח כמה רגעים. בחר NIS.ai > Segment.ai > ערוצי מקור > MCHR1.</li>
	</ol></li>
	<li>בדוק תמונות עבור עבירות עבירות מזוהות שגויות.<ol>
<li>לאחר שה- Ai יזהה ריסים ומסמכים עבירות עבירות, בדוק את התמונות אחר אובייקטים שזוהו באופן שגוי. מחק באופן ידני כל הקבצים הבינאריים שלא זוהו בטעות במידת הצורך. בחר הצג פקדי ניתוח > > סרגל הכלים הבינארי > מחק אובייקט.
</li>
	</ol></li>
	<li>צור מתכון GA3 חדש.<ol>
<li>כעת, לאחר שהריסים זוהו ופולחו, המשיכו לניתוח ה-colocalization באמצעות הכלי GA3. פעולה זו תפתח חלון חדש עם שטח ריק במרכז שבו יוגדר הניתוח. חלון עם כל הקבצים הבינאריים הערוצים המזוהים ייווצר. ודא שכל הערוצים והקבצים הבינאריים הרצויים הדרושים לניתוח קיימים ונבחרים. בחר תמונה > מתכון GA3 חדש.</li>
	</ol></li>
	<li>הסר אובייקטים הנוגעים בגבול המסגרת.<ol>
<li>מכיוון שה- Ai יפלח את כל האובייקטים דמויי הסיליה במסגרת, הוא גם יזהה ריסים לא שלמים לאורך קצות המסגרת. ניתן להסיר אובייקטים אלה באופן ידני בשלב 5.5 או שניתן להסיר אותם באופן אוטומטי ב- GA3. בחר עיבוד בינארי > הסר אובייקטים > גבולות נוגעים ללב.
</li>
	</ol></li>
	<li>הגדר את מסלול הקובקליזציה ב- GA3.<ol>
<li>כדי למדוד חפיפה של שני הערוצים בתוך ריסים, השתמש בקורלציה המקדם של מנדר. גרור ושחרר את צומת מקדם המנדרס לתוך השטח הריק של מתכון GA3 וחבר אותו בינארי מתאים ערוצים. כאן, 'חיבור A' מתחבר עם ACIII בינארי, 'חיבור B' עם ערוץ MCHR1 ו'חיבור C' עם ערוץ ACIII כדי לקבוע את החפיפה של MCHR1 בתוך ACIII בינארי. בחרו 'מדידה > יחס אובייקטים' > מקדם המנדרס. הערה: התוכנה מאפשרת מדידת colocalization באמצעות מתאם מקדם פירסון באמצעות אותם שלבים כמתואר בפרוטוקולזה 40.</li>
	</ol></li>
	<li>צרף את המידות לטבלה אחת.<ol>
<li>שלב את כל המידות בטבלת פלט אחת. בחר > > בסיסית .</li>
	</ol></li>
	<li>מדוד קולוקליזציה.<ol>
<li>מדוד ריסים על-ידי לחיצה על הפעל. תהליך זה לוקח כמה רגעים כדי למדוד את כל cilia בתמונות ניסיוניות. הנתונים יופיעו בחלון תוצאות ניתוח חדש.</li>
	</ol></li>
	<li>יצא נתונים לניתוח סטטיסטי.</li>
</ol>

מחבר שותף ווסלי לואיס הוא עובד של ניקון. אין גילויים פיננסיים.

מדידות אורך ועוצמה הן דרכים נפוצות שבהן מנתחים ריסים ראשוניים, עם זאת, אין שיטה קונבנציונלית סטנדרטית המשמשת בתחום. זיהוי וכימות של ריסים ראשיים באמצעות תוכנה כגון ImageJ הוא זמן רב נוטה הטיית משתמש וטעייה. הדבר מקשה על ניתוח מדויק של ערכות נתונים גדולות. כאן אנו מראים כי באמצעות תוכנית Ai יכול להתגבר על רבים מהאתגרים האלה מה שהופך ניתוח תפוקה גבוהה של cilia ראשוני בר השגה. כאן אנו מתארים את ההליך להכשרת יישום מבוסס Ai לזיהוי ריסים ראשוניים ומתארים את השלבים הנדרשים לניתוח אורך ועוצמת.
בעוד ההכשרה הראשונית של Ai לזהות cilia דורש זמן משמעותי מהמשתמש, לאחר השלמתו ניתן להשתמש בו על כל ערכת נתונים שנרכשה עם אותם פרמטרים. המסיכה הבינארית שנוצרת על-ידי ה- Ai ניתנת לשינוי כך שניתן יהיה לתקן שגיאות כלשהן. עם זאת, שגיאות בזיהוי cilia צריך לאותת למשתמש כי Ai צריך להיות מאומן עוד יותר עם תמונות נוספות. אחד היתרונות העיקריים של שיטה זו הוא כי Ai ניתן לאמן לזהות cilia בסוגי מדגם שונים הן 2D ו 3D. שיטות ניתוח קודמות שנוצרו בתוך מעבדות יש מגבלות שונות כולל דרישת סף ידני לזיהוי ובעיות בזיהוי cilia בתמונה מקטעי רקמות שבו צפיפות התא גבוהה36,46,47. שיטות אלה מתמחות גם בניתוח ריסים ואילו ניתוח באמצעות תוכנת אלמנטים של NIS יכול להעריך מספר היבטים של התמונות בו זמנית. מכיוון שה-Ai המתואר כאן הוא חלק מחבילת התוכנה של NIS Elements, ניתן להמשיך בקלות בתמונות שנרכשו באמצעות מיקרוסקופ ניקון עד לניתוח. עם זאת, הדמיה עם ניקון אינה נדרשת לשימוש בשיטה זו. ללא קשר לתבנית קובץ הנתונים הגולמיים שנתפסו, קבצי ".tif" יכולים להיפתח על ידי רכיבי NIS לשימוש ב- Ai.
יישום AI זה בתוך אלמנטים NIS זמין באופן נרחב ואולי כבר חלק מתוכנת ניתוח תמונה בשימוש על ידי מעבדות לומדות ריסים ראשוניים. עם ההתרחבות של טכנולוגיית הבינה מלאכותית, תוכנות הדמיה אחרות עשויות להרחיב את אפשרויות הניתוח שלהן כך שיכללו מודול AI דומה. החלת ניתוח Ai לזיהוי cilia יכול לשמש עבור מספר היבטים שונים של ניתוח cilia. בעוד שרטטנו שיטות למספר ניתוחים פשוטים כגוןאורך ( איור 2 ו- 3), עוצמה (איור 4) ואנלקציה (איור 5) ניתן להוסיף ניתוח מתוחכם יותר לזרימת העבודה של ניתוח GA3 כמו באיור 6. לדוגמה, במקום למדוד את עוצמתו שלסיליום שלם, הבדלים בעוצמה בתוך תת-אזור שלסיליום עשויים לעניין להעריך לוקליזציה תת-סיליארית. הבדלים בעוצמה בתוך תת-תחזית שלסיליום יכולים להצביע על כך שהחלבון מצטבר בקצה או בבסיס של הסליום, כגון האופן שבו חלבוני Gli מועשרים בקצה ריס48. בנוסף, יישום Ai זה יכול לשמש כדי לזהות בקלות הבדלים בין גנוטיפים או קבוצות טיפול. בעוד המעבדה שלנו משתמשת בעיקר בשיטה זו כדי לנתח ריסים שמצויים מחלקי מוח או מתרביות עצביות, ניתן להחיל אותה על תמונות שנרכשו מקווי תאים שונים או מסוגי רקמות אחרים. הגמישות של סוג המדגם כי יישום זה יכול לשמש על עושה שיטה זו של ניתוח בעל ערך עבור קבוצות רבות ושונות לומדות ריסים ראשוניים או כל אברון נפרד כי הוא מוערך כגון מיטוכונדריה, גרעין, או ER.

ריסים עיקריים הם אברונים חושיים הבולטים מרוב סוגי תאי היונקים1,2,3,4. הם בדרך כלל נספחים בודדים קריטי לתיאום מסלולי איתות תאים מגוונים על ידי שילוב אותות חוץ תאיים5,6,7. ריסים ראשוניים ממלאים תפקידים חשובים במהלך התפתחות עוברית והומאוסטזיס של רקמות בוגרות, ושיבוש תפקודם או המורפולוגיה שלהם קשור למספר הפרעות גנטיות, הנקראות יחד ciliopathies. בשל האופי הכמעט בכל מקום של ריסים, ciliopathies קשורים עם מגוון רחב של תכונות קליניות שיכולות להשפיע על כל מערכות האיברים8,9,10,11,12. במודלים בעלי חיים של ciliopathies, אובדן מבנה ciliary או יכולת איתות מתבטא במספר פנוטיפים רלוונטיים קלינית כולל השמנת יתר הקשורים היפרפגיה3,13,14,15. במערכות מודל רבות, שינויים באורך ריסים הוכחו להשפיע על יכולת האיתות שלהםפונקציות 16,17,18,19. עם זאת, ישנם מספר אתגרים ארוכי זמן וטכניים הקשורים להערכה מדויקת ורבייה של אורך הריסים והרכב.
מערכת העצבים המרכזית של היונקים הבוגרים (CNS) היא הקשר ביולוגי אחד שהציב אתגר להבנת מורפולוגיה ותפקוד ריסים. אמנם נראה כי נוירונים ותאים ברחבי מערכת רה"מ מחזיקים ריסים, בשל הכלים המוגבלים והיכולות להתבונן ולנתח את הריסים האלה הבנה של הפונקציות שלהם נשאר חמקמק20. לדוגמה, סמן הריסים הרב-טיפוס, אצטילאט α-טובולין, אינו מתייג ריסים עצביים20. הקושי לחקור את הריסים האלה נפתר בחלקו עם גילוי של מספר קולטנים מצמידי חלבון G (GPCR), מכונות איתות וחלבונים הקשורים לממברנה המועשרים על הממברנה של ריסים עצביים21,22. כל התצפיות הבסיסיות הפשוטות הללו מרמזות על החשיבות והמגוון של ריסים של CNS, אשר עד כה נראה שאין שני לו על ידי רקמות אחרות. לדוגמה, וריאציה באורך סיליה ולוקליזציה GPCR ניתן לראות בכל המוח, עם אורכים בגרעין עצבי מסוים להיות שונה בהשוואה גרעין אחרים19,23. באופן דומה, התוכן GPCR שלהם מחמאה מכונות איתות להראות גיוון המבוסס על מיקום נוירואנטומי וסוג עצבי2,24,25,26,27,28,29. תצפיות פשוטות אלה ממחישות כי אורך הריסים של היונקים והרכבם מוסדרים היטב, בדיוק כמו באורגניזמים מודל, כמו Chlamydomonas reinhardtii, אבל ההשפעה של הבדלי אורך אלה על תפקוד cilia, איתות ובסופו של דבר התנהגות עדיין לא ברור16,30,31,32.
מדידה מדויקת של אורך הריסים והרכבה מתגלה כאתגר טכני שנוטה לשגיאת משתמש וחוסר תוכחות. כיום cilia ב vivo ו במבחנה מזוהים לרוב באמצעות גישות אימונופלואורסצנטיות המגדירות חלבונים סיליאריים או כתב פלואורסצנטי מועשר ריסים אללס33,34,35. האורכים של ריסים מתויגים פלואורסצנטיים אלה נמדדים לאחר מכן מתמונה דו-ממדית (דו-ממדית) באמצעות כלי מדידת קו בתוכניות ניתוח תמונה כגון ImageJ36. תהליך זה הוא לא רק מייגע ועבודה אינטנסיבית, אלא גם נוטה הטיה וטעייה. אותם מכשולים מתעוררים בעת מדידת עוצמות ריסים, המסייעים להצביע על שינויים במבנהריסים 37. כדי למזער את חוסר העקביות בסוגים אלה של ניתוחי תמונה, תוכניות בינה מלאכותית (Ai) הופכות נפוץ יותר ובמחיר סביר אפשרויות38.
Ai הוא קידום של מערכות מחשב המשתמשות ביתרון של אלגוריתמים ממוחשבים ותכנות לביצוע משימות שבדרך כלל דורשות אינטליגנציה אנושית39. מכשירי Ai לומדים לתפוס דפוסים, פרמטרים ומאפיינים חוזרים ולנקוט פעולות כדי למקסם את הסיכויים ליצירת תוצאות מוצלחות. Ai הוא רב-תכליתי וניתן לאמן אותו לזהות אובייקטים או מבנים ספציפיים בעלי עניין, כגון cilia, ולאחר מכן להיות מתוכנת להפעיל מגוון של ניתוחים על האובייקטים המזוהים. לכן, נתוני תמונה מורכבים יכולים להיווצר במהירות ובשחזור על ידי Ai38. אוטומציה וניתוח Ai של תמונות שנתפסו יגבירו את היעילות והיעילות תוך הגבלת כל טעות אנוש פוטנציאלית והטיה39. יצירת מתודולוגיה מבוססת Ai לזיהוי ריסים יוצרת דרך עקבית עבור כל קבוצות המחקר לנתח ולפרש נתוני ריסים.
כאן אנו משתמשים במודול Ai כדי לזהות את הריסים הן ב- vivo והן במבחנה בתמונות 2D. באמצעות קבוצה של תמונות לדוגמה, ה- Ai מאומן לזהות ריסים. לאחר השלמת האימון, Ai המיועד משמש להחלת מסיכה בינארית על ריסים המזוהים על Ai בתמונה. הקבצים הבינאריים המוחלים על ידי Ai ניתנים לשינוי, במידת הצורך, כדי להבטיח שכל הריסים בתמונות מזוהים כראוי וזיהוי לא ספציפי מסולק. לאחר ניצול Ai כדי לזהות cilia, תוכניות ניתוח כללי שנבנה בהתאמה אישית (GA) משמשים לביצוע ניתוחים שונים כגון מדידת אורך cilia ועוצמת פלואורסצנטיות. הנתונים הנאספים מיוצאים לטבלה שניתן לקרוא, לפרש ולהשתמש בה בקלות עבור ניתוחים סטטיסטיים (איור 1). השימוש בטכנולוגיה אוטומטית ובבינה מלאכותית לזיהוי ריסים וקבלת מדידות ספציפיות בין קבוצות ניסוי יסייע במחקרים עתידיים שמטרתם להבין את ההשפעה של תפקוד ריסים של מערכת הסביבה ומורפולוגיה על תקשורת והתנהגות תאים-תאים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Intel Xeon, 3.6 GHz, 32GB RAM</td>
			<td>Intel Corporation</td>
			<td>W-2123</td>
			<td>Processor used for running NIS Elements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements Software</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Ai and GA3 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadro RTX 4000 Graphics card</td>
			<td>NVIDIA Corporation</td>
			<td>Quadro RTX 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10 Professional 64-bit</td>
			<td>Microsoft Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Operating system used for running NIS Elements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Workstation</td>
			<td>HP Development Company, L.P.</td>
			<td>HP&#160;Z4G4</td>
			<td>Workstation used for running NIS Elements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

artificial intelligence approaches to assessing primary cilia

Cilia הם נספחים תאיים מבוססי מיקרוטובול המתפקדים כמרכזי איתות למגוון מסלולי איתות בסוגי תאי יונקים רבים. אורך Cilia נשמר מאוד, מוסדר היטב, ומשתנה בין סוגי תאים ורקמות שונים והיה מעורב בהשפעה ישירה על יכולת האיתות שלהם. לדוגמה, הוכח כי cilia משנה את אורךם בתגובה להפעלת קולטנים מצמידי חלבון G. עם זאת, מדידה מדויקת ורבייה של ריסים רבים היא הליך גוזל זמן רב ועבודה אינטנסיבית. גישות נוכחיות הן גם שגיאה והטיה נוטה. ניתן להשתמש בתוכניות בינה מלאכותית (Ai) כדי להתגבר על אתגרים רבים אלה בשל יכולות המאפשרות התבוללות, מניפולציה ואופטימיזציה של ערכות נתונים נרחבות. כאן, אנו מדגימים כי מודול Ai ניתן לאמן לזהות cilia בתמונות הן בדגימות vivo והן במבחנה. לאחר שימוש ב- Ai מאומן לזיהוי ריסים, אנו מסוגלים לעצב ולנצל במהירות יישומים המנתחים מאות ריסים במדגם יחיד לאורך, עוצמת פלואורסצנטיות ולוקליזציה משותפת. גישה בלתי משוחדת זו הגבירה את הביטחון והקפדנות שלנו כאשר משווים דגימות מהקדמה עצבית ראשונית שונה במבחנה, כמו גם על פני אזורי מוח שונים בתוך בעל חיים ובין בעלי חיים. יתר על כן, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לנתח באופן אמין את הדינמיקה cilia מכל סוג תא ורקמות באופן תפוקה גבוהה על פני דגימות מרובות וקבוצות טיפול. בסופו של דבר, גישות מבוססות Ai צפויות להפוך לסטנדרט ככל שרוב השדות נעים לעבר גישות פחות מוטות ויותר ניתנות לשחזור לרכישת וניתוח תמונות.

Watch this Scientific Journal Video about Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia at JoVE.com

Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia

השימוש בבינה מלאכותית (Ai) לניתוח תמונות מתגלה כגישה חזקה, פחות מוטה ומהירה בהשוואה לשיטות נפוצות. כאן אימנו את Ai לזהות אברון תאי, ריסים ראשוניים, ולנתח תכונות כגון אורך ועוצמת הכתמים באופן קפדני ושחזורי.

גישות בינה מלאכותית להערכת ריסים ראשוניים

Cilia are microtubule based cellular appendages that function as signaling centers for a diversity of signaling pathways in many mammalian cell types. ...

השיטות הנוכחיות של ניתוח ריסים הן עבודה אינטנסיבית נוטה שגיאה והטיה. הגישה שלנו מבקשת לייעל את הזמן והמאמץ תוך צמצום שגיאות פוטנציאליות. היתרון העיקרי שטכניקה זו מציעה הוא הקפדה מוגברת ושחזור וניתוח תמונה כמותי.סוג זה של גישה רלוונטי לא רק ניתוח cilia, אבל יכול להיות מיושם באופן נרחב על שאלות ביולוגיות תאים רבים, כולל אלה העוסקים אברונים אחרים וחלבונים שלד. כדי להתחיל, פתח את ערכת הנתונים של האימון, בחר קובץ מהתפריט, לחץ על ייבוא ייצוא ובחר צור קובץ ND מרצף קבצים. בחר את התיקיה המכילה את ערכת נתוני האימון ורשימת הקבצים תיפתח במרכז חלון הדו-שיח.הגדר באופן ידני את ארגון הקבצים באמצעות אפשרות אחת לפחות בתפריט הנפתח. הזן את הערכים המספריים המתאימים תחת כל אפשרות שנבחרה ובחר אף אחד בכל מקום שבו לא נבחרו אפשרויות. לחץ על המר כדי לפתוח את מסמך ND.לכייל את התמונה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על האפשרות הלא מכוילת בפינה השמאלית התחתונה של התמונה. לחץ על כייל מסמך ולאחר מכן לחץ על גודל פיקסל, הזן את הערך ולחץ על אישור. בחר פקדי ניתוח תצוגה, פתח את סרגל הכלים הבינארי ובחר זיהוי אוטומטי או צייר אובייקט לזיהוי יד על-ידי מעקב מדויק אחר מבני ססילי בודדים בכל המסגרות הפתוחות.להכשרת בנתב"ג בחרו ב-NIS. ai, לחץ על קטע רכבת. ai כדי לפתוח את קטע הרכבת.תיבת ai ולאחר מכן בחר את ערוץ המקור שישמש לאימון. בחר את הקבצים הבינאריים המתאימים של GroundTruth כדי לאמן את הבינה הה מלאכותית. בחר את המספר הנדרש של איטרציות כדי לאמן את הבינה הבינה מלאכותית בהתאם לגודל הבינארי ולהפצה, ולאחר מכן בחר את תיקיית היעד כדי לשמור את קובץ הבינה המיומן ולחץ על התאמן כדי לאמן את התוכנה. תהליך זה אורך מספר שעות.פתח את תמונות הקונפוקליות הניסיוניות של ריסים כפי שתואר קודם לכן על ידי המרת המדגם. קבצי TIF לקבצי ND2. בחלון המוקפץ, בחר ריבוי נקודות מהתפריט הנפתח הראשון והזן ערך המתאים למספר הכולל של התמונות.בתיבה הנפתחת השניה, בחר אורך גל ושנה את הערך למספר הכולל של הערוצים בתיקיה. התוכנה תבטל באופן אוטומטי חלון בחירה באורך גל, הממוקם בקצה התחתון, הימני של החלון המוקפץ. בחלון הבחירה אורך הגל, השתמש בתפריט הנפתח צבע כדי לבחור את הצבע של כל ערוץ.ספק לכל ערוץ שם אחר תחת עמודת השם. לאחר עדכון כל המידע, לחץ על המר. כייל את התמונות כמתואר קודם לכן.ודא שגודל הפיקסל של ערכת הנתונים הניסיונית עולה בקנה אחד עם גודל ערכת הנתונים של האימון. זהה ריסים בערוץ הראשון באמצעות בינה מלאכותית מאומנת מהשלב הקודם. פתיחה של שקלים.ai מהתפריט, בחר פלח שוק. ai, ולאחר מכן בחר AC3 בערוצי המקור. לאחר מכן זהה את הריסים בערוץ השני על-ידי בחירת MCHR1 בערוצי המקור.התוכנה תצייר הקבצים הבינאריים על הריסים המסומנים. לאחר מכן בדוק את התמונות עבור כל הקבצים הבינאריים שלא זוהו. בחר מחק אובייקט בסרגל הכלים הבינארי כדי למחוק באופן ידני את הקבצים הבינאריים שהותרו באופן שגוי.לאחר שהריסים זוהו ופולחו, נתחו פרמטרים שונים של ריסים, כגון אורכים ועוצמות, באמצעות הכלי הכללי Three. בחרו תמונה מהתפריט ולחצו על מתכון GA3 חדש. ייפתח חלון חדש עם שטח ריק במרכז.GA3 יזהה באופן אוטומטי את הקבצים הבינאריים המסומנים כראוי בהתאם ל- AI ויכלול את הצומת המתאים. GA3 גם יזהה באופן אוטומטי את הערוצים בתמונות ויציג את הכרטיסיות שלהם תחת ערוצים. ה- AI יפלח את כל הריסים כמו אובייקטים במסגרת ותזהה ריסים לא שלמים לאורך קצות המסגרת.כדי להסיר אותם, בחר עיבוד בינארי, הסר אובייקטים ולאחר מכן גרור את צומת הגבולות הנוגעים ללב אל השטח הריק וחבר את הצומת לקבצים הבינאריים המתאימים. למדידת אורך הריסים, בחרו גודל עצם מדידה ולאחר מכן אורך. גרור ושחרר את הפרמטר למרכז והתחבר לצומת הבינארי המתאים.כדי למדוד עוצמות ריסים, בחר עוצמת אובייקט מסוימת. גרור ושחרר את הפרמטר למרכז והתחבר לצומת הבינארי המתאים ולערוץ העניין המתאים. בתפריט המדידה, עבור ליחס אובייקט ובחר מקדם של מנדר כדי להגדיר את מסלול הלוקוקליזציה ב- GA3 על-ידי מדידת החפיפה של שני ערוצים בתוך ריסים בודדים.גרור ושחרר את צומת המקדם של המנדר בשטח הריק וחבר אותו לקובץ הבינארי והתעלים המתאימים. הנקה את המדידות ואת הטבלה הבודדת על-ידי פתיחת תפריט ניהול הנתונים. בקטגוריה הבסיסית, בחר עמודת ApEn ולאחר מכן לחץ על הפעל כעת כדי למדוד ריסים.כל המדידות יופיעו בטבלת פלט אחת. התמונות המייצגות מראות כי בינה מלאכותית מאומנת זוהתה כראוי בסיליה במבחנה בתמונות של תאי IMCD, תרביות היפותלאמיות ראשוניות ותרבויות היפוקמפוס, אך אין מבנים אחרים שאינם סיביריים כגון גשרים ציטוקינטיים. אורך הריסים נע בין 0.5 ל-4.5 מיקרומטרים בתאי IMCD ושניים עד 12 מיקרומטרים בתרבות ההיפותלמוס וההיפוקמפוס.בינה מלאכותית מדדה את האורכים של AC3 שכותרתו cilia ב- vivo בתמונות של גרעין הארקואט שלנו, גרעין paraventricular ו cornu ammonis אזור אחד. על פי הניתוח, ריסים ההיפותלמיים ב vivo נע בין אחד ל 15 מיקרומטר, כפי שניתן לראות ברים לבנים וחומים. בעוד ריסים ואזור קורנו אמוניס נע בין אחד ל 10 מיקרומטר, כפי שניתן לראות בסורגים אפורים.מעניין, עוצמתו של MCHR1 ciliary היה חזק יותר בגרעין paraventricular מזה בגרעין arcuate. האינטנסיביות של MCHR1 נגד AC3 זווו למדוד את החפיפה שלהם. רוב הריסים היו חיוביים עבור שני הסמנים בעוד כמה cilia היו חיוביים עבור AC3 או MCHR1.כדי לכמת colocalization של MTHR1 בתוך AC3, מקדם החפיפה של מנדר נמדד והייתה עלייה משמעותית בחפיפה בגרעין paraventricular מאשר בגרעין arcuate. כדי למדוד את העוצמה לאורך הריסים, הקוטביות של ריסים הוגדרה באמצעות Centrin2-GFP כסמן הגוף הבזלי. זה מותר להבחין בין הבסיס של ריסים מן הטיפים של ARL13B-M דובדבן חיובי cilia.שינויים בעוצמת ARL13B לאורך הריסים נצפו כאשר עוצמת ARL13B הייתה גבוהה יותר בבסיס מאשר בקצהסיליום בגרעין ארקואט, הנראה משמאל, כמו גם PVN, כפי שניתן לראות בצד ימין. בעת ניתוח נתונים באמצעות גישה זו, חשוב לוודא כי האיכות והרזולוציה של ערכת הנתונים הניסיונית עולה בקנה אחד עם זה המשמש לאימון בנתב"ג. התועלת העיקרית של גישה זו היא לאחר זיהוי cilia על ידי AI, המשתמש יכול להיות יצירתי על אילו מאפיינים מנותחים על ידי התאמה אישית של זרימת העבודה ניתוח משולב בתוך התוכנה.

Research

JoVE Journal

Biology

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

קצירת הזרע והזרעה מלאכותית של עכברים

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals.  Peromyscus species are used in a wide range of research ...

Experimental Approaches to Tissue Engineering

גישות ניסויית כדי הנדסת רקמות

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

הכנת Bilayers מלאכותית לניסויים Electrophysiology

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

ניתוח של תפקוד גן ויזואליזציה של זרימת נוזל צילה שנוצרה בשלפוחיות של Kupffer

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

הערכת תרומות מינים ספציפיות כדי Craniofacial פיתוח באמצעות מפלצות שליו-ברווז

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

גישות ניסוייות לחקר מיטוכונדריאלי לוקליזציה ותפקוד של מחזור התא הגרעיני קינאז, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

באמצעות מכשירים microfluidic למדוד פנוטיפים תוחלת החיים סלולר בתאי שמרים ניצני יחיד

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

במבחנה , גישות In Vivo כדי לקבוע חדירות תאים אפיתל המעי

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

מגנטי תא לפעיל על-מיון אסטרטגיות כדי לבודד ולטהר Synovial נגזר הנוזלים בתאי גזע Mesenchymal ממודל ארנב

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

זיהוי פשוט של Cilia הראשי על ידי אימונולוסץ

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...