Name: artificial intelligence approaches to assessing primary cilia
Uploaded: 2021-05-01T14:00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases R01 DK114008 a NFB e dall'American Heart Association Fellowship Grant #18PRE34020122 a RB. Ringraziamo Rich Gruskin General Manager di Nikon Software, Melissa Bentley, Courtney Haycraft e Teresa Mastracci per i commenti approfonditi sul manoscritto.

1. Acquisisci immagini raw
<ol><li>Fissare e immunolabel campioni secondo necessità20.<ol>
<li>Immagini ciglia utilizzando un microscopio confocale alla massima profondità di bit utilizzando la stessa dimensione dei pixel con risoluzione Nyquist.</li>
		<li>Esporta le immagini come file monocromatici tagged image format (.tif). NOTA: questo protocollo illustra come utilizzare il modulo Ai in modo specifico all'interno del software NIS Elements. Se le immagini sono state acquisite come file .nd2, l'esportazione delle immagini come file .tif non è necessaria e l'utente può procedere direttamente al passaggio 2.3. Se le immagini sono state acquisite su un sistema diverso, una licenza NIS Elements può essere acquistata separatamente e .tif file possono essere convertiti come descritto nei passaggi successivi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Addestra Ai per identificare le ciglia
<ol><li>Aprire il set di dati di training.<ol>
<li>Selezionare circa 50 immagini di esempio con almeno un cilium per fotogramma per addestrare il software e copiarle in un'unica cartella. Questa cartella viene utilizzata per indirizzare il software all'apertura delle immagini. Aprite questi 50 fotogrammi all'interno di un singolo documento ND2 con almeno un cilium per fotogramma. Selezionare File > Importa/Esporta > Crea file ND dalla sequenza di file.</li>
		<li>Selezionare la cartella contenente il set di dati di training. Questo aprirà l'elenco dei file al centro della finestra di dialogo. Definire manualmente l'organizzazione dei file utilizzando almeno un'opzione nel menu a discesa sopra. Le opzioni sono multipunto (per più file di proiezione massima), serie Z (per un'immagine dello stack z), tempo (per un'immagine time-lapse) e lunghezza d'onda (per i file da più canali).</li>
		<li>Immettere i valori numerici corrispondenti sotto ogni opzione selezionata. Selezionare Nessuno laddove le opzioni non sono selezionate. Fare clic su Converti per aprire il documento ND.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calibrare le immagini.<ol>
<li>Inserisci la dimensione in pixel nell'angolo in basso a sinistra dell'immagine: fai clic con il pulsante destro del mouse su Uncalibrated > Calibra documento > Dimensione pixel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identificare le ciglia.<ol>
<li>Identifica a mano le ciglia tracciando con precisione le singole strutture ciliari su tutti i fotogrammi aperti utilizzando AutoDetect o Draw Object nella barra degli strumenti binaria. Questo disegnerà maschere binarie sugli oggetti di interesse. Questi binari serviranno come oggetti campione per addestrare il software a identificare le ciglia sulle caratteristiche basate su pixel nella futura analisi sperimentale delle immagini. Selezionare Visualizza > controlli di analisi > barra degli strumenti binari > Disegna oggetto. NOTA: rimuovere qualsiasi frame che non dispone di file binari poiché il software non inizierà il training a meno che non sia in grado di rilevare i file binari su tutti i frame aperti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Treno Ai.<ol>
<li>Iniziare la formazione del software. Questo aprirà la scatola di Segment.ai del treno. Selezionate NIS.ai > Segment.ai Treno.</li>
		<li>Nella casella Segment.ai treno selezionare il canale sorgente da utilizzare per l'allenamento. Se i file di più canali sono aperti, selezionare un solo canale come canale di origine. Quindi selezionare i binari di verità di base appropriati su cui addestrare l'Ai. Infine selezionare il numero di iterazioni necessarie per addestrare l'Ai in base alle dimensioni e alla distribuzione dei file binari. NOTA: se i file binari sono facilmente rilevabili dall'ambiente circostante e ben distribuiti in tutta l'immagine, il software potrebbe richiedere meno di 1000 iterazioni per essere addestrato a identificare le immagini. Se le immagini hanno un basso rapporto segnale-rumore, è ideale eseguire almeno 1000 iterazioni durante l'allenamento per consentire all'Ai di identificare le ciglia nei campioni di test con elevata sicurezza.</li>
		<li>Selezionare la cartella di destinazione per salvare il file Ai addestrato (.sai) e fare clic su Treno per addestrare il software. Il software procederà ora ad allenarsi per identificare le ciglia in base ai binari tracciati. Questo processo richiede diverse ore. NOTA: durante l'allenamento, il software visualizzerà un grafico che mostra la perdita di allenamento. Il grafico mostrerà inizialmente un picco prima di assottigliarsi idealmente a circa l'1% di perdita dove si stabilizza per il resto dell'allenamento. Salvare il grafico per riferimento futuro selezionando la casella Salva screenshot grafico nella casella Segment.ai treno (Figura supplementare 1).</li>
		<li>Se è necessario un ulteriore perfezionamento della formazione, continuare la formazione sullo stesso set di dati. In alternativa, eseguire il training su un nuovo set di dati con gli stessi parametri. Non è consigliabile addestrare un Ai già addestrato su un nuovo set di dati con parametri diversi o diversi oggetti di interesse. Seleziona Treno segment.ai > Continua la formazione su > Seleziona File Ai addestrato.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Identifica le ciglia usando l'IA addestrata
<ol><li>Aprire il set di dati sperimentale.<ol>
<li>Aprire le immagini confocali sperimentali di ciglia nel software convertendo i file .tif di esempio in file .nd2, simile al passaggio 2.1. Selezionare File > Importa/Esporta > Crea file ND dalla sequenza di file. NOTA: le immagini devono avere le stesse dimensioni in pixel di quelle utilizzate per l'addestramento dell'IA. Se le immagini sono già in formato ND2, andare al passaggio 3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calibrare le immagini.<ol>
<li>Inserisci la dimensione in pixel nell'angolo in basso a sinistra dell'immagine. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Non calibrato > Calibra documento > dimensione pixel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Esegui l'Ai addestrato sui file aperti.<ol>
<li>Inizia a identificare le ciglia usando Ai. Il software ora disegnerà binari sulle ciglia in base alla formazione ricevuta nella fase precedente. Questo processo richiederà alcuni secondi. Selezionare NIS.ai > Segment.ai. NOTA: il software richiederà di selezionare il canale se sono aperti più canali. I canali sono elencati con i rispettivi nomi qui. In caso contrario, la casella contrassegnata come "Mono" verrà selezionata automaticamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Controllare le immagini per i file binari identificati in modo errato.<ol>
<li>Una volta che l'Ai ha identificato le ciglia e disegnato i binari, controlla le immagini per eventuali oggetti erroneamente identificati. Se lo si desidera, eliminare manualmente tutti i file binari identificati in modo errato. Selezionate Visualizza > controlli di analisi > barra degli strumenti binari > Elimina oggetto.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Misurazione della lunghezza e dell'intensità delle ciglia
<ol><li>Creare una nuova ricetta ga3 (General Analysis 3).<ol>
<li>Ora che le ciglia sono state identificate e segmentate, procedere all'analisi di diversi parametri di ciglia come lunghezze e intensità utilizzando lo strumento GA3. Si aprirà una nuova finestra con uno spazio vuoto al centro in cui verrà definita l'analisi. Seleziona Immagine > Nuova ricetta GA3. 
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selezionare i file binari da analizzare.<ol>
<li>Poiché le ciglia sono già segmentate utilizzando Segment.ai, GA3 rileverà automaticamente i binari opportunamente etichettati in base all'Ai e includerà il nodo. Seleziona'Binari > Detect_AI automatica' o 'Binari > Disegna Object_AI'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selezionare i canali necessari per l'analisi. GA3 rileverà automaticamente anche i canali nelle immagini e visualizzerà le loro schede in Canali.</li>
	<li>Rimuovere gli oggetti che toccano il bordo della cornice.<ol>
<li>Poiché l'Ai segmenterà tutte le ciglia come oggetti nel telaio, rileverà anche le ciglia incomplete lungo i bordi del telaio. Questi oggetti possono essere rimossi manualmente nel passaggio 3.4 oppure possono essere rimossi automaticamente in GA3. Selezionare Elaborazione binaria > Rimuovi oggetti > Touching Borders.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selezionare i parametri per misurare le ciglia.<ol>
<li>Trascina e rilascia i parametri da misurare come la lunghezza delle ciglia (Lunghezza) e le intensità (Somma intensità oggetto). Collegare i nodi al nodo binario appropriato (connessione A) e ai nodi di canale (connessione B). Passare il puntatore del mouse sulla connessione del nodo per visualizzare una descrizione comando per mostrare a quale connessione appartiene il nodo. Selezionare Misurazione > Dimensione oggetto > Lunghezza e Misurazione > Intensità oggetto > Somma Intensità Obj. NOTA: il nodo Lunghezza si connette solo al nodo binario, mentre Somma intensità Obj si connette sia al nodo binario che al nodo canale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere le misure in un'unica tabella.<ol>
<li>Combina tutte le misurazioni in un'unica tabella di output trascinando e rilasciando il nodo Aggiungi colonna al diagramma di flusso dell'analisi e collegalo ai nodi di misura, Lunghezza e Somma intensità Obj. Selezionare Gestione dati > Colonna di > di base.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Misura le ciglia.<ol>
<li>Misurare le ciglia facendo clic su Esegui. Questo processo richiede alcuni istanti per misurare tutte le ciglia nelle immagini sperimentali. Le lunghezze e le intensità verranno visualizzate in una nuova finestra Risultati analisi. NOTA: la tabella a volte può includere dati da maschere che Ai ha riconosciuto come ciglia ma erano troppo piccole per essere rilevate dall'occhio umano ed eliminate nel passaggio 3.4. Questi oggetti possono essere rimossi dal set di dati utilizzando un filtro prima dell'analisi statistica. Qui, un filtro di 1 μm è stato utilizzato per le misurazioni in vitro della lunghezza delle ciglia nella Figura 2 e 2 μm per le ciglia in vivo. Questo può essere fatto prima di esportare i dati utilizzando il percorso seguente. Selezionare la finestra Risultati analisi > Definisci filtro > Immetti valore > Usa filtro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Esporta i dati per l'analisi statistica.</li>
</ol>5. Studi di colocalizzazione
NOTA: L'analisi di colocalizzazione può essere inclusa nella stessa ricetta GA3 utilizzata per le misurazioni della lunghezza delle ciglia e dell'analisi dell'intensità. Se si utilizza la stessa ricetta, aprire i file come descritto di seguito e misurare le lunghezze e le intensità di entrambi i canali insieme ai coefficienti di colocalizzazione nella stessa pipeline di analisi.
<ol><li>Aprire il set di dati sperimentale.<ol>
<li>Apri le immagini confocali sperimentali di ciglia nel software convertendo i file .tif di esempio in file .nd2. Selezionare File > Importa/Esporta > Crea file ND dalla sequenza di file.</li>
		<li>Nella finestra pop-up, seleziona i file monocromatici di profondità a 16 bit da tutti i canali di interesse da Esplora finestre situato nella prima colonna della finestra pop-up. Selezionare Multipoint o Z Series dal primo menu a discesa e immettere un valore corrispondente al numero totale di immagini o pile, rispettivamente.</li>
		<li>Nella seconda casella a discesa, selezionare Lunghezza d'onda e modificare il valore sul numero totale di canali nella cartella. Il software sbloccherà automaticamente una finestra di selezione della lunghezza d'onda situata all'estremità in basso a destra della finestra pop-up. Utilizzare il menu a discesa Colore per selezionare il colore di ciascun canale. Fornire a ciascun canale un nome diverso nella colonna Nome. Una volta aggiornate tutte le informazioni, fare clic su Converti. Il software genererà automaticamente un file Di tutte le immagini sovrapposto a tutte le singole immagini di tutti i canali selezionati.</li>
	</ol></li>
	<li>Calibrare le immagini.<ol>
<li>Inserisci la dimensione in pixel nell'angolo in basso a sinistra dell'immagine. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Non calibrato > Calibra documento > dimensione pixel.</li>
	</ol></li>
	<li>Esegui l'Ai addestrato sul primo canale.<ol>
<li>Iniziare a identificare le ciglia su uno dei canali aperti (ad esempio, ACIII; Figura 5A) utilizzando Ai. Il software ora disegnerà binari su ciglia etichettate ACIII in base alla formazione ricevuta per questo canale. Questo processo richiederà alcuni secondi. Selezionare NIS.ai > Segment.ai > canali sorgente > ACIII.</li>
	</ol></li>
	<li>Esegui l'Ai addestrato sul secondo canale.<ol>
<li>Iniziare a identificare le ciglia sull'altro canale aperto (ad esempio, MCHR1; Figura 5B) utilizzando Ai. Il software ora disegnerà binari su ciglia etichettate MCHR1 in base alla formazione ricevuta per questo canale. Questo processo richiederà alcuni istanti. Selezionare NIS.ai > Segment.ai > canali sorgente > MCHR1.</li>
	</ol></li>
	<li>Controllare le immagini per i file binari identificati in modo errato.<ol>
<li>Una volta che l'Ai ha identificato le ciglia e disegnato i binari, controlla le immagini per eventuali oggetti identificati erroneamente. Se necessario, eliminare manualmente eventuali file binari identificati in modo errato. Selezionate Visualizza > controlli di analisi > barra degli strumenti binari > Elimina oggetto.
</li>
	</ol></li>
	<li>Crea una nuova ricetta GA3.<ol>
<li>Ora che le ciglia sono state identificate e segmentate, procedere all'analisi di colocalizzazione utilizzando lo strumento GA3. Si aprirà una nuova finestra con uno spazio vuoto al centro in cui verrà definita l'analisi. Verrà generata una finestra con tutti i file binari e i canali identificati. Verificare che tutti i canali e i file binari desiderati necessari per l'analisi siano presenti e selezionati. Seleziona Immagine > Nuova ricetta GA3.</li>
	</ol></li>
	<li>Rimuovere gli oggetti che toccano il bordo della cornice.<ol>
<li>Poiché l'Ai segmenterà tutti gli oggetti simili alle ciglia nel telaio, rileverà anche le ciglia incomplete lungo i bordi del fotogramma. Questi oggetti possono essere rimossi manualmente nel passaggio 5.5 o possono essere rimossi automaticamente in GA3. Selezionare Elaborazione binaria > Rimuovi oggetti > Touching Borders.
</li>
	</ol></li>
	<li>Impostare il percorso di colocalizzazione in GA3.<ol>
<li>Per misurare la sovrapposizione dei due canali all'interno delle ciglia, utilizzare la correlazione del coefficiente di Mander. Trascina e rilascia il nodo Coefficiente di Manders nello spazio vuoto della ricetta GA3 e collegalo al binario e ai canali appropriati. Qui, 'connessione A' si connette con il binario ACIII, 'connessione B' con il canale MCHR1 e 'connessione C' con il canale ACIII per determinare la sovrapposizione di MCHR1 all'interno del binario ACIII. Selezionare Misura > Rapporto di oggetti > Coefficiente di Manders. NOTA: Il software consente di misurare la colocalizzazione utilizzando la correlazione del coefficiente di Pearson utilizzando gli stessi passaggi descritti in questo protocollo40.</li>
	</ol></li>
	<li>Aggiungere le misure in un'unica tabella.<ol>
<li>Combina tutte le misure in un'unica tabella di output. Selezionare Gestione dati > Colonna di > di base.</li>
	</ol></li>
	<li>Misurare la colocalizzazione.<ol>
<li>Misurare le ciglia facendo clic su Esegui. Questo processo richiede alcuni istanti per misurare tutte le ciglia nelle immagini sperimentali. I dati verranno visualizzati in una nuova finestra Risultati analisi.</li>
	</ol></li>
	<li>Esporta i dati per l'analisi statistica.</li>
</ol>

Il co-autore Wesley Lewis è un dipendente di Nikon. Non ci sono informazioni finanziarie.

Le misurazioni di lunghezza e intensità sono modi comuni in cui vengono analizzate le ciglia primarie, tuttavia, non esiste un metodo convenzionale standardizzato utilizzato sul campo. L'identificazione e la quantificazione delle ciglia primarie utilizzando software come ImageJ richiede molto tempo ed è soggetta a pregiudizi ed errori dell'utente. Ciò rende difficile analizzare con precisione set di dati di grandi dimensioni. Qui mostriamo che l'utilizzo di un programma ai può superare molte di queste sfide rendendo realizzabile un'analisi ad alto rendimento delle ciglia primarie. Qui descriviamo la procedura per addestrare un'applicazione basata sull'IA per riconoscere le ciglia primarie e delineare i passaggi necessari per analizzare la lunghezza e l'intensità.
Mentre la formazione iniziale dell'Ai per riconoscere le ciglia richiede molto tempo da parte dell'utente, una volta completata può essere utilizzata su qualsiasi set di dati acquisito con gli stessi parametri. La maschera binaria generata dall'Ai è modificabile in modo tale che eventuali errori possano essere corretti. Tuttavia, gli errori nell'identificazione delle ciglia dovrebbero segnalare all'utente che l'IA deve essere ulteriormente addestrata con immagini aggiuntive. Uno dei principali vantaggi di questo metodo è che l'Ai può essere addestrato a riconoscere le ciglia in diversi tipi di campioni sia in 2D che in 3D. I precedenti metodi di analisi generati all'interno dei laboratori hanno varie limitazioni, tra cui la richiesta di soglie manuali per l'identificazione e problemi di identificazione delle ciglia fotografate da sezioni di tessuto in cui la densità cellulare è elevata36,46,47. Questi metodi sono anche specializzati per l'analisi delle ciglia, mentre l'analisi con il software NIS Elements può valutare diversi aspetti delle immagini contemporaneamente. Poiché l'Ai qui descritta fa parte del pacchetto software NIS Elements, le immagini acquisite utilizzando un microscopio Nikon possono essere facilmente continuate fino all'analisi. Tuttavia, l'imaging con Nikon non è necessario per l'utilizzo di questo metodo. Indipendentemente dal formato di file di dati grezzi acquisito, i file ".tif" possono essere aperti da NIS Elements per l'utilizzo nell'Ai.
Questa applicazione Ai all'interno di NIS Elements è ampiamente disponibile e forse già parte del software di analisi delle immagini in uso dai laboratori che studiano le ciglia primarie. Con l'espansione della prevalenza della tecnologia Ai, altri software di imaging possono espandere le loro opzioni di analisi per includere un modulo Ai simile. L'applicazione dell'analisi Ai all'identificazione delle ciglia può essere utilizzata per diversi aspetti dell'analisi delle ciglia. Mentre abbiamo delineato i metodi per alcune semplici analisi come la lunghezza (Figura 2 e 3), l'intensità (Figura 4) e la colocalizzazione (Figura 5) è possibile aggiungere analisi più sofisticate al flusso di lavoro di analisi GA3 come nella Figura 6. Ad esempio, invece di misurare l'intensità di un cilio completo, le differenze di intensità all'interno di una sottoregione di un cilio possono essere di interesse per valutare la localizzazione sub-ciliare. Le differenze di intensità all'interno di una sottoregione di un cilio potrebbero indicare che la proteina si sta accumulando sulla punta o alla base del cilio, come ad esempio come le proteine Gli sono arricchite sulla punta delle ciglia48. Inoltre, questa applicazione Ai può essere utilizzata per identificare prontamente le differenze tra genotipi o gruppi di trattamento. Mentre il nostro laboratorio utilizza principalmente questo metodo per analizzare le ciglia riprese da sezioni cerebrali o colture neuronali, può essere applicato a immagini acquisite da varie linee cellulari o altri tipi di tessuto. La flessibilità del tipo di campione su cui questa applicazione può essere utilizzata rende questo metodo di analisi prezioso per molti gruppi diversi che studiano le ciglia primarie o qualsiasi organello discreto che viene valutato come mitocondri, nucleo o ER.

Le ciglia primarie sono organelli sensoriali che sporgono dalla maggior parte dei tipi di cellule di mammifero1,2,3,4. Sono generalmente appendici solitarie fondamentali per coordinare diverse vie di segnalazione cellulare integrando i segnali extracellulari5,6,7. Le ciglia primarie svolgono un ruolo importante durante lo sviluppo embrionale e l'omeostasi dei tessuti adulti e l'interruzione della loro funzione o morfologia è associata a diversi disturbi genetici, che sono collettivamente chiamati ciliopatie. A causa della natura quasi onnipresente delle ciglia, le ciliopatie sono associate a una vasta gamma di caratteristiche cliniche che possono avere un impatto su tutti i sistemi di organi8,9,10,11,12. Nei modelli animali di ciliopatie, la perdita della struttura ciliare o della capacità di segnalazione si manifesta in diversi fenotipi clinicamente rilevanti tra cui l'obesità associata all'iperfagia3,13,14,15. In molti sistemi modello, è stato dimostrato che le variazioni di lunghezza delle ciglia influiscono sulla loro capacità di segnalazione e sulle funzioni16,17,18,19. Tuttavia, ci sono diverse sfide tecniche e dispendiose in termini di tempo associate alla valutazione accurata e riproducibile della lunghezza e della composizione delle ciglia.
Il sistema nervoso centrale (SNC) dei mammiferi adulti è un contesto biologico che ha rappresentato una sfida per la comprensione della morfologia e della funzione delle ciglia. Mentre sembra che i neuroni e le cellule in tutto il SNC possiedano ciglia, a causa degli strumenti e delle capacità limitate di osservare e analizzare queste ciglia una comprensione delle loro funzioni rimane sfuggente20. Ad esempio, il marcatore prototipico delle ciglia, acetilato α-tubulina, non etichetta le ciglia neuronali20. La difficoltà di studiare queste ciglia è stata in parte risolta con la scoperta di diversi recettori accoppiati a proteine G (GPCR), macchinari di segnalazione e proteine associate alla membrana che sono arricchite sulla membrana delle ciglia neuronali21,22. Tutte queste semplici osservazioni di base suggeriscono l'importanza e la diversità delle ciglia del SNC, che finora sembrano ineguagliate da altri tessuti. Ad esempio, la variazione della lunghezza delle ciglia e la localizzazione GPCR possono essere osservate in tutto il cervello, con lunghezze in alcuni nuclei neuronali diverse rispetto ad altri nuclei19,23. Allo stesso modo, il loro contenuto GPCR e il meccanismo di segnalazione completano la diversità in base alla posizione neuroanatomica e al tipo neuronale2,24, 25,26,27,28,29. Queste semplici osservazioni dimostrano che la lunghezza e la composizione delle ciglia del SNC dei mammiferi sono strettamente regolate, proprio come negli organismi modello, come Chlamydomonas reinhardtii, ma l'impatto di queste differenze di lunghezza sulla funzione delle ciglia, sulla segnalazione e, in definitiva, sul comportamento rimane poco chiaro16,30,31,32.
Misurare con precisione la lunghezza e la composizione delle ciglia si rivela una sfida tecnica soggetta a errori e irriproducibilità da parte dell'utente. Attualmente le ciglia in vivo e in vitro sono più spesso identificate utilizzando approcci immunofluorescenti che etichettano proteine ciliari o alleli reporter fluorescenti arricchiti di ciglia33,34,35. Le lunghezze di queste ciglia con tag fluorescenti vengono quindi misurate da un'immagine bidimensionale (2D) utilizzando strumenti di misurazione di linea in programmi di analisi delle immagini come ImageJ36. Questo processo non è solo noioso e laborioso, ma anche soggetto a pregiudizi ed errori. Questi stessi ostacoli sorgono quando si misurano le intensità delle ciglia, che aiutano a indicare cambiamenti nella struttura delle ciglia37. Per ridurre al minimo le incongruenze in questi tipi di analisi delle immagini, i programmi di intelligenza artificiale (Ai) stanno diventando opzioni più diffuse e convenienti38.
Ai è il progresso dei sistemi informatici che utilizzano il vantaggio degli algoritmi informatici e della programmazione per eseguire compiti che di solito richiederebbero l'intelligenza umana39. Ai dispositivi ai viene insegnato a percepire modelli, parametri e caratteristiche ricorrenti e ad intraprendere azioni per massimizzare le probabilità di creare risultati di successo. Ai è versatile e può essere addestrato a riconoscere oggetti specifici o strutture di interesse, come le ciglia, e quindi essere programmato per eseguire una varietà di analisi sugli oggetti identificati. Pertanto, i dati di immagine complessi possono essere generati rapidamente e riproducibilmente da Ai38. L'automazione e l'analisi Ai delle immagini acquisite aumenteranno l'efficacia e l'efficienza, limitando al contempo qualsiasi potenziale errore umano e bias39. Stabilire una metodologia basata sull'intelligenza artificiale per l'identificazione delle ciglia crea un modo coerente per tutti i gruppi di ricerca di analizzare e interpretare i dati delle ciglia.
Qui utilizziamo un modulo Ai per identificare le ciglia sia in vivo che in vitro su immagini 2D. Utilizzando una serie di immagini campione, l'IA viene addestrata a identificare le ciglia. Una volta completato l'addestramento, l'IA designata viene utilizzata per applicare una maschera binaria sulle ciglia identificate da Ai in un'immagine. I binari applicati dall'Ai sono modificabili, se necessario, per garantire che tutte le ciglia nelle immagini siano correttamente identificate e che l'identificazione non specifica sia eliminata. Dopo aver utilizzato l'Ai per identificare le ciglia, vengono utilizzati programmi di analisi generale (GA) personalizzati per eseguire diverse analisi come la misurazione della lunghezza delle ciglia e dell'intensità di fluorescenza. I dati raccolti vengono esportati in una tabella che può essere facilmente letta, interpretata e utilizzata per analisi statistiche (Figura 1). L'uso della tecnologia automatizzata e dell'intelligenza artificiale per identificare le ciglia e ottenere misurazioni specifiche tra gruppi sperimentali aiuterà in studi futuri volti a comprendere l'impatto della funzione e della morfologia delle ciglia del SNC sulla comunicazione e sul comportamento cellula-cellula.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Intel Xeon, 3.6 GHz, 32GB RAM</td>
			<td>Intel Corporation</td>
			<td>W-2123</td>
			<td>Processor used for running NIS Elements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements Software</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Ai and GA3 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadro RTX 4000 Graphics card</td>
			<td>NVIDIA Corporation</td>
			<td>Quadro RTX 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10 Professional 64-bit</td>
			<td>Microsoft Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Operating system used for running NIS Elements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Workstation</td>
			<td>HP Development Company, L.P.</td>
			<td>HP&#160;Z4G4</td>
			<td>Workstation used for running NIS Elements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

artificial intelligence approaches to assessing primary cilia

Le ciglia sono appendici cellulari a base di microtubuli che funzionano come centri di segnalazione per una varietà di percorsi di segnalazione in molti tipi di cellule di mammifero. La lunghezza delle ciglia è altamente conservata, strettamente regolata e varia tra diversi tipi di cellule e tessuti ed è stata implicata nell'impatto diretto sulla loro capacità di segnalazione. Ad esempio, le ciglia hanno dimostrato di alterare le loro lunghezze in risposta all'attivazione dei recettori ciliari accoppiati alla proteina G. Tuttavia, misurare in modo accurato e riproducibile le lunghezze di numerose ciglia è una procedura che richiede tempo e lavoro. Gli approcci attuali sono anche soggetti a errori e pregiudizi. I programmi di intelligenza artificiale (Ai) possono essere utilizzati per superare molte di queste sfide grazie alle capacità che consentono l'assimilazione, la manipolazione e l'ottimizzazione di set di dati estesi. Qui, dimostriamo che un modulo Ai può essere addestrato a riconoscere le ciglia nelle immagini di campioni sia in vivo che in vitro. Dopo aver utilizzato l'Ai addestrato per identificare le ciglia, siamo in grado di progettare e utilizzare rapidamente applicazioni che analizzano centinaia di ciglia in un singolo campione per lunghezza, intensità di fluorescenza e co-localizzazione. Questo approccio imparziale ha aumentato la nostra fiducia e rigore quando confrontiamo campioni provenienti da diverse preparazioni neuronali primarie in vitro e in diverse regioni del cervello all'interno di un animale e tra animali. Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata per analizzare in modo affidabile la dinamica delle ciglia da qualsiasi tipo di cellula e tessuto in modo ad alta produttività su più campioni e gruppi di trattamento. In definitiva, gli approcci basati sull'intelligenza artificiale diventeranno probabilmente standard poiché la maggior parte dei campi si sposta verso approcci meno distorti e più riproducibili per l'acquisizione e l'analisi delle immagini.

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Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia

L'uso dell'intelligenza artificiale (Ai) per analizzare le immagini sta emergendo come un approccio potente, meno parziale e rapido rispetto ai metodi comunemente usati. Qui abbiamo addestrato Ai a riconoscere un organello cellulare, ciglia primarie e analizzare proprietà come la lunghezza e l'intensità della colorazione in modo rigoroso e riproducibile.

Approcci di intelligenza artificiale per valutare le ciglia primarie

Cilia are microtubule based cellular appendages that function as signaling centers for a diversity of signaling pathways in many mammalian cell types. ...

Gli attuali metodi di analisi delle ciglia sono laboriosi e inclini a errori e pregiudizi. Il nostro approccio cerca di semplificare il tempo e gli sforzi, mitigando al contempo potenziali errori. Il vantaggio principale che questa tecnica offre è l'aumento del rigore e della riproducibilità e l'analisi quantitativa delle immagini.Questo tipo di approccio non è solo rilevante per l'analisi delle ciglia, ma può essere ampiamente applicato a molte questioni biologiche cellulari, comprese quelle che riguardano altri organelli e proteine citoscheletriche. Per iniziare, aprire il set di dati di training, selezionare file dal menu, fare clic su importa esportazione e selezionare Crea file ND dalla sequenza di file. Selezionare la cartella contenente il set di dati di training e l'elenco dei file verrà aperto al centro della finestra di dialogo.Definire manualmente l'organizzazione dei file utilizzando almeno un'opzione nel menu a discesa. Immettere i valori numerici corrispondenti sotto ciascuna opzione selezionata e selezionarne nessuno laddove le opzioni non sono selezionate. Fare clic su Converti per aprire il documento ND.Per calibrare l'immagine, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'opzione non calibrata nell'angolo in basso a sinistra dell'immagine. Fai clic su Calibra documento, quindi fai clic su Dimensioni pixel, inserisci il valore e fai clic su OK. Selezionare i controlli di analisi della vista, aprire la barra degli strumenti binaria e selezionare rileva automaticamente o disegna l'oggetto a mano per identificare le ciglia tracciando con precisione le singole strutture ciliari su tutti i fotogrammi aperti.Per addestrare l'IA, selezionare nis. ai, fai clic su segmento treno. ai per aprire il segmento del treno.ai e quindi selezionare il canale sorgente da utilizzare per l'allenamento. Selezionare i file binari GroundTruth appropriati per addestrare l'IA. Seleziona il numero richiesto di iterazioni per addestrare l'IA in base alle dimensioni e alla distribuzione del binario, quindi seleziona la cartella di destinazione per salvare il file AI addestrato e fai clic su Train per addestrare il software. Questo processo richiede diverse ore.Aprire le immagini confocali sperimentali delle ciglia come descritto in precedenza convertendo il campione. TIF in file ND2. Nella finestra pop-up, seleziona multi-punto dal primo menu a discesa e inserisci un valore corrispondente al numero totale delle immagini.Nella seconda casella a discesa, selezionare la lunghezza d'onda e modificare il valore sul numero totale dei canali nella cartella. Il software sbloccherà automaticamente una finestra di selezione della lunghezza d'onda, situata in basso, all'estremità destra della finestra pop-up. Nella finestra di selezione della lunghezza d'onda, utilizzare il menu a discesa del colore per selezionare il colore di ciascun canale.Fornisci a ciascun canale un nome diverso sotto la colonna del nome. Una volta aggiornate tutte le informazioni, fai clic su Converti. Calibrare le immagini come descritto in precedenza.Assicurarsi che la dimensione in pixel del set di dati sperimentale sia coerente con quella del set di dati di training. Identifica le ciglia sul primo canale utilizzando l'IA addestrata del passaggio precedente. Aperto nis.ai dal menu, seleziona segmento. ai, quindi selezionare AC3 nei canali sorgente. Quindi identificare le ciglia sul secondo canale selezionando MCHR1 nei canali sorgente.Il software disegnerà binari sulle ciglia etichettate. Quindi controllare le immagini per eventuali file binari identificati erroneamente. Selezionare Elimina oggetto nella barra degli strumenti binari per eliminare manualmente i file binari identificati in modo errato.Una volta che le ciglia sono state identificate e segmentate, analizzare diversi parametri di ciglia, come lunghezze e intensità, utilizzando lo strumento di analisi generale tre. Seleziona l'immagine dal menu e fai clic su nuova ricetta GA3. Verrà aperta una nuova finestra con uno spazio vuoto al centro.GA3 rileverà automaticamente i file binari opportunamente etichettati in base all'IA e includerà il nodo corrispondente. GA3 rileverà automaticamente anche i canali nelle immagini e visualizzerà le loro schede sotto i canali. L'IA segmenterà tutte le ciglia come oggetti nel telaio e rileverà le ciglia incomplete lungo i bordi del telaio.Per rimuoverli, selezionare Elaborazione binaria, Rimuovi oggetti, quindi trascinare il nodo Dei bordi di tocco nello spazio vuoto e connettere il nodo ai file binari appropriati. Per misurare la lunghezza delle ciglia, selezionare dimensione dell'oggetto di misurazione e quindi lunghezza. Trascinare e rilasciare il parametro al centro e connettersi al nodo binario appropriato.Per misurare l'intensità delle ciglia, selezionare l'intensità di un oggetto. Trascina e rilascia il parametro al centro e connettiti al nodo binario e al canale di interesse appropriati. Nel menu di misurazione, vai alla ratiometria degli oggetti e seleziona il coefficiente di Mander per impostare il percorso di colocalizzazione in GA3 misurando la sovrapposizione di due canali all'interno delle singole ciglia.Trascina e rilascia il nodo coefficiente di Mander nello spazio vuoto e collegalo al binario e ai canali appropriati. ApEn le misure e la singola tabella aprendo il menu di gestione dei dati. Nella categoria di base, selezionare la colonna ApEn e quindi fare clic su Esegui ora per misurare le ciglia.Tutte le misurazioni appariranno in un'unica tabella di output. Le immagini rappresentative mostrano che l'IA addestrata ha identificato correttamente le ciglia in vitro nelle immagini di cellule IMCD, colture ipotalamiche primarie e colture ippocampali, ma nessun'altra struttura non ciliare come i ponti citocinetici. La lunghezza delle ciglia variava da 0,5 a 4,5 micrometri nelle cellule IMCD e da due a 12 micrometri nella coltura ipotalamo e ippocampale.L'IA ha misurato le lunghezze delle ciglia marcate AC3 in vivo nelle immagini delle nostre regioni del nucleo arcuato, del nucleo paraventricolare e del cornu ammonis. Secondo l'analisi, le ciglia ipotalamiche in vivo variavano da uno a 15 micrometri, come si vede nelle barre bianche e marroni. Mentre le ciglia e la regione del cornu ammonis variavano da uno a 10 micrometri, come si vede nelle barre grigie.È interessante notare che l'intensità dell'MCHR1 ciliare era più forte nel nucleo paraventricolare rispetto a quella nel nucleo arcuato. Le intensità di MCHR1 contro AC3 sono state tracciate per misurare la loro sovrapposizione. La maggior parte delle ciglia erano positive per entrambi i marcatori, mentre alcune ciglia erano positive per AC3 o MCHR1.Per quantificare la colocalizzazione di MTHR1 all'interno di AC3, è stato misurato il coefficiente di sovrapposizione di Mander e c'è stato un aumento significativo della sovrapposizione nel nucleo paraventricolare rispetto al nucleo arcuato. Per misurare l'intensità lungo la lunghezza delle ciglia, la polarità delle ciglia è stata definita utilizzando Centrin2-GFP come marcatore del corpo basale. Ciò ha permesso di distinguere la base delle ciglia dalle punte delle ciglia positive alla ciliegia ARL13B-M.Cambiamenti nell'intensità di ARL13B lungo la lunghezza delle ciglia sono stati osservati dove l'intensità di ARL13B era più alta alla base che sulla punta del cilio nel nucleo arcuato, visto a sinistra, così come PVN, come visto a destra. Quando si analizzano i dati con questo approccio, è importante assicurarsi che la qualità e la risoluzione del set di dati sperimentali siano coerenti con quelle utilizzate per addestrare l'IA. L'utilità principale di questo approccio è dopo aver rilevato le ciglia da parte dell'IA, l'utente può essere creativo su quali proprietà vengono analizzate personalizzando il flusso di lavoro di analisi integrato all'interno del software.

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