Name: artificial intelligence approaches to assessing primary cilia
Uploaded: 2021-05-01T14:00:00
Duration: 8 min 58 s
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この研究は、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所R01 DK114008がNFBに資金を提供し、米国心臓協会フェローシップ・グラント#18PRE34020122 RBに資金提供しました。ニコンソフトウェア、メリッサ・ベントレー、コートニー・ヘイクラフト、テレサ・マストラチのリッチ・グルースキンゼネラルマネージャーに感謝します。

1. 生画像を取得する
<ol><li>必要に応じて、修正および免疫標識サンプル20.<ol>
<li>ナイキスト解像度と同じピクセルサイズを使用して最大ビット深度で共焦点顕微鏡を使用した画像繊毛。</li>
		<li>イメージをモノクロタグ付き画像フォーマット(.tif)ファイルとしてエクスポートします。 注: このプロトコルは、特にNIS Elementsソフトウェア内でAiモジュールを使用する方法を概説しています。イメージが .nd2 ファイルとして取得された場合、イメージを.tifファイルとしてエクスポートする必要はありません。別のシステムで画像を取得した場合、NIS Elementsライセンスを別途購入することができ、次の手順で説明する.tifファイルを変換できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 繊を識別するためにAiを訓練する
<ol><li>トレーニング データセットを開きます。<ol>
<li>ソフトウェアをトレーニングし、1 つのフォルダーにコピーするには、フレームごとに少なくとも 1 つの cilium を持つサンプル イメージを約 50 個選択します。このフォルダは、イメージを開くときにソフトウェアを指示するために使用されます。1 つの ND2 ドキュメント内でこれらの 50 フレームを開き、フレームごとに少なくとも 1 つの cilium を使用します。[ ファイル>インポート/エクスポート] > [ファイル シーケンスから ND ファイルを作成] を選択します。</li>
		<li>トレーニング データセットを含むフォルダを選択します。ダイアログ ウィンドウの中央にファイルの一覧が表示されます。上記のドロップダウン メニューで少なくとも 1 つのオプションを使用して、ファイルの編成を手動で定義します。オプションはマルチポイント(複数の最大投影ファイルの場合)、Zシリーズ(zスタック画像の場合)、時間(タイムラプス画像の場合)、波長(複数のチャンネルのファイルの場合)です。</li>
		<li>選択した各オプションの下に対応する数値を入力します。オプションが選択されていない場合は 、[なし ] を選択します。[ 変換 ] をクリックして ND ドキュメントを開きます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>画像を調整します。<ol>
<li>イメージの左下隅にピクセル サイズを入力します> >。</li>
	</ol>
</li>
	<li>繊毛を特定する。<ol>
<li>バイナリ ツールバーの[自動検出] または[オブジェクトの描画] を使用して、開いているすべてのフレームの個々の毛様体構造を正確にトレースして、繊毛を手で識別します。これにより、対象のオブジェクトにバイナリマスクが描画されます。これらのバイナリは、将来の実験画像解析において、ピクセルベースの特性に関する繊毛を識別するためのソフトウェアをトレーニングするためのサンプルオブジェクトとして機能します。[オブジェクト>描画] をクリックして、[バイナリ ツールバー] > [オブジェクト>描画] を選択します。 注:ソフトウェアは、開いているすべてのフレームのバイナリを検出できない限り、トレーニングを開始しないので、バイナリを持たないフレームを削除します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ai列車。<ol>
<li>ソフトウェアのトレーニングを開始します。これで電車の Segment.ai ボックスが開きます。 [NIS.ai >列車 Segment.ai]を選択します。</li>
		<li>[ トレーニング Segment.ai ボックスで、トレーニングに使用するソース チャネルを選択します。複数のチャンネルのファイルが開いている場合は、送信元チャンネルとして 1 つのチャンネルのみを選択します。次に、Aiを訓練する適切な地上真理バイナリを選択します。最後に、バイナリのサイズと分布に応じて Ai のトレーニングに必要な反復回数を選択します。 注: バイナリが周囲から容易に検出でき、画像全体に十分に配布されている場合、ソフトウェアは画像を識別するためのトレーニングを受けるために 1000 回未満の反復処理が必要な場合があります。画像の信号対雑音比が低い場合は、トレーニング中に少なくとも 1000 回の反復を実行して、Ai が高い信頼度でテスト サンプル内の繊毛を識別できるようにするのが理想的です。</li>
		<li>トレーニング済みの Ai ファイル (.sai) を保存する保存先フォルダを選択し、[ トレーニング ] をクリックしてソフトウェアをトレーニングします。ソフトウェアは、トレースされたバイナリに基づいて繊毛を識別するために自分自身を訓練するために進みます。このプロセスには数時間かかります。 注: トレーニング時に、ソフトウェアはトレーニングの損失を示すグラフを表示します。グラフは当初、テーパリング前にスパイクを示し、理想的には残りのトレーニングでプラトースで1%の損失を出します。[トレーニング Segment.ai] ボックスの [グラフ スクリーンショットの保存 ] ボックス (補足図 1)をオンにして、グラフを後で参照するためにグラフを保存します。</li>
		<li>トレーニングをさらに絞り込む必要がある場合は、同じデータセットでトレーニングを続けます。または、まったく同じパラメーターを使用して新しいデータセットをトレーニングします。異なるパラメータや対象のオブジェクトが異なる新しいデータセットで、すでに訓練された Ai をトレーニングすることはお勧めしません。[ トレーニング segment.ai >トレーニングを続行>トレーニング済み Ai ファイルを選択します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 訓練を受けたAiを使用して繊毛を識別する
<ol><li>実験データセットを開きます。<ol>
<li>手順 2.1 と同様に、サンプル .tif ファイルを .nd2 ファイルに変換して、ソフトウェアの cilia の実験的な共焦点イメージを開きます。[ ファイル>インポート/エクスポート] > [ファイル シーケンスから ND ファイルを作成] を選択します。 注: 画像は Ai のトレーニングに使用されるものと同じピクセルサイズにする必要があります。イメージが既に ND2 形式の場合は、手順 3.3 に進みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>画像を調整します。<ol>
<li>イメージの左下隅にピクセル サイズを入力します。[ドキュメント>ピクセル サイズを調整 >、キャリブレーションが行されていない] を右クリックします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>開いたファイルに対して訓練を受けた Ai を実行します。<ol>
<li>Aiを使用して繊毛の識別を開始します。ソフトウェアは、前のステップで受けたトレーニングに基づいて繊毛にバイナリを描画します。このプロセスには数秒かかります。[ NIS.ai > Segment.ai] を選択します。 注:複数のチャンネルが開いている場合、ソフトウェアはチャンネルを選択するように求められます。チャンネルは、それぞれの名前でここに表示されます。選択されていない場合は、[モノ] とマークされたボックスが自動的に選択されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>誤って識別されたバイナリのイメージを確認します。<ol>
<li>Aiが繊毛を特定し、バイナリを描画したら、誤って識別されたオブジェクトがないか画像を確認します。必要に応じて、誤って識別されたバイナリを手動で削除します。[ オブジェクト >の削除] > [バイナリ ツール バー] > [解析コントロールの表示] を選択します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 繊毛の長さと強度の測定
<ol><li>新しい一般分析 3 (GA3) レシピを作成します。<ol>
<li>繊毛が特定され、セグメント化されたので、GA3 ツールを使用して長さや強度などの繊毛のさまざまなパラメータの解析に進みます。これにより、新しいウィンドウが開き、中央に空白が表示され、解析が定義されます。 [イメージ>新しい GA3 レシピ]を選択します。 
</li>
	</ol>
</li>
	<li>分析するバイナリを選択します。<ol>
<li>繊毛はすでに Segment.ai を使用してセグメント化されているため、GA3 は Ai に従って適切にラベル付けされたバイナリを自動的に検出し、ノードを含めます。[バイナリ>自動Detect_AI ] または [ バイナリ>描画Object_AI ] を選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>解析に必要なチャンネルを選択します。GA3 は、画像内のチャネルを自動的に検出し、そのタブを [チャネル]の下に表示します。</li>
	<li>フレームの境界に接するオブジェクトを削除します。<ol>
<li>Ai はフレーム内のすべての繊毛をオブジェクトのようにセグメント化するため、フレームのエッジに沿って不完全な繊毛も検出します。これらのオブジェクトは、ステップ 3.4 で手動で削除することも、GA3 で自動的に削除することもできます。[2 進処理> [接する境界>オブジェクトを削除する] を選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>繊毛を測定するパラメータを選択します。<ol>
<li>パラメータをドラッグ&ドロップして、繊毛の長さ (長さ) や強度 (合計オブジェクトの強度) などの測定を行います。ノードを適切なバイナリ ノード (接続 A) とチャネル ノード (接続 B) に接続します。ノード接続にカーソルを合わせると、ノードがどの接続に属しているかを示すツールチップが表示されます。 [計測>オブジェクトサイズ>長さ ]および [計測]>[オブジェクトの強度]>[合計]を選択します。 注: ノード の長さは バイナリ ノードにのみ接続され、 合計 Obj 強度は バイナリ ノードとチャネル ノードの両方に接続されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 つのテーブルに測定値を追加します。<ol>
<li>ノードの 追加列を分析フローチャートにドラッグアンドドロップして、すべての測定値を単一の出力テーブルに結合し、それを測定ノードの 長さ および 合計 Obj の強度に接続します。 [ データ管理>基本>列の追加]を選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>繊毛を測定する。<ol>
<li>[ 実行] をクリックして、繊毛を測定します。このプロセスは、実験画像内のすべての繊毛を測定するのに少し時間がかかります。長さと強度は、新しい 解析結果 ウィンドウに表示されます。 注: テーブルには、Ai が繊毛と認識したが、小さすぎて人間の目で検出できない、ステップ 3.4 で除去されたマスクからのデータが含まれることがあります。これらのオブジェクトは、統計分析の前にフィルターを使用して、データ・セットから除去することができます。ここでは、インビボ繊毛用の図2および2μmのインビトロ繊毛長測定に1μmのフィルターを使用しました。これは、以下の経路を使用してデータをエクスポートする前に行うことができます。[解析結果] ウィンドウ>フィルタを定義>[フィルタを使用] >値を入力します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>統計分析のためにデータをエクスポートします。</li>
</ol>5. 共同ローカリゼーション研究
注: 共局在分析は、繊毛の長さと強度分析の測定に使用される同じ GA3 レシピに含めることができます。同じレシピを使用する場合は、以下に説明するようにファイルを開き、同じ分析パイプライン内の共局在化係数とともに両方のチャネルの長さと強度を測定します。
<ol><li>実験データセットを開きます。<ol>
<li>サンプルファイルを.nd2ファイルに変換して、ソフトウェアのcilia .tifの実験的な共焦点画像を開きます。[ ファイル>インポート/エクスポート] > [ファイル シーケンスから ND ファイルを作成] を選択します。</li>
		<li>ポップアップ ウィンドウで、ポップアップ ウィンドウの最初の列にあるウィンドウ エクスプローラから、関心のあるすべてのチャネルから 16 ビットの深度モノクロ ファイルを選択します。最初のドロップダウン メニューから [マルチポイント ] または [Z シリーズ ] を選択し、それぞれイメージまたはスタックの合計数に対応する値を入力します。</li>
		<li>2 番目のドロップダウン ボックスで、[波長] を選択し、値をフォルダ内のチャネルの合計数に変更します。ソフトウェアは自動的にポップアップウィンドウの右下の端にある波長選択ウィンドウのロックを解除します。[色] ドロップダウン メニューを使用して、各チャネルの色を選択します。[名前] 列に、各チャネルに異なる名前を指定します。すべての情報が更新されたら、[変換] をクリックします。ソフトウェアは自動的に選択したすべてのチャンネルからすべての個々のイメージでオーバーレイすべての画像ファイルを生成します。</li>
	</ol></li>
	<li>画像を調整します。<ol>
<li>イメージの左下隅にピクセル サイズを入力します。[ドキュメント>ピクセル サイズを調整 >、キャリブレーションが行されていない] を右クリックします。</li>
	</ol></li>
	<li>最初のチャンネルで訓練された Ai を実行します。<ol>
<li>開いているチャネル(例えば、ACIII;など)の1つで繊毛の識別を開始します。 図 5A)Ai を使用します。ソフトウェアは、このチャンネルで受けたトレーニングに基づいて、ACIIIラベル付き繊毛にバイナリを描画します。このプロセスには数秒かかります。 ACIII NIS.ai > Segment.ai >ソースチャンネル>選択します。</li>
	</ol></li>
	<li>訓練された Ai を 2 番目のチャンネルで実行します。<ol>
<li>開いている他のチャネル (MCHR1 など) で繊毛の識別を開始します。 図 5B)Ai を使用します。ソフトウェアは、このチャンネルで受けたトレーニングに基づいて、MCHR1ラベル付き繊毛にバイナリを描画します。このプロセスには少し時間がかかります。 MCHR1 >NIS.ai > Segment.ai >ソースチャンネルを選択します。</li>
	</ol></li>
	<li>誤って識別されたバイナリのイメージを確認します。<ol>
<li>Ai が繊毛を識別し、バイナリを描画したら、画像で誤って識別されたオブジェクトがないか確認します。誤って識別されたバイナリを必要に応じて手動で削除します。[ バイナリ ツールバー>オブジェクトの削除] > [ビュー >分析コントロール]を選択します。
</li>
	</ol></li>
	<li>新しい GA3 レシピを作成します。<ol>
<li>繊毛が特定され、セグメント化された後、GA3 ツールを使用して共局在化分析に進みます。これにより、新しいウィンドウが開き、中央に空白が表示され、解析が定義されます。識別されたすべてのバイナリとチャネルを含むウィンドウが生成されます。解析に必要なすべてのチャネルとバイナリが存在し、選択されていることを確認します。 [イメージ>新しい GA3 レシピ] を選択します。</li>
	</ol></li>
	<li>フレームの境界に接するオブジェクトを削除します。<ol>
<li>Ai はフレーム内のすべての繊毛状オブジェクトをセグメント化するため、フレームのエッジに沿って不完全な繊毛も検出します。これらのオブジェクトは、ステップ 5.5 で手動で削除するか、GA3 で自動的に削除することができます。[2 進処理] > [接する境界線>オブジェクトを削除する] を選択します。
</li>
	</ol></li>
	<li>GA3 で共局在化経路を設定します。<ol>
<li>繊毛内の2つのチャンネルのオーバーラップを測定するには、マンダーの係数相関を使用します。 [Manders 係数 ] ノードを GA3 レシピの空白スペースにドラッグ アンド ドロップし、適切なバイナリとチャネルに接続します。ここで、「接続A」はACIIIバイナリ、MCHR1チャンネルとの「接続B」、ACIIIバイナリ内のMCHR1のオーバーラップを決定するACIIIチャンネルとの「接続C」と接続します。[ 測定>オブジェクト比測定>マダ係数] を選択します。 注: ソフトウェアは、このプロトコル40で説明されているのと同じ手順を使用してピアソン係数相関を使用して共局化を測定することができます。</li>
	</ol></li>
	<li>1 つのテーブルに測定値を追加します。<ol>
<li>すべての測定値を 1 つの出力テーブルに結合します。[ データ管理>基本>列の追加]を選択します。</li>
	</ol></li>
	<li>共ローカライズを測定します。<ol>
<li>[ 実行] をクリックして、繊毛を測定します。このプロセスは、実験画像内のすべての繊毛を測定するのに少し時間がかかります。データは新しい [解析結果] ウィンドウに表示されます。</li>
	</ol></li>
	<li>統計分析のためにデータをエクスポートします。</li>
</ol>

共著者のウェスリー・ルイスはニコンの従業員です。財務上の開示はありません。

長さおよび強度の測定は、一次繊毛を分析する一般的な方法であるが、フィールドで使用される標準化された従来の方法はない。ImageJなどのソフトウェアを使用したプライマリ繊毛の同定と定量化は時間がかかり、ユーザーの偏見やエラーが発生しやすい。そのため、大規模なデータセットを正確に分析することが困難になります。ここでは、Aiプログラムを使用することで、これらの課題の多くを克服し、プライマリ繊毛の高スループット分析を達成できることを示します。ここでは、Aiベースのアプリケーションをトレーニングしてプライマリ繊毛を認識する手順を説明し、長さと強度を分析するために必要な手順を概説する。
繊毛を認識するためのAiの最初の訓練は、ユーザーからかなりの時間を必要としますが、完了したら、同じパラメータで取得した任意のデータセットで使用することができます。Ai によって生成されたバイナリ マスクは、エラーを修正できるように変更可能です。しかし、繊毛識別のエラーは、Aiが追加の画像でさらに訓練される必要があることをユーザーに知らせる必要があります。この方法の大きな利点の1つは、Aiが2Dと3Dの両方で異なるサンプルタイプで繊毛を認識するように訓練できることです。ラボ内で生成された以前の分析方法には、同定のための手動閾値の使用を必要とすることや、細胞密度が高い組織切片から画像化された繊毛を識別する問題など、さまざまな制限があります。これらの方法は、繊毛分析にも特化していますが、NIS Elementsソフトウェアを使用した解析では、画像のいくつかの側面を同時に評価できます。ここで説明するAiはNIS Elementsソフトウェアパッケージの一部であるため、ニコン顕微鏡を用いて撮影した画像を解析まで容易に継続することができます。ただし、この方法を使用するためにニコンによるイメージングは必要ありません。キャプチャされた生データファイル形式に関係なく、「.tif」ファイルは、Aiで使用するためにNIS Elementsによって開くことができます。
NIS要素内のこのAiアプリケーションは広く利用可能であり、おそらくすでに一次繊毛を研究するラボで使用されている画像解析ソフトウェアの一部です。Ai技術の普及に伴い、他のイメージングソフトウェアは、同様のAiモジュールを含むように分析オプションを拡大する可能性があります。繊毛同定にAi分析を適用することは、繊毛分析のいくつかの異なる側面に使用することができる。長さ (図 2 と 3)などの単純な分析の方法を概説しましたが 、強度 (図 4) と共局化 ( 図5) 図 6のように、より高度な分析を GA3 分析ワークフローに追加できます。例えば、完全なシリウムの強度を測定する代わりに、シリウムのサブ領域内の強度の違いは、副毛様配置を評価するために関心がある場合があります。シリウムのサブ領域内の強度の違いは、タンパク質が繊毛48の先端でグリタンパク質がどのように濃縮されるかなど、シリウムの先端または塩基に蓄積していることを示している可能性がある。さらに、このAiアプリケーションは、遺伝子型または治療群間の違いを容易に識別するために使用することができる。私たちの研究室では、主に脳の切り離しや神経細胞培養から画像化された繊毛を分析するためにこの方法を使用していますが、様々な細胞株や他の組織タイプから取得した画像に適用することができます。この応用が可能なサンプルタイプの柔軟性は、この分析方法を、一次繊毛を研究する多くの異なるグループや、ミトコンドリア、核、ERなどの評価対象となる離散オルガネラにとって有益な分析方法です。

原発性繊毛は、ほとんどの哺乳類細胞タイプ1、2、3、4から突き出た感覚オルガネラである。それらは一般に細胞外シグナル5、6、7を統合することによって多様な細胞シグナル伝達経路を調整するために重要な孤独な付属物である。原発性繊毛は、胚発生および成人組織恒常性の間に重要な役割を果たし、その機能または形態の破壊は、集団的にシリオパシーと呼ばれるいくつかの遺伝性疾患に関連している。繊毛の近く遍在性のために、繊毛症は、すべての臓器系8、9、10、11、12に影響を与えることができる幅広い臨床特徴に関連付けられている。毛様症の動物モデルにおいて、毛様体構造またはシグナル伝達能力の喪失は、高phagia関連肥満3、13、14、15を含むいくつかの臨床的に関連するフェノタイプにおいて現れる。多くのモデルシステムでは、繊毛の長さの変化が信号容量と機能16、17、18、19に影響を与えることを示している。しかし、繊毛の長さと組成を正確かつ再現的に評価することに関連する、いくつかの時間と技術的な課題があります。
成人哺乳類中枢神経系(CNS)は、繊毛の形態と機能を理解するための課題を提起している1つの生物学的文脈である。CNS全体のニューロンと細胞は繊毛を持っているように見えますが、これらの繊毛を観察して分析するツールや能力が限られているため、それらの機能の理解は依然として不可解な20のままです。例えば、原型繊毛マーカーは、アセチル化α-管状リン、神経細胞繊毛20に標識しない。これらの繊毛を研究することの難しさは、いくつかのGタンパク質共役受容体(GPCR)の発見によって部分的に解決され、神経繊毛21,22の膜上に富むシグナル伝達機械および膜関連タンパク質が含まれる。これらの簡単な基本的な観察のすべては、これまでのところ他の組織によって比類のないように見えるCNS繊毛の重要性と多様性を示唆しています。例えば、繊毛の長さおよびGPCRの局在の変動は、脳全体で観察することができ、あるニューロン核の長さは他の核19,23と比較すると異なっている。同様に、GPCR含有量とシグナル伝達機械の賛辞は、神経解剖学的位置と神経タイプ2、24、25、26、27、28、29に基づいて多様性を示す。これらの単純な観察は、クロミドマス・ラインハルトイのようなモデル生物と同様に、哺乳類のCNS繊毛の長さと組成が厳しく調節されていることを示しているが、これらの長さの違いが繊毛機能、シグナリングおよび最終的な挙動に及ぼす影響は、16、30、31、32のままである。
繊毛の長さと構成を正確に測定することは、ユーザーの誤りや再現性の問題が起こりやすい技術的課題であることが証明されています。現在、生体内およびインビトロにおける繊毛は、毛様体タンパク質または繊毛濃縮蛍光レポーターアレス33、34、35を標識する免疫蛍光アプローチを用いて最も頻繁に同定される。次に、これらの蛍光タグ付き繊毛の長さは、ImageJ36などの画像解析プログラムの線測定ツールを使用して2次元(2D)画像から測定されます。このプロセスは、退屈で労働集約的であるだけでなく、偏見や誤りが生じやすくなります。これらの同じ障害は、繊毛の構造37の変化を示す繊毛強度を測定するときに発生します。これらのタイプの画像解析における不整合を最小限に抑えるため、人工知能(Ai)プログラムは、より一般的で手頃な価格のオプション38になってきています。
Aiは、コンピュータアルゴリズムとプログラミングの利点を利用して、通常は人間の知能39を必要とするタスクを実行するコンピュータシステムの進歩です。Aiデバイスは、繰り返し発生するパターン、パラメータ、特性を知覚し、成功した結果を生み出す確率を最大化するためのアクションを実行するように教えられています。Ai は汎用性が高く、特定のオブジェクトや cilia などの目的の構造を認識するようにトレーニングを受けることができ、その後、識別されたオブジェクトに対してさまざまな解析を実行するようにプログラムできます。したがって、複雑な画像データは、Ai38によって迅速かつ再現的に生成することができる。キャプチャした画像の自動化とAi分析は、潜在的な人為的ミスとバイアスを制限しながら、有効性と効率を高めます39.繊毛同定のためのAiベースの方法論を確立することは、すべての研究グループが繊毛データを分析し、解釈するための一貫した方法を作成します。
ここでは、Aiモジュールを利用して 、生体内 およびイン ビトロの両方を 2D画像で同定します。サンプル画像のセットを使用して、Aiは繊毛を識別するために訓練されます。トレーニングが完了すると、指定されたAiを使用して、画像内のAi識別繊毛の上にバイナリマスクを適用します。Aiによって適用されるバイナリは、必要に応じて変更可能であり、画像内のすべての繊毛が適切に識別され、非特異的な識別が排除されるようにします。Aiを利用して繊毛を同定した後、カスタム構築の一般分析(GA)プログラムを使用して、繊毛の長さや蛍光強度の測定など、さまざまな分析を行います。収集されたデータは、簡単に読み取り、解釈、統計分析に使用できるテーブルにエクスポートされます(図1)。自動化技術とAiを用いて繊毛を同定し、実験群間で特定の測定値を得ることが、CNS繊毛機能と形態学が細胞細胞のコミュニケーションと行動に及ぼす影響を理解することを目的とした今後の研究に役立つ。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Intel Xeon, 3.6 GHz, 32GB RAM</td>
			<td>Intel Corporation</td>
			<td>W-2123</td>
			<td>Processor used for running NIS Elements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements Software</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Ai and GA3 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadro RTX 4000 Graphics card</td>
			<td>NVIDIA Corporation</td>
			<td>Quadro RTX 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10 Professional 64-bit</td>
			<td>Microsoft Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Operating system used for running NIS Elements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Workstation</td>
			<td>HP Development Company, L.P.</td>
			<td>HP&#160;Z4G4</td>
			<td>Workstation used for running NIS Elements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

artificial intelligence approaches to assessing primary cilia

Ciliaは、多くの哺乳類細胞型における多様なシグナル伝達経路のシグナル伝達センターとして機能する微小管ベースの細胞付属物である。繊毛の長さは、高度に保存され、厳しく調節され、異なる細胞タイプと組織間で異なり、そのシグナル伝達能力に直接影響を与える関係があります。例えば、繊毛は毛様体Gタンパク質共役受容体の活性化に応答してそれらの長さを変化させることが示されている。しかし、多数の繊毛の長さを正確かつ再現的に測定することは、時間と労力を要する手順です。現在のアプローチもエラーやバイアスが起こりやすいです。人工知能(Ai)プログラムは、広範なデータセットの同化、操作、最適化を可能にする機能により、これらの課題の多くを克服するために利用することができます。ここでは、Aiモジュールが 生体内 および インビトロ サンプルの両方からの画像で繊毛を認識するように訓練できることを実証する。訓練されたAiを使用して繊毛を同定した後、我々は、長さ、蛍光強度および共局在化のための単一のサンプルで何百もの繊毛を分析するアプリケーションを設計し、迅速に利用することができる。この公平なアプローチは、 インビトロの 異なる主要なニューロンの準備からのサンプルを比較するときだけでなく、動物内および動物間の異なる脳領域間で私たちの自信と厳しさを高めました。さらに、この技術は、複数のサンプルおよび治療群にわたって高スループットの方法で任意の細胞タイプおよび組織からの繊毛ダイナミクスを確実に分析するために使用することができる。最終的には、ほとんどの分野が画像取得と解析のためのバイアスが少なく、より再現性の高いアプローチに向かうにつれて、Aiベースのアプローチが標準になる可能性が高くなります。

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Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia

画像を分析する人工知能(Ai)の使用は、一般的に使用される方法と比較して、強力でバイアスが少なく、迅速なアプローチとして浮上しています。ここでは、細胞小器官、一次繊毛を認識し、厳密かつ再現可能な方法で長さや染色強度などの特性を分析するためにAiを訓練しました。

一次繊毛の評価に対する人工知能のアプローチ

Cilia are microtubule based cellular appendages that function as signaling centers for a diversity of signaling pathways in many mammalian cell types. ...

現在の繊毛分析法は労働集約的で、誤りや偏りが生じやすい。当社のアプローチは、潜在的なエラーを軽減しながら、時間と労力を合理化することを目指しています。この技術が提供する主な利点は、厳格さと再現性と定量画像分析の増加です。この種のアプローチは、繊毛分析に関連するだけでなく、他のオルガネラや細胞骨格タンパク質を扱う細胞生物学的な質問を含む多くの細胞生物学的質問に広く適用することができます。開始するには、トレーニング データセットを開き、メニューからファイルを選択し、[インポート エクスポート] をクリックして、[ファイル シーケンスから ND ファイルを作成] を選択します。トレーニング データセットを含むフォルダを選択すると、ダイアログ ウィンドウの中央にファイルのリストが表示されます。ドロップダウンメニューの少なくとも1つのオプションを使用して、ファイルの編成を手動で定義します。選択した各オプションの下に対応する数値を入力し、オプションが選択されていない場合は選択しません。[変換] をクリックして ND ドキュメントを開きます。画像を調整するには、イメージの左下隅にあるキャリブレーションされていないオプションを右クリックします。[ドキュメントの調整] をクリックし、[ピクセル サイズ] をクリックして値を入力し、[大丈夫] をクリックします。ビュー解析コントロールを選択し、バイナリツールバーを開き、開いているすべてのフレーム上の個々の毛様構造を正確にトレースすることで、自動検出またはオブジェクトを描画して、識別する繊毛を手で描きます。AI のトレーニングには、nis を選択します。ai、 列車セグメントをクリックします。aiは列車セグメントを開きます。ai ボックスをクリックし、トレーニングに使用するソース チャネルを選択します。AI をトレーニングするための適切な GroundTruth バイナリを選択します。バイナリのサイズと分布に応じて AI をトレーニングするために必要な反復回数を選択し、トレーニング済みの AI ファイルを保存する対象フォルダを選択し、[トレーニング] をクリックしてソフトウェアをトレーニングします。このプロセスには数時間かかります。サンプルを変換して、前に説明したように繊毛の実験共焦点画像を開きます。TIF ファイルを ND2 ファイルにします。ポップアップメニューで、最初のドロップダウンメニューからマルチポイントを選択し、画像の総数に対応する値を入力します。2 番目のドロップダウン ボックスで、波長を選択し、値をフォルダー内のチャネルの合計数に変更します。ソフトウェアは自動的にポップアップウィンドウの下、右端に位置する波長選択ウィンドウのロックを解除します。波長選択ウィンドウで、色ドロップダウンメニューを使用して各チャンネルの色を選択します。各チャネルに名前列の下に別の名前を指定します。すべての情報が更新されたら、[変換] をクリックします。前に説明したように画像を調整します。実験データセットのピクセル サイズがトレーニング データセットのピクセル サイズと一致していることを確認します。前の手順でトレーニングされた AI を使用して、最初のチャネルで CILIA を識別します。nis を開きます。メニューから、セグメントを選択します。ai を選択し、ソースチャンネルで AC3 を選択します。次に、ソースチャンネルでMCHR1を選択して、2番目のチャンネルで繊毛を識別します。ソフトウェアは、ラベル付きの繊毛にバイナリを描画します。次に、誤って識別されたバイナリがないか画像を確認します。誤認されたバイナリを手動で削除するには、バイナリツールバーでオブジェクトの削除を選択します。繊毛が特定され、セグメント化されたら、一般的な解析 3 つのツールを使用して、長さや強度などの異なる繊毛パラメータを分析します。メニューから画像を選択し、新しいGA3レシピをクリックします。中央に空白が入った新しいウィンドウが開きます。GA3 は、AI に従って適切にラベル付けされたバイナリを自動的に検出し、対応するノードを含めます。GA3は画像内のチャンネルを自動的に検出し、チャンネルの下にタブを表示します。AI は、フレーム内のすべての繊毛をオブジェクトのようにセグメント化し、フレームのエッジに沿って不完全な繊毛を検出します。これらを削除するには、バイナリ処理を選択し、オブジェクトを削除し、接触する境界線ノードを空白領域にドラッグして、ノードを適切なバイナリに接続します。繊毛の長さを測定するには、計測オブジェクトのサイズを選択してから、長さを選択します。パラメータを中央にドラッグアンドドロップし、適切なバイナリノードに接続します。マンダーの係数ノードを空白スペースにドラッグアンドドロップし、適切なバイナリとチャンネルに接続します。データ管理メニューを開いて、測定値と単一テーブルを取得します。基本カテゴリで[ApEn]列を選択し、[今すぐ実行]をクリックして繊毛を測定します。すべての測定値は、単一の出力テーブルに表示されます。代表的な画像は、訓練を受けたAIがIMCD細胞、一次視床下部培養および海馬培養物の画像において繊毛in vitroを適切に同定したが、サイトキネティック橋のような他の非毛様体構造がないことを示している。繊毛の長さは、IMCD細胞では0.5〜4.5マイクロメートル、視床下部および海馬培養では2〜12マイクロメートルの範囲である。AIは、私たちのアークアテ核、傍室核およびコルヌアンモニス1つの領域の画像で生体内で標識された繊毛の長さを測定しました。分析によると、インビボの視床下部繊毛は、白と茶色のバーに見られるように、1〜15マイクロメートルの範囲でした。繊毛とコルヌアンモニス領域は、灰色のバーに見られるように、1〜10マイクロメートルの範囲でした。興味深いことに、毛様体MCHR1の強度は、円弧核のそれよりもパラベンタリ核においてより強かった。AC3に対するMCHR1の強度をプロットし、それらの重なりを測定した。繊毛の大部分は両方のマーカーに陽性であったが、一部の繊毛はAC3またはMCHR1のいずれにも陽性であった。AC3内のMTHR1の共局在化を定量化するために、マンダーの重なり係数を測定し、アークアテ核よりもパラベンタキュラー核の重なりが有意に増加した。繊毛の長さに沿った強度を測定するために、繊毛極性を基底体マーカーとしてCentrin2-GFPを用いて定義した。これにより、繊毛の基部とARL13B-Mチェリー陽性繊毛の先端を区別することができた。繊毛の長さに沿ったARL13B強度の変化は、右に見られるように、左に見られる円弧核のシリウムの先端よりもベースでARL13B強度が高かった場所で観察された。この方法でデータを分析する場合、実験データセットの品質と解像度が AI のトレーニングに使用されるデータと一致していることを確認することが重要です。このアプローチの主な有用性は、AIによって繊毛を検出した後、ユーザーは、ソフトウェア内に統合された分析ワークフローをカスタマイズすることによって、どのプロパティが分析されるかについて創造的であることができます。

Research

JoVE Journal

Biology

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In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

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