Name: artificial intelligence approaches to assessing primary cilia
Uploaded: 2021-05-01T14:00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases R01 DK114008 til NFB og American Heart Association Fellowship Grant #18PRE34020122 til RB. Vi takker Rich Gruskins daglige leder for Nikon Software, Melissa Bentley, Courtney Haycraft og Teresa Mastracci for innsiktsfulle kommentarer til manuskriptet.

1. Skaff deg rå bilder
<ol><li>Fiks og immunmerkede prøver etter behov20.<ol>
<li>Bildesilia ved hjelp av et konfokalt mikroskop med maksimal bitdybde med samme pikselstørrelse med Nyquist-oppløsning.</li>
		<li>Eksporter bilder som monokrome kodede bildeformatfiler (.tif). MERK: Denne protokollen beskriver hvordan du bruker Ai-modulen spesielt i NIS Elements-programvaren. Hvis bilder ble anskaffet som .nd2-filer, er det ikke nødvendig å eksportere bilder som .tif filer, og brukeren kan fortsette direkte til trinn 2.3. Hvis bilder ble anskaffet på et annet system, kan en NIS Elements-lisens kjøpes separat, og .tif filer kan konverteres som beskrevet i de neste trinnene.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Tren Ai for å identifisere cilia
<ol><li>Åpne treningsdatasettet.<ol>
<li>Velg omtrent 50 eksempelbilder med minst ett cilium per ramme for å trene programvaren og kopiere dem i en enkelt mappe. Denne mappen brukes til å dirigere programvaren når du åpner bildene. Åpne disse 50 rammene i ett enkelt ND2-dokument med minst ett cilium per ramme. Velg Fil > Importer/eksporter > Opprett ND-fil fra filsekvens .</li>
		<li>Velg mappen som inneholder treningsdatasettet. Dette åpner listen over filer midt i dialogvinduet. Definer manuelt organiseringen av filene ved hjelp av minst ett alternativ i rullegardinmenyen ovenfor. Alternativene er multipunkt (for flere maksimale projeksjonsfiler), Z-serier (for et z-stakkbilde), tid (for et tidsforløpbilde) og bølgelengde (for filer fra flere kanaler).</li>
		<li>Angi de tilsvarende numeriske verdiene under hvert valgte alternativ. Velg Ingen der alternativer ikke er valgt. Klikk Konverter for å åpne ND-dokumentet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kalibrere bilder.<ol>
<li>Angi pikselstørrelsen nederst til venstre i bildet: Høyreklikk Påklikalert > Kalibrer dokument > Pikselstørrelse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identifiser cilia.<ol>
<li>Hånddentifisere cilia ved å spore individuelle ciliary strukturer nøyaktig på alle åpnede rammer ved hjelp av enten Automatisk gjenkjenning eller Tegn objekt på binær verktøylinje. Dette vil tegne binære masker på objekter av interesse. Disse binærfilene vil fungere som eksempelobjekter for opplæring av programvaren for å identifisere cilia på pikselbaserte egenskaper i fremtidig eksperimentell bildeanalyse. Velg Vis > analysekontroller > binær verktøylinje > Tegne objekt. MERK: Fjern alle rammer som ikke har binærfiler, da programvaren ikke vil begynne å trene med mindre den er i stand til å oppdage binærfiler på alle åpnede rammer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tren ai.<ol>
<li>Begynn å lære opp programvaren. Dette åpner Segment.ai boksen. Velg NIS.ai > Tog Segment.ai.</li>
		<li>Velg kildekanalen som skal brukes til trening, i boksen Tog Segment.ai . Hvis filer fra flere kanaler er åpne, velger du bare én kanal som kildekanal. Velg deretter de riktige grunn sannhetsbinærene som ai-en skal trenes på. Til slutt velger du antall gjentakelser som trengs for å trene ai avhengig av størrelsen og fordelingen av binærfilene. MERK: Hvis binærfilene lett kan oppdages fra omgivelsene og distribueres godt gjennom hele bildet, kan det hende at programvaren trenger mindre enn 1000 gjentakelser for å bli opplært til å identifisere bildene. Hvis bildene har et lavt signal-til-støy-forhold, er det ideelt å kjøre minst 1000 gjentakelser mens du trener for å gjøre det mulig for Ai å identifisere cilia i testprøver med høy tillit.</li>
		<li>Velg målmappen for å lagre den opplærte Ai-filen (SAI), og klikk Tog for å lære opp programvaren. Programvaren vil nå fortsette å trene seg selv til å identifisere cilia basert på de sporede binærfilene. Denne prosessen tar flere timer. MERK: Når du trener, viser programvaren en graf som viser treningstap. Grafen vil i utgangspunktet vise en spike før den taper til ideelt rundt 1% tap der den platåer for resten av treningen. Lagre diagrammet for fremtidig referanse ved å merke av i boksen for Lagre grafskjermbilde på boksen Tog Segment.ai (Tilleggsfigur 1).</li>
		<li>Hvis ytterligere forbedring av opplæringen er nødvendig, fortsett å trene på samme datasett. Alternativt kan du trene på et nytt datasett med nøyaktig de samme parametrene. Det er ikke tilrådelig å trene en allerede opplært Ai på et nytt datasett med forskjellige parametere eller forskjellige objekter av interesse. Velg Lær opp segment.ai > Fortsett opplæring > Velg opplært ai-fil.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Identifiser cilia ved hjelp av opplært Ai
<ol><li>Åpne det eksperimentelle datasettet.<ol>
<li>Åpne de eksperimentelle confocal bilder av cilia i programvaren ved å konvertere eksemplet .tif filer til .nd2 filer, ligner trinn 2.1. Velg Fil > Importer/eksporter > Opprett ND-fil fra filsekvens . MERK: Bildene skal ha samme pikselstørrelse som de som brukes til å trene ai-en. Hvis bildene allerede er i ND2-format, går du til trinn 3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kalibrere bilder.<ol>
<li>Angi pikselstørrelsen nederst til venstre i bildet. Høyreklikk Ikke-kalibrert > Kalibrer dokument > pikselstørrelse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kjør den opplærte Ai-en på de åpne filene.<ol>
<li>Begynn å identifisere cilia ved hjelp av Ai. Programvaren vil nå trekke binærfiler på cilia basert på opplæringen den mottok i forrige trinn. Denne prosessen vil ta noen sekunder. Velg NIS.ai > Segment.ai. MERK: Programvaren vil be om å velge kanalen hvis flere kanaler er åpne. Kanaler er oppført etter deres respektive navn her. Hvis ikke, velges boksen merket 'Mono'automatisk.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sjekk bilder for misidentifiserte binærfiler.<ol>
<li>Når Ai har identifisert cilia og tegnet binærfiler, sjekk bildene for eventuelle feilaktig identifiserte objekter. Hvis ønskelig, sletter du eventuelle misidentifiserte binærfiler manuelt. Velg Vis > analysekontroller > binær verktøylinje > Slett objekt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Måling av cilia lengde og intensitet
<ol><li>Opprett en ny GA3-oppskrift (General Analysis 3).<ol>
<li>Nå som cilia er identifisert og segmentert, fortsett å analysere forskjellige parametere for cilia som lengder og intensiteter ved hjelp av GA3-verktøyet. Dette åpner et nytt vindu med et tomt mellomrom i midten der analysen skal defineres. Velg Bilde > Ny GA3-oppskrift. 
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Velg binærfilene som skal analyseres.<ol>
<li>Siden cilia allerede er segmentert ved hjelp av Segment.ai, vil GA3 automatisk oppdage binærfilene som er riktig merket i henhold til ai og inkludere noden. VelgBinærfiler > Automatisk Detect_AI eller Binærfiler > Tegn Object_AI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Velg kanalene som kreves for analyse. GA3 vil også automatisk oppdage kanalene i bildene og vise kategoriene sine under Kanaler.</li>
	<li>Fjern objekter som berører rammens kantlinje.<ol>
<li>Siden Ai vil segmentere alle cilia som objekter i rammen, vil den også oppdage ufullstendig cilia langs kantene av rammen. Disse objektene kan enten fjernes manuelt i trinn 3.4, eller de kan fjernes automatisk i GA3. Velg Binær behandling > Fjern objekter > berøringskantlinjer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Velg parametere for å måle cilia.<ol>
<li>Dra og slipp parameterne for å måle, for eksempel cilia lengde (Lengde) og intensiteter (Sum Objektintensitet). Koble nodene til riktig binær node (tilkobling A) og kanalnoder (tilkobling B). Hold pekeren over nodetilkoblingen for et verktøytips for å vise hvilken tilkobling noden tilhører. Velg Mål > objektstørrelse > lengde og mål > objektintensitet > Sum Obj-intensitet. MERK: Nodelengden kobles bare til den binære noden, mens Sum Obj Intensity kobles til både binær- og kanalnodene.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Føye til målene i én enkelt tabell.<ol>
<li>Kombiner alle målene i en enkelt utdatatabell ved å dra og slippe noden Tilføy kolonne i analyseflytskjemaet og koble den til målnodene Lengde og Sum Obj-intensitet. Velg Databehandling > grunnleggende > tilføyingskolonne.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mål cilia.<ol>
<li>Mål cilia ved å klikke Kjør. Denne prosessen tar noen øyeblikk å måle alle cilia i eksperimentelle bilder. Lengdene og intensitetene vises i et nytt Analyseresultater-vindu. MERK: Tabellen kan noen ganger inneholde data fra masker som Ai anerkjente som cilia, men som var for små til å bli oppdaget av det menneskelige øye og eliminert i trinn 3.4. Disse objektene kan fjernes fra datasettet ved hjelp av et filter før statistisk analyse. Her ble et filter på 1 μm brukt til in vitro cilia lengdemålinger i figur 2 og 2 μm for in vivo cilia. Dette kan gjøres før du eksporterer data ved hjelp av banen nedenfor. Velg Analyseresultater -vinduet > Definer filter > Angi verdi > Bruk filter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eksporter data for statistisk analyse.</li>
</ol>5. Colocalization studier
MERK: Colocalization analyse kan inkluderes i samme GA3 oppskrift som brukes til målinger av cilia lengde og intensitet analyse. Hvis du bruker samme oppskrift, åpner du filer som beskrevet nedenfor og måler lengdene og intensitetene til begge kanalene sammen med colokaliseringskoeffisientene i samme analyserørledning.
<ol><li>Åpne det eksperimentelle datasettet.<ol>
<li>Åpne de eksperimentelle confocal bilder av cilia i programvaren ved å konvertere prøven .tif filer til .nd2 filer. Velg Fil > Importer/eksporter > Opprett ND-fil fra filsekvens .</li>
		<li>I popup-vinduet velger du 16-biters dybde monokrome filer fra alle kanaler av interesse fra vindusutforskeren som ligger i den første kolonnen i popup-vinduet. Velg Multipoint eller Z Series fra den første rullegardinmenyen, og skriv inn en verdi som tilsvarer henholdsvis totalt antall bilder eller stabler.</li>
		<li>I den andre rullegardinlisten velger du Bølgelengde og endrer verdien til totalt antall kanaler i mappen. Programvaren vil automatisk låse opp et Wavelength-valgvindu som ligger nederst til høyre i popup-vinduet. Bruk rullegardinmenyen Farge til å velge fargen på hver kanal. Gi hver kanal et eget navn under Navn-kolonnen. Når all informasjon er oppdatert, klikker du Konverter. Programvaren vil automatisk generere en All bildefil overleggt med alle individuelle bilder fra alle de valgte kanalene.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalibrere bilder.<ol>
<li>Angi pikselstørrelsen nederst til venstre i bildet. Høyreklikk Ikke-kalibrert > Kalibrer dokument > pikselstørrelse.</li>
	</ol></li>
	<li>Kjør den trente Ai-en på den første kanalen.<ol>
<li>Begynn å identifisere cilia på en av de åpnede kanalene (f.eks. Figur 5A) ved hjelp av Kunstig intelligens. Programvaren vil nå trekke binærfiler på ACIII merket cilia basert på opplæringen den mottok for denne kanalen. Denne prosessen vil ta noen sekunder. Velg NIS.ai > Segment.ai > Kildekanaler > ACIII.</li>
	</ol></li>
	<li>Kjør den trente Ai-en på den andre kanalen.<ol>
<li>Begynn å identifisere cilia på den andre åpnede kanalen (f.eks. Figur 5B) ved hjelp av Kunstig intelligens. Programvaren vil nå tegne binærfiler på MCHR1 merket cilia basert på opplæringen den mottok for denne kanalen. Denne prosessen vil ta litt tid. Velg NIS.ai > Segment.ai > Kildekanaler > MCHR1.</li>
	</ol></li>
	<li>Sjekk bilder for misidentifiserte binærfiler.<ol>
<li>Når Ai har identifisert cilia og tegnet binærfiler, sjekk bildene for eventuelle feilidentifiserte objekter. Slett eventuelle misidentifiserte binærfiler manuelt om nødvendig. Velg Vis > analysekontroller > binær verktøylinje > Slett objekt.
</li>
	</ol></li>
	<li>Opprett ny GA3-oppskrift.<ol>
<li>Nå som cilia er identifisert og segmentert, fortsett til colokaliseringsanalysen ved hjelp av GA3-verktøyet. Dette åpner et nytt vindu med et tomt mellomrom i midten der analysen skal defineres. Det genereres et vindu med alle identifiserte binærfiler og kanaler. Kontroller at alle ønskede kanaler og binærfiler som kreves for analyse, finnes og velges. Velg Bilde > Ny GA3-oppskrift.</li>
	</ol></li>
	<li>Fjern objekter som berører rammens kantlinje.<ol>
<li>Siden Ai vil segmentere alle cilia-lignende objekter i rammen, vil den også oppdage ufullstendig cilia langs kantene på rammen. Disse objektene kan enten fjernes manuelt i trinn 5.5, eller de kan fjernes automatisk i GA3. Velg Binær behandling > Fjern objekter > Berøringsrammer.
</li>
	</ol></li>
	<li>Sett opp colocalization-banen i GA3.<ol>
<li>Hvis du vil måle overlapping av de to kanalene i cilia, bruker du Manders koeffisientkorrelasjon. Dra og slipp Manders Coefficient -noden i det tomme området i GA3-oppskriften, og koble den til riktig binær og kanal. Her kobles tilkobling A til ACIII-binæren, tilkobling B med MCHR1-kanalen og tilkobling C med ACIII-kanalen for å fastslå overlappingen av MCHR1 i ACIII-binæren. Velg Mål > objektforholdsmetri > Manders Koeffisient. MERK: Programvaren gjør det mulig å måle colocalization ved hjelp av Pearson Coefficient Correlation ved hjelp av de samme trinnene som beskrevet i denne protokollen40.</li>
	</ol></li>
	<li>Føye til målene i én enkelt tabell.<ol>
<li>Kombiner alle målene i én enkelt utdatatabell. Velg Databehandling > grunnleggende > tilføyingskolonne.</li>
	</ol></li>
	<li>Mål colokalisering.<ol>
<li>Mål cilia ved å klikke Kjør. Denne prosessen tar noen øyeblikk å måle alle cilia i eksperimentelle bilder. Dataene vises i et nytt Analyseresultater-vindu.</li>
	</ol></li>
	<li>Eksporter data for statistisk analyse.</li>
</ol>

Medforfatter Wesley Lewis er ansatt i Nikon. Det er ingen økonomiske avsløringer.

Lengde- og intensitetsmålinger er vanlige måter primære cilia analyseres på, men det er ikke en standardisert konvensjonell metode som brukes i feltet. Identifisering og kvantifisering av primær cilia ved hjelp av programvare som ImageJ er tidkrevende og utsatt for brukerforskjeller og feil. Dette gjør det vanskelig å analysere store datasett nøyaktig. Her viser vi at bruk av et Ai-program kan overvinne mange av disse utfordringene som gjør høy gjennomstrømningsanalyse av primære cilia oppnåelige. Her beskriver vi prosedyren for opplæring av en Ai-basert applikasjon for å gjenkjenne primære cilia og skissere trinnene som kreves for å analysere lengde og intensitet.
Mens den første opplæringen av Ai for å gjenkjenne cilia krever betydelig tid fra brukeren, når den er fullført, kan den brukes på et hvilket som helst datasett som er anskaffet med de samme parametrene. Den binære masken som genereres av ai er modifiserbar slik at eventuelle feil kan rettes. Feil i ciliaidentifikasjon bør imidlertid signalisere brukeren at Ai-en må trenes videre med flere bilder. En stor fordel med denne metoden er at Ai kan trenes til å gjenkjenne cilia i forskjellige utvalgstyper i både 2D og 3D. Tidligere analysemetoder generert i laboratorier har ulike begrensninger, inkludert å kreve manuell tersklering for identifisering og problemer med å identifisere cilia avbildet fra vevsseksjoner der celletettheten er høy36,46,47. Disse metodene er også spesialisert for cilia analyse mens analyse ved hjelp av NIS Elements programvare kan evaluere flere aspekter av bildene samtidig. Fordi Ai beskrevet her er en del av NIS Elements programvarepakke, kan bilder som er anskaffet ved hjelp av et Nikon-mikroskop enkelt fortsettes gjennom til analyse. Avbildning med Nikon er imidlertid ikke nødvendig for bruk av denne metoden. Uavhengig av det fangede rådatafilformatet, kan ".tif" -filer åpnes av NIS Elements for bruk i Ai.
Denne Ai-applikasjonen i NIS Elements er allment tilgjengelig og muligens allerede en del av bildeanalyseprogramvare som brukes av laboratorier som studerer primære cilia. Når utbredelsen av Ai-teknologi utvides, kan annen bildebehandlingsprogramvare utvide analysealternativene til å omfatte en lignende Ai-modul. Bruk av Ai-analyse på ciliaidentifikasjon kan brukes til flere forskjellige aspekter ved ciliaanalyse. Mens vi skisserte metoder for noen få enkle analyser som lengde (figur 2 og 3), kan intensitet (figur 4) og colokalisering (figur 5) mer sofistikert analyse legges til i GA3-analysearbeidsflyten som i figur 6. For eksempel, i stedet for å måle intensiteten til et komplett cilium, kan forskjeller i intensitet i en underregion av et cilium være av interesse for å vurdere sub-ciliary lokalisering. Forskjeller i intensitet i en underregion av et cilium kan indikere at proteinet akkumuleres på spissen eller bunnen av ciliumet, for eksempel hvordan Gli-proteiner er beriket på spissen av cilia48. I tillegg kan denne Ai-applikasjonen brukes til å enkelt identifisere forskjeller mellom genotyper eller behandlingsgrupper. Mens laboratoriet vårt først og fremst bruker denne metoden til å analysere cilia avbildet fra hjerneseksjoner eller nevronkulturer, kan den brukes på bilder anskaffet fra ulike cellelinjer eller andre vevstyper. Fleksibiliteten til utvalgstype som denne applikasjonen kan brukes på, gjør denne analysemetoden verdifull for mange forskjellige grupper som studerer primær cilia eller en diskret organelle som vurderes som mitokondrier, kjerne eller ER.

Primær cilia er sensoriske organeller som stikker ut fra de fleste pattedyrcelletyper1,2,3,4. De er generelt ensomme vedlegg som er kritiske for koordinering av ulike cellesignalveier ved å integrere ekstracellulære signaler5,6,7. Primær cilia spiller viktige roller under embryonal utvikling og voksenvev homeostase, og forstyrrelse av deres funksjon eller morfologi er forbundet med flere genetiske lidelser, som kollektivt kalles ciliopatier. På grunn av ciliaens nær allestedsnærværende natur er ciliopatier forbundet med et bredt spekter av kliniske egenskaper som kan påvirke alle organsystemer8,9,10,11,12. I dyremodeller av ciliopatier manifesterer tap av ciliary-struktur eller signalkapasitet i flere klinisk relevante fenotyper, inkludert hyperfagi-assosiert fedme3,13,14,15. I mange modellsystemer har cilia lengdeendringer vist seg å påvirke deres signalkapasitet og funksjoner16,17,18,19. Det er imidlertid flere tidkrevende og tekniske utfordringer knyttet til nøyaktig og reprodusering av cilia lengde og sammensetning.
Det voksne pattedyrets sentralnervesystem (CNS) er en biologisk kontekst som har utgjort en utfordring for å forstå cilia morfologi og funksjon. Mens det ser ut til at nevroner og celler i hele CNS har cilia, på grunn av de begrensede verktøyene og evnene til å observere og analysere disse cilia, forblir en forståelse av deres funksjoner unnvikende20. For eksempel merker den prototypiske ciliamarkøren, acetylert α-tubulin, ikke nevronal cilia20. Vanskeligheten med å studere disse cilia ble delvis løst med oppdagelsen av flere G protein-koblede reseptorer (GPCR), signalmaskiner og membran assosierte proteiner som er beriket på membranen av nevronal cilia21,22. Alle disse enkle grunnleggende observasjonene antyder viktigheten og mangfoldet av CNS cilia, som så langt fremstår uten sidestykke av andre vev. For eksempel kan variasjon i cilia lengde og GPCR lokalisering observeres i hele hjernen, med lengder i visse nevronale kjerner som er forskjellige sammenlignet med andre kjerner19,23. På samme måte viser deres GPCR-innhold og signalmaskiner mangfold basert på nevroanatomisk plassering og nevronal type2,24,25,26,27,28,29. Disse enkle observasjonene viser at pattedyr CNS cilia lengde og sammensetning er tett regulert, akkurat som i modellorganismer, som Chlamydomonas reinhardtii, men virkningen av disse lengdeforskjellene på cilia-funksjon, signalering og til slutt oppførsel forblir uklar16,30,31,32.
Nøyaktig måling av cilia lengde og sammensetning viser seg å være en teknisk utfordring utsatt for brukerfeil og irreproducibility. For tiden er cilia in vivo og in vitro oftest identifisert ved hjelp av immunfluorescerende tilnærminger som merker ciliary proteiner eller cilia-beriket fluorescerende reporter alleler33,34,35. Lengdene på disse fluorescerende kodede cilia måles deretter fra et 2-dimensjonalt (2D) bilde ved hjelp av linjemålingsverktøy i bildeanalyseprogrammer som ImageJ36. Denne prosessen er ikke bare kjedelig og arbeidsintensiv, men også utsatt for fordommer og feil. De samme hindringene oppstår ved måling av cilia-intensiteter, noe som bidrar til å indikere endringer i cilia struktur37. For å minimere inkonsekvensene i denne typen bildeanalyser, blir kunstig intelligens (Ai) -programmer mer utbredte og rimelige alternativer38.
Ai er fremskrittet av datasystemer som bruker fordelen med dataalgoritmer og programmering for å utføre oppgaver som vanligvis krever menneskelig intelligens39. Ai-enheter læres å oppfatte tilbakevendende mønstre, parametere og egenskaper og iverksette tiltak for å maksimere oddsen for å skape vellykkede resultater. Ai er allsidig og kan trenes til å gjenkjenne spesifikke objekter eller strukturer av interesse, for eksempel cilia, og deretter programmeres til å kjøre en rekke analyser på de identifiserte objektene. Derfor kan komplekse bildedata raskt og reproduseres av Ai38. Automatisering og Ai-analyse av innspilte bilder vil øke effektiviteten og effektiviteten samtidig som potensielle menneskelige feil ogskjevheter begrenses. Etablering av en Ai-basert metodikk for ciliaidentifikasjon skaper en konsistent måte for alle forskningsgrupper å analysere og tolke ciliadata på.
Her bruker vi en Ai-modul for å identifisere cilia både in vivo og in vitro på 2D-bilder. Ved hjelp av et sett med prøvebilder er ai opplært til å identifisere cilia. Når opplæringen er fullført, brukes den angitte ai-en til å bruke en binær maske over Ai identifisert cilia i et bilde. Binærfilene som brukes av ai er modifiserbare, om nødvendig, for å sikre at alle cilia i bildene er riktig identifisert og ikke-spesifikk identifikasjon elimineres. Etter å ha brukt Ai til å identifisere cilia, brukes spesialbygde generelle analyseprogrammer (GA) til å utføre forskjellige analyser som måling av cilia lengde og fluorescensintensitet. Dataene som samles inn, eksporteres til en tabell som enkelt kan leses, tolkes og brukes til statistiske analyser (figur 1). Bruk av automatisert teknologi og ai for å identifisere cilia og oppnå spesifikke målinger mellom eksperimentelle grupper vil hjelpe i fremtidige studier med sikte på å forstå effekten av CNS cilia-funksjon og morfologi på cellecellekommunikasjon og atferd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Intel Xeon, 3.6 GHz, 32GB RAM</td>
			<td>Intel Corporation</td>
			<td>W-2123</td>
			<td>Processor used for running NIS Elements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements Software</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Ai and GA3 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadro RTX 4000 Graphics card</td>
			<td>NVIDIA Corporation</td>
			<td>Quadro RTX 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10 Professional 64-bit</td>
			<td>Microsoft Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Operating system used for running NIS Elements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Workstation</td>
			<td>HP Development Company, L.P.</td>
			<td>HP&#160;Z4G4</td>
			<td>Workstation used for running NIS Elements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

artificial intelligence approaches to assessing primary cilia

Cilia er mikrotubulebaserte cellulære vedlegg som fungerer som signalsentre for et mangfold av signalveier i mange pattedyrcelletyper. Cilia lengde er svært bevart, tett regulert, og varierer mellom ulike celletyper og vev og har vært involvert i direkte innvirkning av deres signalkapasitet. For eksempel har cilia vist seg å endre lengdene som svar på aktivering av ciliary G protein-koblede reseptorer. Men nøyaktig og reprodusert måling av lengdene på mange cilia er en tidkrevende og arbeidsintensiv prosedyre. Nåværende tilnærminger er også feil- og biasutsatte. Kunstig intelligens (Ai) programmer kan brukes til å overvinne mange av disse utfordringene på grunn av evner som tillater assimilering, manipulering og optimalisering av omfattende datasett. Her demonstrerer vi at en Ai-modul kan trenes til å gjenkjenne cilia i bilder fra både in vivo- og in vitro-prøver. Etter å ha brukt den opplærte Ai til å identifisere cilia, er vi i stand til å designe og raskt bruke applikasjoner som analyserer hundrevis av cilia i en enkelt prøve for lengde, fluorescensintensitet og samlokalisering. Denne objektive tilnærmingen økte vår selvtillit og strenghet når vi sammenlignet prøver fra forskjellige primære nevronale preps in vitro så vel som på tvers av forskjellige hjerneregioner i et dyr og mellom dyr. Videre kan denne teknikken brukes til pålitelig å analysere ciliadynamikk fra hvilken som helst celletype og vev på en høy gjennomstrømningsmåte på tvers av flere prøver og behandlingsgrupper. Til syvende og sist vil Ai-baserte tilnærminger sannsynligvis bli standard etter hvert som de fleste felt beveger seg mot mindre partiske og mer reproduserbare tilnærminger for bildeanskaffelse og analyse.

Watch this Scientific Journal Video about Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia at JoVE.com

Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia

Bruken av kunstig intelligens (Ai) for å analysere bilder fremstår som en kraftig, mindre partisk og rask tilnærming sammenlignet med vanlige metoder. Her trente vi Ai til å gjenkjenne en cellulær organell, primær cilia, og analysere egenskaper som lengde og fargingsintensitet på en streng og reproduserbar måte.

Kunstig intelligens tilnærminger til vurdering av primær Cilia

Cilia are microtubule based cellular appendages that function as signaling centers for a diversity of signaling pathways in many mammalian cell types. ...

Nåværende metoder for ciliaanalyse er arbeidsintensive og utsatt for feil og skjevheter. Vår tilnærming søker å effektivisere tid og krefter samtidig som vi reduserer potensielle feil. Den største fordelen som denne teknikken tilbyr er økt strenghet og reproduserbarhet og kvantitativ bildeanalyse.Denne typen tilnærming er ikke bare relevant for ciliaanalyse, men kan i stor grad brukes på mange cellebiologiske spørsmål, inkludert de som arbeider med andre organeller og cytoskeletale proteiner. For å begynne, åpne opplæringsdatasettet, velg fil på menyen, klikk importer eksport og velg opprett ND-fil fra filsekvens. Velg mappen som inneholder treningsdatasettet, og listen over filer åpnes midt i dialogvinduet.Definer organiseringen av filer manuelt ved hjelp av minst ett alternativ i rullegardinmenyen. Angi de tilsvarende numeriske verdiene under hvert valgte alternativ, og velg ingen der alternativer ikke er valgt. Klikk Konverter for å åpne ND-dokumentet.Hvis du vil kalibrere bildet, høyreklikker du det ikke-kalibrerte alternativet nederst til venstre i bildet. Klikk kalibrer dokumentet, klikk pikselstørrelse, skriv inn verdien og klikk OK. Velg visningsanalysekontroller, åpne den binære verktøylinjen og velg identifiser eller tegn objekt automatisk for å identifisere cilia ved å spore individuelle ciliary strukturer nøyaktig på alle åpnede rammer.Velg nis for opplæring av kunstig intelligens. ai, klikk på togsegmentet. ai for å åpne togsegmentet.ai-boksen, og velg deretter kildekanalen som skal brukes til trening. Velg de aktuelle GroundTruth-binærfilene for å trene AI-en. Velg det nødvendige antallet gjentakelser for å lære opp kunstig intelligens avhengig av binær størrelse og distribusjon, og velg deretter målmappen for å lagre den opplærte AI-filen og klikke tog for å trene programvaren. Denne prosessen tar flere timer.Åpne de eksperimentelle konfektbildene av cilia som beskrevet tidligere ved å konvertere prøven. TIF-filer til ND2-filer. I popup-vinduet velger du flere punkt fra den første rullegardinmenyen og angir en verdi som tilsvarer det totale antallet bilder.I den andre rullegardinlisten velger du bølgelengde og endrer verdien til det totale antallet kanaler i mappen. Programvaren vil automatisk låse opp et bølgelengdevalgvindu, plassert nederst til høyre i popup-vinduet. I vinduet for valg av bølgelengde bruker du rullegardinmenyen for farge til å velge fargen på hver kanal.Gi hver kanal et eget navn under navnekolonnen. Når all informasjon er oppdatert, klikker du konverter. Kalibrer bildene som beskrevet tidligere.Kontroller at pikselstørrelsen på det eksperimentelle datasettet samsvarer med størrelsen på treningsdatasettet. Identifiser cilia på den første kanalen ved å bruke den opplærte AI-en fra forrige trinn. Åpne nis.ai fra menyen, velger du segment. ai, og velg deretter AC3 i kildekanalene. Identifiser deretter ciliaen på den andre kanalen ved å velge MCHR1 i kildekanalene.Programvaren vil tegne binærfiler på den merkede cilia. Sjekk deretter bildene for eventuelle misidentifiserte binærfiler. Velg Slett objekt på den binære verktøylinjen for å slette de misidentifiserte binærfilene manuelt.Når cilia er identifisert og segmentert, analyser forskjellige ciliaparametere, for eksempel lengder og intensiteter, ved hjelp av det generelle analyseverktøyet tre. Velg bilde fra menyen, og klikk på ny GA3-oppskrift. Et nytt vindu med mellomrom i midten åpnes.GA3 vil automatisk oppdage binærfilene som er riktig merket i henhold til AI-en og inkludere den tilsvarende noden. GA3 vil også automatisk oppdage kanalene i bildene og vise fanene sine under kanaler. AI-en vil segmentere alle cilia som objekter i rammen og oppdage ufullstendig cilia langs kantene på rammen.Hvis du vil fjerne dem, velger du binær behandling, fjerner objekter og drar deretter noden for berøringskantlinjer inn i det tomme området og kobler noden til de riktige binærfilene. Hvis du vil måle cilia-lengden, velger du målobjektstørrelse og deretter lengde. Dra og slipp parameteren til midten og koble til riktig binær node.Hvis du vil måle cilia-intensiteter, velger du en viss objektintensitet. Dra og slipp parameteren til midten og koble til riktig binær node og interessekanal. I målemenyen går du til objektrasjonsmetri og velger Manders koeffisient for å sette opp colokaliseringsveien i GA3 ved å måle overlappingen av to kanaler i individuell cilia.Dra og slipp Manders koeffisientnode i det tomme området, og koble den til riktig binær og kanal. ApEn målingene og enkelttabellen ved å åpne datahåndteringsmenyen. I basiskategorien velger du ApEn-kolonnen og klikker kjør nå for å måle cilia.Alle målene vises i én enkelt utdatatabell. De representative bildene viser at den trente AI riktig identifisert cilia in vitro i bildene av IMCD celler, primære hypothalamus kulturer og hippocampal kulturer, men ingen andre ikke ciliary strukturer som cytokinetic broer. Lengden på cilia varierte fra 0,5 til 4,5 mikrometer i IMCD-celler og to til 12 mikrometer i den hypothalamus- og hippocampalkulturen.AI målte lengdene på AC3 merket cilia in vivo i bildene av vår arcuate kjerne, paraventrikulære kjerne og cornu ammonis en region. Ifølge analysen varierte hypothalamus cilia in vivo fra ett til 15 mikrometer, som sett i hvite og brune barer. Mens cilia og cornu ammonis-regionen varierte fra ett til 10 mikrometer, som sett i grå barer.Interessant nok var intensiteten til ciliary MCHR1 sterkere i den paraventrikulære kjernen enn i den buede kjernen. Intensitetene i MCHR1 mot AC3 ble planlagt for å måle overlappingen. De fleste cilia var positive for begge markørene, mens noen cilia var positive for enten AC3 eller MCHR1.For å kvantifisere colokaliseringen av MTHR1 innen AC3 ble Manders overlappingskoeffisient målt, og det var en betydelig økning i overlappingen i den paraventrikulære kjernen enn i den buede kjernen. For å måle intensitet langs ciliaens lengde ble cilia polaritet definert ved hjelp av Centrin2-GFP som basal kroppsmarkør. Dette tillot å skille basen av cilia fra spissene til ARL13B-M kirsebærpositiv cilia.Endringer i ARL13B intensitet langs lengden av cilia ble observert der ARL13B intensitet var høyere ved foten enn på spissen av cilium i arcuate kjernen, sett til venstre, samt PVN, som sett til høyre. Når du analyserer data med denne tilnærmingen, er det viktig å sørge for at kvaliteten og oppløsningen til det eksperimentelle datasettet er i samsvar med det som brukes til å trene AI. Hovedverktøyet i denne tilnærmingen er etter å ha oppdaget cilia av AI, brukeren kan være kreativ om hvilke egenskaper som analyseres ved å tilpasse analysearbeidsflyten integrert i programvaren.

Research

JoVE Journal

Biology

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals.  Peromyscus species are used in a wide range of research ...

Experimental Approaches to Tissue Engineering

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Analyse av gen-funksjon og visualisering av Cilia-generert Væskestrøm i Kupffer sin Vesikkel

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Vurdere artsspesifikke bidrag til Kraniofacial Development Bruke Quail-duck Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Eksperimentelle tilnærminger til å studere mitokondrie lokalisering og funksjon for en kjernefysisk Cell Cycle Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Ved hjelp av mikrofluid enheter for å måle levetid og Cellular fenotyper i enkelt spirende gjærceller

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro og i Vivo tilnærminger til å bestemme Intestinal tarmepitelet permeabilitet

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetisk-aktivert celle sortering strategier for å isolere og rense Synovial Fluid-avledet Mesenchymal stamceller fra en kanin modell

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Enkel påvisning av primær cilia ved immunofluorescence

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...