Name: artificial intelligence approaches to assessing primary cilia
Uploaded: 2021-05-01T14:00:00
Duration: 8 min 58 s
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Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales R01 DK114008 a NFB y la Beca de la Asociación Americana del Corazón #18PRE34020122 a RB. Agradecemos a Rich Gruskin, Gerente General de Nikon Software, Melissa Bentley, Courtney Haycraft y Teresa Mastracci por sus perspicaces comentarios sobre el manuscrito.

1. Adquirir imágenes en bruto
<ol><li>Fijar e inmunoetiquetar muestras según sea necesario20.<ol>
<li>Cilios de imagen utilizando un microscopio confocal a máxima profundidad de bits utilizando el mismo tamaño de píxel con resolución Nyquist.</li>
		<li>Exporte imágenes como archivos monocromáticos de formato de imagen etiquetado (.tif). NOTA: Este protocolo describe cómo utilizar el módulo Ai específicamente dentro del software NIS Elements. Si las imágenes se adquirieron como archivos .nd2, no es necesario exportar imágenes como archivos .tif y el usuario puede continuar directamente con el paso 2.3. Si las imágenes se adquirieron en un sistema diferente, se puede comprar una licencia de NIS Elements por separado y .tif archivos se pueden convertir como se describe en los siguientes pasos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Entrena a Ai para identificar cilios
<ol><li>Abra el conjunto de datos de entrenamiento.<ol>
<li>Seleccione aproximadamente 50 imágenes de muestra con al menos un cilio por fotograma para entrenar el software y copiarlas en una sola carpeta. Esta carpeta se utiliza para dirigir el software al abrir las imágenes. Abra estos 50 fotogramas dentro de un único documento ND2 con al menos un cilio por fotograma. Seleccione Archivo > Importar/Exportar > Crear archivo ND a partir de secuencia de archivos.</li>
		<li>Seleccione la carpeta que contiene el conjunto de datos de entrenamiento. Esto abrirá la lista de archivos en el centro de la ventana de diálogo. Defina manualmente la organización de los archivos utilizando al menos una opción en el menú desplegable anterior. Las opciones son multipunto (para múltiples archivos de proyección máxima), serie Z (para una imagen de pila z), tiempo (para una imagen de lapso de tiempo) y longitud de onda (para archivos de múltiples canales).</li>
		<li>Introduzca los valores numéricos correspondientes debajo de cada opción seleccionada. Seleccione Ninguno siempre que las opciones no estén seleccionadas. Haga clic en Convertir para abrir el documento ND.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calibrar imágenes.<ol>
<li>Introduzca el tamaño de píxel en la esquina inferior izquierda de la imagen: haga clic con el botón derecho en Sin calibrar > Calibrar documento > tamaño de píxel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identificar los cilios.<ol>
<li>Identifique a mano los cilios trazando con precisión las estructuras ciliares individuales en todos los fotogramas abiertos utilizando AutoDetect o Draw Object en la barra de herramientas binaria. Esto dibujará máscaras binarias en los objetos de interés. Estos binarios servirán como objetos de muestra para entrenar el software para identificar cilios en características basadas en píxeles en futuros análisis experimentales de imágenes. Seleccione Ver controles de análisis > > barra de herramientas binaria > Objeto de dibujo. NOTA: Elimine cualquier fotograma que no tenga binarios, ya que el software no comenzará a entrenar a menos que sea capaz de detectar binarios en todos los fotogramas abiertos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entrena Ai.<ol>
<li>Comience a entrenar el software. Esto abrirá la caja de Segment.ai del tren. Seleccione NIS.ai > Segment.ai de tren.</li>
		<li>En el cuadro Segment.ai tren, seleccione el canal de origen que se utilizará para el entrenamiento. Si los archivos de varios canales están abiertos, seleccione solo un canal como canal de origen. Luego seleccione los binarios de verdad de tierra apropiados en los que entrenar al Ai. Finalmente seleccione el número de iteraciones necesarias para entrenar la Ai dependiendo del tamaño y la distribución de los binarios. NOTA: Si los binarios son fácilmente detectables desde el entorno y están bien distribuidos por toda la imagen, el software puede necesitar menos de 1000 iteraciones para capacitarse para identificar las imágenes. Si las imágenes tienen una baja relación señal-ruido, es ideal ejecutar al menos 1000 iteraciones mientras se entrena para permitir que la Ia identifique los cilios en las muestras de prueba con alta confianza.</li>
		<li>Seleccione la carpeta de destino para guardar el archivo Ai entrenado (.sai) y haga clic en Entrenar para entrenar el software. El software ahora procederá a entrenarse para identificar cilios basados en los binarios rastreados. Este proceso dura varias horas. NOTA: Al entrenar, el software mostrará un gráfico que muestra la pérdida de entrenamiento. El gráfico mostrará inicialmente un pico antes de disminuir a una pérdida ideal de alrededor del 1% donde se estanca para el resto del entrenamiento. Guarde el gráfico para futuras referencias marcando la casilla Guardar captura de pantalla del gráfico en la casilla Segment.ai tren ( Figura suplementaria1).</li>
		<li>Si se requiere un mayor refinamiento de la capacitación, continúe la capacitación en el mismo conjunto de datos. Alternativamente, entrene en un nuevo conjunto de datos con exactamente los mismos parámetros. No es recomendable entrenar a una Ia ya entrenada en un nuevo conjunto de datos con diferentes parámetros u diferentes objetos de interés. Seleccione Entrenar segment.ai > Continuar la capacitación en > Seleccione Archivo AI entrenado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Identifica los cilios usando Ai entrenado
<ol><li>Abra el conjunto de datos experimental.<ol>
<li>Abra las imágenes confocales experimentales de cilios en el software convirtiendo los archivos de .tif de ejemplo en archivos .nd2, similar al paso 2.1. Seleccione Archivo > Importar/Exportar > Crear archivo ND a partir de secuencia de archivos. NOTA: Las imágenes deben ser del mismo tamaño de píxel que las utilizadas para entrenar la Ia. Si las imágenes ya están en formato ND2, vaya al paso 3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calibrar imágenes.<ol>
<li>Introduzca el tamaño de píxel en la esquina inferior izquierda de la imagen. Haga clic con el botón secundario en > Calibrar documento > tamaño de píxel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ejecute la Ai entrenada en los archivos abiertos.<ol>
<li>Comience a identificar los cilios usando Ai. El software ahora dibujará binarios en los cilios en función de la capacitación que recibió en el paso anterior. Este proceso tardará unos segundos. Seleccione NIS.ai > Segment.ai. NOTA: El software le pedirá que seleccione el canal si hay varios canales abiertos. Los canales se enumeran por sus respectivos nombres aquí. De lo contrario, la casilla marcada 'Mono' se seleccionará automáticamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Compruebe si hay imágenes en busca de binarios mal identificados.<ol>
<li>Una vez que el Ai haya identificado cilios y dibujado binarios, verifique las imágenes en busca de objetos identificados erróneamente. Si lo desea, elimine manualmente los archivos binarios mal identificados. Seleccione Ver controles de análisis > > barra de herramientas binaria > Eliminar objeto.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Medición de la longitud e intensidad de los cilios
<ol><li>Cree una nueva receta de Análisis General 3 (GA3).<ol>
<li>Ahora que los cilios han sido identificados y segmentados, proceda a analizar diferentes parámetros de los cilios como longitudes e intensidades utilizando la herramienta GA3. Esto abrirá una nueva ventana con un espacio en blanco en el centro donde se definirá el análisis. Seleccione Imagen > nueva receta ga3.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seleccione los binarios que desea analizar.<ol>
<li>Dado que los cilios ya están segmentados utilizando Segment.ai, GA3 detectará automáticamente los binarios debidamente etiquetados de acuerdo con la Ia e incluirá el nodo. Seleccione'Binarios > Detect_AI automático' o 'Binarios > dibujar Object_AI'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seleccione los canales necesarios para el análisis. GA3 también detectará automáticamente los canales en las imágenes y mostrará sus pestañas en Canales.</li>
	<li>Retire los objetos que tocan el borde del marco.<ol>
<li>Dado que la Ai segmentará todos los objetos similares a cilios en el marco, también detectará cilios incompletos a lo largo de los bordes del marco. Estos objetos se pueden quitar manualmente en el paso 3.4 o se pueden eliminar automáticamente en GA3. Seleccione Procesamiento binario > Quitar objetos > Bordes que tocan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seleccione los parámetros para medir los cilios.<ol>
<li>Arrastre y suelte los parámetros para medir, como la longitud de los cilios(Longitud)y las intensidades(Suma de la intensidad del objeto). Conecte los nodos al nodo binario apropiado (conexión A) y a los nodos de canal (conexión B). Coloque el cursor sobre la conexión de nodo para obtener información sobre herramientas y mostrar a qué conexión pertenece el nodo. Seleccione Medición > tamaño del objeto > Longitud y medición > Intensidad del objeto > Suma intensidad Obj. NOTA: La longitud del nodo se conecta solo al nodo binario, mientras que la intensidad de suma Obj se conecta a los nodos binario y de canal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anexe las medidas en una sola tabla.<ol>
<li>Combine todas las mediciones en una sola tabla de salida arrastrando y soltando el nodo Append Column al diagrama de flujo de análisis y conéctelo a los nodos de medición, Longitud y Suma Intensidad Obj. Seleccione Administración de datos > columna Anexar > básico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medir los cilios.<ol>
<li>Mide los cilios haciendo clic en Ejecutar. Este proceso toma unos momentos para medir todos los cilios en las imágenes experimentales. Las longitudes e intensidades aparecerán en una nueva ventana resultados del análisis. NOTA: La tabla a veces puede incluir datos de máscaras que Ai reconoció como cilios, pero que eran demasiado pequeñas para ser detectadas por el ojo humano y eliminadas en el paso 3.4. Estos objetos se pueden eliminar del conjunto de datos mediante un filtro antes del análisis estadístico. Aquí, se utilizó un filtro de 1 μm para las mediciones in vitro de la longitud de los cilios en la Figura 2 y 2 μm para los cilios in vivo. Esto se puede hacer antes de exportar datos utilizando la ruta a continuación. Seleccione la ventana Resultados del análisis > Definir filtro > Introducir valor > Usar filtro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exportar datos para análisis estadístico.</li>
</ol>5. Estudios de colocalización
NOTA: El análisis de colocalización se puede incluir en la misma receta GA3 utilizada para las mediciones de la longitud de los cilios y el análisis de intensidad. Si utiliza la misma receta, abra los archivos como se describe a continuación y mida las longitudes e intensidades de ambos canales junto con los coeficientes de colocalización en la misma tubería de análisis.
<ol><li>Abra el conjunto de datos experimental.<ol>
<li>Abra las imágenes confocales experimentales de cilios en el software convirtiendo los archivos .tif de muestra en archivos .nd2. Seleccione Archivo > Importar/Exportar > Crear archivo ND a partir de secuencia de archivos.</li>
		<li>En la ventana emergente, seleccione los archivos monocromáticos de profundidad de 16 bits de todos los canales de interés en el explorador de ventanas ubicado en la primera columna de la ventana emergente. Seleccione Multipunto o Serie Z en el primer menú desplegable e introduzca un valor correspondiente al número total de imágenes o pilas, respectivamente.</li>
		<li>En el segundo cuadro desplegable, seleccione Longitud de onda y cambie el valor al número total de canales de la carpeta. El software desbloqueará automáticamente una ventana de selección de longitud de onda ubicada en el extremo inferior derecho de la ventana emergente. Utilice el menú desplegable Color para seleccionar el color de cada canal. Proporcione a cada canal un nombre diferente en la columna Nombre. Una vez que se haya actualizado toda la información, haga clic en Convertir. El software generará automáticamente un archivo de todas las imágenes superpuestas con todas las imágenes individuales de todos los canales seleccionados.</li>
	</ol></li>
	<li>Calibrar imágenes.<ol>
<li>Introduzca el tamaño de píxel en la esquina inferior izquierda de la imagen. Haga clic con el botón secundario en > Calibrar documento > tamaño de píxel.</li>
	</ol></li>
	<li>Ejecute la Ia entrenada en el primer canal.<ol>
<li>Comience a identificar los cilios en uno de los canales abiertos (por ejemplo, ACIII; Figura 5A) usando Ai. El software ahora dibujará binarios en cilios etiquetados ACIII en función de la capacitación que recibió para este canal. Este proceso tardará unos segundos. Seleccione NIS.ai > Segment.ai > canales de origen > ACIII.</li>
	</ol></li>
	<li>Ejecute la Ia entrenada en el segundo canal.<ol>
<li>Comience a identificar los cilios en el otro canal abierto (por ejemplo, MCHR1; Figura 5B) usando Ai. El software ahora dibujará binarios en cilios etiquetados MCHR1 en función de la capacitación que recibió para este canal. Este proceso tomará unos momentos. Seleccione NIS.ai > Segment.ai > canales de origen > MCHR1.</li>
	</ol></li>
	<li>Compruebe si hay imágenes en busca de binarios mal identificados.<ol>
<li>Una vez que el Ai haya identificado cilios y dibujado binarios, verifique las imágenes en busca de objetos mal identificados. Elimine manualmente los archivos binarios mal identificados si es necesario. Seleccione Ver controles de análisis > > barra de herramientas binaria > Eliminar objeto.
</li>
	</ol></li>
	<li>Crea una nueva receta de GA3.<ol>
<li>Ahora que los cilios han sido identificados y segmentados, proceda al análisis de colocalización utilizando la herramienta GA3. Esto abrirá una nueva ventana con un espacio en blanco en el centro donde se definirá el análisis. Se generará una ventana con todos los binarios y canales identificados. Verifique que todos los canales y binarios deseados necesarios para el análisis estén presentes y seleccionados. Seleccione Imagen > nueva receta GA3.</li>
	</ol></li>
	<li>Retire los objetos que tocan el borde del marco.<ol>
<li>Dado que la Ai segmentará todos los objetos similares a cilios en el marco, también detectará cilios incompletos a lo largo de los bordes del marco. Estos objetos se pueden quitar manualmente en el paso 5.5 o se pueden eliminar automáticamente en GA3. Seleccione Procesamiento binario > Quitar objetos > Bordes que se tocan.
</li>
	</ol></li>
	<li>Configure la vía de colocalización en GA3.<ol>
<li>Para medir la superposición de los dos canales dentro de los cilios, use la correlación de coeficientes de Mander. Arrastre y suelte el nodo Coeficiente de Manders en el espacio en blanco de la receta GA3 y conéctelo al binario y los canales apropiados. Aquí, la 'conexión A' se conecta con el binario ACIII, la 'conexión B' con el canal MCHR1 y la 'conexión C' con el canal ACIII para determinar la superposición de MCHR1 dentro del binario ACIII. Seleccione Medición > relación de objetos > Coeficiente de Manders. NOTA: El software permite medir la colocalización utilizando pearson Coefficient Correlation utilizando los mismos pasos que se describen en este protocolo40.</li>
	</ol></li>
	<li>Anexe las medidas en una sola tabla.<ol>
<li>Combine todas las mediciones en una sola tabla de salida. Seleccione Administración de datos > columna Anexar > básico.</li>
	</ol></li>
	<li>Medir la colocalización.<ol>
<li>Mide los cilios haciendo clic en Ejecutar. Este proceso toma unos momentos para medir todos los cilios en las imágenes experimentales. Los datos aparecerán en una nueva ventana resultados del análisis.</li>
	</ol></li>
	<li>Exportar datos para análisis estadístico.</li>
</ol>

El coautor Wesley Lewis es empleado de Nikon. No hay divulgaciones financieras.

Las mediciones de longitud e intensidad son formas comunes de analizar los cilios primarios, sin embargo, no existe un método convencional estandarizado utilizado en el campo. La identificación y cuantificación de los cilios primarios utilizando software como ImageJ requiere mucho tiempo y es propensa al sesgo y error del usuario. Esto dificulta el análisis preciso de grandes conjuntos de datos. Aquí mostramos que el uso de un programa de IA puede superar muchos de estos desafíos, lo que hace que el análisis de alto rendimiento de los cilios primarios sea alcanzable. A continuación describimos el procedimiento para entrenar una aplicación basada en Ia para reconocer los cilios primarios y describimos los pasos necesarios para analizar la longitud y la intensidad.
Si bien el entrenamiento inicial de la Ia para reconocer los cilios requiere un tiempo significativo por parte del usuario, una vez completado se puede utilizar en cualquier conjunto de datos adquirido con los mismos parámetros. La máscara binaria generada por el Ai es modificable de tal manera que cualquier error puede ser corregido. Sin embargo, los errores en la identificación de los cilios deben indicar al usuario que la IA necesita ser entrenada aún más con imágenes adicionales. Una ventaja importante de este método es que la Ia puede ser entrenada para reconocer cilios en diferentes tipos de muestras tanto en 2D como en 3D. Los métodos de análisis anteriores generados dentro de los laboratorios tienen varias limitaciones, incluida la exigencia de umbrales manuales para la identificación y problemas para identificar los cilios fotografiados de secciones de tejido donde la densidad celular es alta36,46,47. Estos métodos también están especializados para el análisis de cilios, mientras que el análisis utilizando el software NIS Elements puede evaluar varios aspectos de las imágenes simultáneamente. Debido a que la IA descrita aquí es parte del paquete de software NIS Elements, las imágenes adquiridas con un microscopio Nikon se pueden continuar fácilmente hasta el análisis. Sin embargo, no se requieren imágenes con Nikon para el uso de este método. Independientemente del formato de archivo de datos sin procesar capturado, NIS Elements puede abrir archivos ".tif" para usarlos en ai.
Esta aplicación ai dentro de NIS Elements está ampliamente disponible y posiblemente ya sea parte del software de análisis de imágenes en uso por los laboratorios que estudian los cilios primarios. Con la expansión de la prevalencia de la tecnología Ai, otros software de imágenes pueden ampliar sus opciones de análisis para incluir un módulo Ai similar. La aplicación del análisis de Ia a la identificación de cilios se puede utilizar para varios aspectos diferentes del análisis de cilios. Si bien describimos métodos para algunos análisis simples como la longitud(Figura 2 y 3),la intensidad(Figura 4)y la colocalización(Figura 5),se puede agregar un análisis más sofisticado al flujo de trabajo de análisis GA3 como en la Figura 6. Por ejemplo, en lugar de medir la intensidad de un cilio completo, las diferencias de intensidad dentro de una subregión de un cilio pueden ser de interés para evaluar la localización subciliar. Las diferencias de intensidad dentro de una subregión de un cilio podrían indicar que la proteína se está acumulando en la punta o la base del cilio, como la forma en que las proteínas Gli se enriquecen en la punta delos cilios 48. Además, esta aplicación de Ia se puede utilizar para identificar fácilmente las diferencias entre genotipos o grupos de tratamiento. Si bien nuestro laboratorio utiliza principalmente este método para analizar cilios fotografiados de secciones cerebrales o cultivos neuronales, se puede aplicar a imágenes adquiridas de varias líneas celulares u otros tipos de tejidos. La flexibilidad del tipo de muestra en la que se puede utilizar esta aplicación hace que este método de análisis sea valioso para muchos grupos diferentes que estudian cilios primarios o cualquier orgánulo discreto que se esté evaluando, como mitocondrias, núcleos o ER.

Los cilios primarios son orgánulos sensoriales que sobresalen de la mayoría de los tipos de células de mamíferos1,2,3,4. Generalmente son apéndices solitarios críticos para coordinar diversas vías de señalización celular mediante la integración de señales extracelulares5,6,7. Los cilios primarios juegan un papel importante durante el desarrollo embrionario y la homeostasis del tejido adulto, y la interrupción de su función o morfología se asocia con varios trastornos genéticos, que se denominan colectivamente ciliopatías. Debido a la naturaleza casi ubicua de los cilios, las ciliopatías se asocian con una amplia gama de características clínicas que pueden afectar a todos los sistemas de órganos8,9,10,11,12. En modelos animales de ciliopatías, la pérdida de la estructura ciliar o la capacidad de señalización se manifiesta en varios fenotipos clínicamente relevantes, incluida la obesidad asociada a la hiperfagia3,13,14,15. En muchos sistemas modelo, se ha demostrado que los cambios en la longitud de los cilios afectan su capacidad de señalización y funciones16,17,18,19. Sin embargo, hay varios desafíos técnicos y que consumen mucho tiempo asociados con la evaluación precisa y reproducible de la longitud y la composición de los cilios.
El sistema nervioso central (SNC) de los mamíferos adultos es un contexto biológico que ha planteado un desafío para comprender la morfología y la función de los cilios. Si bien parece que las neuronas y las células de todo el SNC poseen cilios, debido a las herramientas y habilidades limitadas para observar y analizar estos cilios, la comprensión de sus funciones sigue siendo difícil de alcanzar20. Por ejemplo, el marcador prototípico de cilios, acetilado α-tubulina, no etiqueta los cilios neuronales20. La dificultad de estudiar estos cilios se resolvió en parte con el descubrimiento de varios receptores acoplados a proteínas G (GPCR), maquinaria de señalización y proteínas asociadas a la membrana que se enriquecen en la membrana de los cilios neuronales21,22. Todas estas observaciones básicas directas insinúan la importancia y la diversidad de los cilios del SNC, que hasta ahora parecen incomparables con otros tejidos. Por ejemplo, la variación en la longitud de los cilios y la localización de GPCR se pueden observar en todo el cerebro, con longitudes en ciertos núcleos neuronales que son diferentes en comparación con otros núcleos19,23. Del mismo modo, su contenido GPCR y la maquinaria de señalización complementaria muestran diversidad basada en la localización neuroanatómica y neuronal tipo2,24,25,26,27,28,29. Estas simples observaciones demuestran que la longitud y la composición de los cilios del SNC de los mamíferos están estrechamente reguladas, al igual que en los organismos modelo, como Chlamydomonas reinhardtii,pero el impacto de estas diferencias de longitud en la función de los cilios, la señalización y, en última instancia, el comportamiento sigue sin estar claro16,30,31,32.
Medir con precisión la longitud y la composición de los cilios demuestra ser un desafío técnico propenso al error del usuario y la irreproducibilidad. Actualmente, los cilios in vivo e in vitro se identifican con mayor frecuencia utilizando enfoques inmunofluorescentes que etiquetan proteínas ciliares o alelos reporteros fluorescentes enriquecidos con cilios33,34,35. Las longitudes de estos cilios marcados fluorescentemente se miden a partir de una imagen en 2 dimensiones (2D) utilizando herramientas de medición de línea en programas de análisis de imágenes como ImageJ36. Este proceso no solo es tedioso y laborioso, sino que también es propenso a sesgos y errores. Estos mismos obstáculos surgen al medir las intensidades de los cilios, que ayudan a indicar cambios en la estructura delos cilios 37. Para minimizar las inconsistencias en este tipo de análisis de imágenes, los programas de inteligencia artificial (IA) son cada vez más frecuentes y las opciones asequibles38.
Ai es el avance de los sistemas informáticos que utilizan la ventaja de los algoritmos informáticos y la programación para ejecutar tareas que normalmente requerirían inteligencia humana39. A los dispositivos ai se les enseña a percibir patrones, parámetros y características recurrentes y a tomar medidas para maximizar las probabilidades de crear resultados exitosos. Ai es versátil y puede ser entrenado para reconocer objetos específicos o estructuras de interés, como cilios, y luego ser programado para ejecutar una variedad de análisis en los objetos identificados. Por lo tanto, los datos de imagen complejos pueden ser generados rápida y reproduciblemente por Ai38. La automatización y el análisis de IA de las imágenes capturadas aumentarán la eficacia y la eficiencia al tiempo que limitarán cualquier posible error y sesgo humano39. El establecimiento de una metodología basada en ia para la identificación de cilios crea una forma consistente para que todos los grupos de investigación analicen e interpreten los datos de los cilios.
Aquí utilizamos un módulo de Ia para identificar cilios tanto in vivo como in vitro en imágenes 2D. Usando un conjunto de imágenes de muestra, la Ai está entrenada para identificar cilios. Una vez que se completa el entrenamiento, la Ai designada se utiliza para aplicar una máscara binaria sobre los cilios identificados con Ai en una imagen. Los binarios aplicados por la Ai son modificables, si es necesario, para garantizar que todos los cilios en las imágenes estén correctamente identificados y se elimine la identificación no específica. Después de utilizar la Ia para identificar los cilios, se utilizan programas de análisis general (GA) personalizados para realizar diferentes análisis, como la medición de la longitud de los cilios y la intensidad de la fluorescencia. Los datos recopilados se exportan a una tabla que se puede leer, interpretar y utilizar fácilmente para análisis estadísticos(Figura 1). El uso de tecnología automatizada y Ai para identificar cilios y obtener mediciones específicas entre grupos experimentales ayudará en futuros estudios destinados a comprender el impacto de la función y la morfología de los cilios del SNC en la comunicación y el comportamiento célula-célula.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Intel Xeon, 3.6 GHz, 32GB RAM</td>
			<td>Intel Corporation</td>
			<td>W-2123</td>
			<td>Processor used for running NIS Elements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements Software</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Ai and GA3 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadro RTX 4000 Graphics card</td>
			<td>NVIDIA Corporation</td>
			<td>Quadro RTX 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10 Professional 64-bit</td>
			<td>Microsoft Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Operating system used for running NIS Elements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Workstation</td>
			<td>HP Development Company, L.P.</td>
			<td>HP&#160;Z4G4</td>
			<td>Workstation used for running NIS Elements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

artificial intelligence approaches to assessing primary cilia

Los cilios son apéndices celulares basados en microtúbulos que funcionan como centros de señalización para una diversidad de vías de señalización en muchos tipos de células de mamíferos. La longitud de los cilios está altamente conservada, estrechamente regulada y varía entre los diferentes tipos de células y tejidos, y se ha implicado en el impacto directo de su capacidad de señalización. Por ejemplo, se ha demostrado que los cilios alteran sus longitudes en respuesta a la activación de los receptores acoplados a la proteína G ciliar. Sin embargo, medir de manera precisa y reproducible las longitudes de numerosos cilios es un procedimiento lento y laborioso. Los enfoques actuales también son propensos a errores y sesgos. Los programas de inteligencia artificial (IA) se pueden utilizar para superar muchos de estos desafíos debido a las capacidades que permiten la asimilación, manipulación y optimización de conjuntos de datos extensos. Aquí, demostramos que un módulo de Ia puede ser entrenado para reconocer cilios en imágenes de muestras in vivo e in vitro. Después de usar la Ia entrenada para identificar cilios, podemos diseñar y utilizar rápidamente aplicaciones que analizan cientos de cilios en una sola muestra para determinar la longitud, la intensidad de la fluorescencia y la colocalización. Este enfoque imparcial aumentó nuestra confianza y rigor al comparar muestras de diferentes preparaciones neuronales primarias in vitro, así como en diferentes regiones del cerebro dentro de un animal y entre animales. Además, esta técnica se puede utilizar para analizar de manera confiable la dinámica de los cilios de cualquier tipo de célula y tejido de una manera de alto rendimiento en múltiples muestras y grupos de tratamiento. En última instancia, los enfoques basados en ia probablemente se convertirán en estándar a medida que la mayoría de los campos se muevan hacia enfoques menos sesgados y más reproducibles para la adquisición y el análisis de imágenes.

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Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia

El uso de la inteligencia artificial (IA) para analizar imágenes está emergiendo como un enfoque poderoso, menos sesgado y rápido en comparación con los métodos comúnmente utilizados. Aquí entrenamos a Ai para reconocer un orgánulo celular, cilios primarios y analizar propiedades como la longitud y la intensidad de la tinción de una manera rigurosa y reproducible.

Enfoques de inteligencia artificial para evaluar los cilios primarios

Cilia are microtubule based cellular appendages that function as signaling centers for a diversity of signaling pathways in many mammalian cell types. ...

Los métodos actuales de análisis de cilios son laboriosos y propensos a errores y sesgos. Nuestro enfoque busca optimizar el tiempo y el esfuerzo al tiempo que mitiga los posibles errores. La principal ventaja que ofrece esta técnica es el aumento del rigor y la reproducibilidad y el análisis cuantitativo de imágenes.Este tipo de enfoque no solo es relevante para el análisis de cilios, sino que también se puede aplicar ampliamente a muchas cuestiones biológicas celulares, incluidas las relacionadas con otros orgánulos y proteínas citoesqueléticas. Para comenzar, abra el conjunto de datos de entrenamiento, seleccione el archivo en el menú, haga clic en importar exportación y seleccione crear archivo ND a partir de la secuencia de archivos. Seleccione la carpeta que contiene el conjunto de datos de entrenamiento y la lista de archivos se abrirá en el centro de la ventana de diálogo.Defina manualmente la organización de los archivos utilizando al menos una opción en el menú desplegable. Introduzca los valores numéricos correspondientes debajo de cada opción seleccionada y seleccione ninguna donde las opciones no estén seleccionadas. Haga clic en convertir para abrir el documento ND.Para calibrar la imagen, haga clic con el botón derecho en la opción no calibrada en la esquina inferior izquierda de la imagen. Haga clic en Calibrar documento, luego haga clic en tamaño de píxel, ingrese el valor y haga clic en Aceptar. Seleccione los controles de análisis de vista, abra la barra de herramientas binaria y seleccione detectar automáticamente o dibujar objetos para identificar a mano los cilios rastreando con precisión las estructuras ciliares individuales en todos los marcos abiertos.Para entrenar la IA, seleccione nis. ai, haga clic en segmento de tren. ai para abrir el segmento del tren.ai y luego seleccione el canal de origen que se utilizará para el entrenamiento. Seleccione los binarios de GroundTruth apropiados para entrenar a la IA. Seleccione el número requerido de iteraciones para entrenar la IA en función del tamaño binario y la distribución, luego seleccione la carpeta de destino para guardar el archivo de IA entrenado y haga clic en entrenar para entrenar el software. Este proceso dura varias horas.Abra las imágenes confocales experimentales de los cilios como se describió anteriormente convirtiendo la muestra. TIF a archivos ND2. En la ventana emergente, seleccione multipunto en el primer menú desplegable e introduzca un valor correspondiente al número total de imágenes.En el segundo cuadro desplegable, seleccione longitud de onda y cambie el valor al número total de canales de la carpeta. El software desbloqueará automáticamente una ventana de selección de longitud de onda, ubicada en la parte inferior, extremo derecho de la ventana emergente. En la ventana de selección de longitud de onda, utilice el menú desplegable de color para seleccionar el color de cada canal.Proporcione a cada canal un nombre diferente en la columna de nombre. Una vez que se actualice toda la información, haga clic en convertir. Calibre las imágenes como se describió anteriormente.Asegúrese de que el tamaño de píxel del conjunto de datos experimental sea coherente con el del conjunto de datos de entrenamiento. Identifique los cilios en el primer canal utilizando la IA entrenada del paso anterior. Abrir nis.ai en el menú, seleccione segmento. ai y, a continuación, seleccione AC3 en los canales de origen. A continuación, identifique los cilios en el segundo canal seleccionando MCHR1 en los canales de origen.El software dibujará binarios en los cilios etiquetados. A continuación, verifique las imágenes en busca de binarios mal identificados. Seleccione eliminar objeto en la barra de herramientas binaria para eliminar manualmente los binarios mal identificados.Una vez identificados y segmentados los cilios, analizar diferentes parámetros de los cilios, como longitudes e intensidades, utilizando la herramienta de análisis general tres. Seleccione la imagen en el menú y haga clic en la nueva receta GA3. Se abrirá una nueva ventana con un espacio en blanco en el centro.GA3 detectará automáticamente los binarios debidamente etiquetados de acuerdo con la IA e incluirá el nodo correspondiente. GA3 también detectará automáticamente los canales en las imágenes y mostrará sus pestañas debajo de los canales. La IA segmentará todos los cilios como objetos en el marco y detectará cilios incompletos a lo largo de los bordes del marco.Para eliminarlos, seleccione procesamiento binario, quite objetos y, a continuación, arrastre el nodo de bordes táctiles al espacio en blanco y conecte el nodo a los binarios apropiados. Para medir la longitud de los cilios, seleccione tamaño del objeto de medición y, a continuación, longitud. Arrastre y suelte el parámetro en el centro y conéctese al nodo binario apropiado.Para medir las intensidades de los cilios, seleccione alguna intensidad de objeto. Arrastre y suelte el parámetro al centro y conéctese al nodo binario apropiado y al canal de interés. En el menú de medición, vaya a la ratiometría de objetos y seleccione el coeficiente de Mander para configurar la vía de colocalización en GA3 midiendo la superposición de dos canales dentro de los cilios individuales.Arrastre y suelte el nodo de coeficiente de Mander en el espacio en blanco y conéctelo al binario y los canales apropiados. ApEn las mediciones y la tabla única abriendo el menú de gestión de datos. En la categoría básica, seleccione la columna ApEn y, a continuación, haga clic en Ejecutar ahora para medir los cilios.Todas las mediciones aparecerán en una sola tabla de salida. Las imágenes representativas muestran que la IA entrenada identificó adecuadamente los cilios in vitro en las imágenes de células IMCD, cultivos hipotalámicos primarios y cultivos de hipocampo, pero no otras estructuras no ciliares como los puentes citocinéticos. La longitud de los cilios varió de 0,5 a 4,5 micrómetros en las células IMCD y de dos a 12 micrómetros en el cultivo hipotalámico y del hipocampo.La IA midió las longitudes de los cilios marcados con AC3 in vivo en las imágenes de nuestras regiones de núcleo arqueado, núcleo paraventricular y cornu ammonis one. Según el análisis, los cilios hipotalámicos in vivo oscilaron entre uno y 15 micrómetros, como se ve en las barras blancas y marrones. Mientras que los cilios y la región de cornu ammonis variaron de uno a 10 micrómetros, como se ve en las barras grises.Curiosamente, la intensidad del MCHR1 ciliar fue más fuerte en el núcleo paraventricular que en el núcleo arqueado. Las intensidades de MCHR1 contra AC3 se trazaron para medir su superposición. La mayoría de los cilios fueron positivos para ambos marcadores, mientras que algunos cilios fueron positivos para AC3 o MCHR1.Para cuantificar la colocalización de MTHR1 dentro de AC3, se midió el coeficiente de superposición de Mander y hubo un aumento significativo en la superposición en el núcleo paraventricular que en el núcleo arqueado. Para medir la intensidad a lo largo de la longitud de los cilios, se definió la polaridad de los cilios utilizando Centrin2-GFP como marcador basal del cuerpo. Esto permitió distinguir la base de los cilios de las puntas de los cilios positivos de cereza ARL13B-M.Se observaron cambios en la intensidad de ARL13B a lo largo de la longitud de los cilios donde la intensidad de ARL13B fue mayor en la base que en la punta del cilio en el núcleo arqueado, visto a la izquierda, así como PVN, como se ve a la derecha. Al analizar datos con este enfoque, es importante asegurarse de que la calidad y la resolución del conjunto de datos experimentales sean consistentes con las utilizadas para entrenar a la IA. La principal utilidad de este enfoque es que después de detectar cilios por IA, el usuario puede ser creativo sobre qué propiedades se analizan personalizando el flujo de trabajo de análisis integrado dentro del software.

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