Name: artificial intelligence approaches to assessing primary cilia
Uploaded: 2021-05-01T14:00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia at JoVE.com

Detta arbete finansierades av National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases R01 DK114008 till NFB och American Heart Association Fellowship Grant #18PRE34020122 till RB. Vi tackar Rich Gruskin General Manager för Nikon Software, Melissa Bentley, Courtney Haycraft och Teresa Mastracci för insiktsfulla kommentarer om manuskriptet.

1. Skaffa råa bilder
<ol><li>Fix och immunolabel prover efter behov20.<ol>
<li>Bildcilia med hjälp av ett konfokalt mikroskop på maximalt bitdjup med samma pixelstorlek med Nyquistupplösning.</li>
		<li>Exportera bilder som monokroma taggade bildformat (.tif) filer. OBS: Det här protokollet beskriver hur du använder Ai-modulen specifikt i NIS Elements-programvaran. Om bilder har förvärvats som .nd2-filer är det inte nödvändigt att exportera bilder som .tif filer och användaren kan gå direkt till steg 2.3. Om bilder har förvärvats i ett annat system kan en NIS Elements-licens köpas separat och .tif filer kan konverteras enligt beskrivningen i nästa steg.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Träna Ai för att identifiera cilia
<ol><li>Öppna tränings data uppsättningen.<ol>
<li>Välj cirka 50 exempelbilder med minst ett cilium per bildruta för att träna programvaran och kopiera dem i en enda mapp. Den här mappen används för att styra programvaran när du öppnar bilderna. Öppna dessa 50 bildrutor i ett enda ND2-dokument med minst ett cilium per ram. Välj Arkiv > Importera/exportera > Skapa ND-fil från Filsekvens.</li>
		<li>Välj mappen som innehåller utbildnings data uppsättningen. Detta öppnar listan över filer i mitten av dialogfönstret. Definiera manuellt hur filerna organiseras med minst ett alternativ i den nedrullningsbar menyn ovan. Alternativen är multipunkt (för flera maximala projektionsfiler), Z-serien (för en z stackbild), tid (för en tidsfördröjningsbild) och våglängd (för filer från flera kanaler).</li>
		<li>Ange motsvarande numeriska värden under varje markerat alternativ. Välj Ingen där alternativen inte är markerade. Öppna ND-dokumentet genom att klicka på Konvertera.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kalibrera bilder.<ol>
<li>Ange pixelstorleken i bildens nedre vänstra hörn: Högerklicka på Oavlånat > Kalibrera dokument > Pixelstorlek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identifiera cilia.<ol>
<li>Handidentifiera cilierna genom att exakt spåra enskilda ciliarystrukturer på alla öppnade bildrutor med antingen AutoDetect eller Draw Object i det binära verktygsfältet. Detta kommer att rita binära masker på objekt av intresse. Dessa binärer kommer att fungera som exempelobjekt för att träna programvaran för att identifiera cilia på pixelbaserade egenskaper i framtida experimentell bildanalys. Välj Visa > analyskontroller > binärt verktygsfält > Rita objekt. OBS: Ta bort alla ramar som inte har några binärfiler eftersom programvaran inte börjar tränas om den inte kan identifiera binärfiler på alla öppnade ramar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Träna Ai.<ol>
<li>Börja träna programvaran. Detta öppnar tåget Segment.ai låda. Välj NIS.ai > Träna Segment.ai.</li>
		<li>Välj den källkanal som ska användas för träning i rutan Tåg Segment.ai. Om filer från flera kanaler är öppna väljer du bara en kanal som källkanal. Välj sedan lämpliga mark sanning binärer som du ska träna Ai. Välj slutligen antalet iterationer som behövs för att träna Ai beroende på binaries storlek och distribution. OBS: Om binärfilerna lätt kan upptäckas från omgivningen och distribueras väl i hela bilden kan programvaran behöva mindre än 1000 iterationer för att tränas för att identifiera bilderna. Om bilderna har ett lågt signal-till-brus-förhållande är det idealiskt att köra minst 1000 iterationer under träning för att Ai ska kunna identifiera cilia i testprover med hög konfidens.</li>
		<li>Välj målmappen för att spara den tränade Ai-filen (.sai) och klicka på Träna för att träna programvaran. Programvaran kommer nu att fortsätta att träna sig själv för att identifiera cilia baserat på de spårade binärerna. Den här processen tar flera timmar. OBS: Under träning visar programvaran ett diagram som visar träningsförlust. Diagrammet kommer inledningsvis att visa en spik innan den avsmalnar till idealiskt cirka 1% förlust där den platåer under resten av träningen. Spara diagrammet för framtida referens genom att markera rutan för Spara diagram skärmdump på rutan Tåg Segment.ai(Kompletterande bild 1).</li>
		<li>Om ytterligare förfining av utbildningen krävs fortsätter du att träna på samma data uppsättning. Alternativt kan du träna på en ny data uppsättning med exakt samma parametrar. Det är inte tillrådligt att träna en redan utbildad Ai på en ny datauppsättning med olika parametrar eller olika objekt av intresse. Välj Träna segment.ai > Fortsätt träna på > Välj utbildad Ai-fil.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Identifiera cilier med utbildad Ai
<ol><li>Öppna den experimentella datauppsättningen.<ol>
<li>Öppna de experimentella konfokala bilderna av cilia i programvaran genom att konvertera exemplet .tif filer till .nd2-filer, liknande steg 2.1. Välj Arkiv > Importera/exportera > Skapa ND-fil från Filsekvens. Bilderna ska ha samma pixelstorlek som de som används för att träna Ai. Om bilderna redan är i ND2-format hoppar du till steg 3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kalibrera bilder.<ol>
<li>Ange pixelstorleken i bildens nedre vänstra hörn. Högerklicka på Uncalibrated > Kalibrera dokument > Pixelstorlek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kör den tränade Ai på de öppnade filerna.<ol>
<li>Börja identifiera cilierna med Ai. Programvaran kommer nu att rita binärer på cilierna baserat på den utbildning den fick i föregående steg. Den här processen tar några sekunder. Välj NIS.ai > Segment.ai. Obs: Programvaran kommer att uppmanas att välja kanalen om flera kanaler är öppna. Kanaler listas efter sina respektive namn här. Om inte, markeras rutan "Mono" automatiskt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kontrollera om det finns felidentifierade binärfiler.<ol>
<li>När Ai:n har identifierat cilia och ritat binärfiler kontrollerar du bilderna efter eventuella felaktigt identifierade objekt. Om så önskas tar du bort felidentifierade binärfiler manuellt. Välj Visa > analyskontroller > Binärt verktygsfält > Ta bort objekt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Mätning av cililängd och intensitet
<ol><li>Skapa ett nytt recept på allmän analys 3 (GA3).<ol>
<li>Nu när cilierna har identifierats och segmenterats, fortsätt att analysera olika parametrar för cilia som längder och intensiteter med GA3-verktyget. Detta öppnar ett nytt fönster med ett tomt utrymme i mitten där analysen ska definieras. Välj Bild > nytt GA3-recept. 
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Välj de binärfiler som ska analyseras.<ol>
<li>Eftersom clia redan är segmenterade med Segment.ai kommer GA3 automatiskt att upptäcka binärfilerna som är korrekt märkta enligt Ai och inkludera noden. Välj "Binärfiler > automatiskt Detect_AI" eller "Binärer > Rita Object_AI".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Välj de kanaler som krävs för analys. GA3 kommer också automatiskt att upptäcka kanalerna i bilderna och visa sina flikar under Kanaler.</li>
	<li>Ta bort objekt som vidrör ramens kant.<ol>
<li>Eftersom Ai kommer att segmentera alla cilier som objekt i ramen, kommer den också att upptäcka ofullständiga cili längs ramens kanter. Dessa objekt kan antingen tas bort manuellt i steg 3.4 eller så kan de tas bort automatiskt i GA3. Välj Binär bearbetning > Ta bort objekt > Vidröra kantlinjer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Välj parametrar för att mäta cilia.<ol>
<li>Dra och släpp parametrarna för att mäta till exempel cililängd (längd) och intensitet(Summa objektintensitet). Anslut noderna till lämpliga binära noder (anslutning A) och kanalnoder (anslutning B). Hovra över nodanslutningen för ett verktygstips för att visa vilken anslutning noden tillhör. Välj Mät > objektstorlek > längd och mätning > objektintensitet > Summa Obj-intensitet. Nodens längd ansluts endast till den binära noden, medan Sum Obj Intensity ansluter till både binära noder och kanalnoderna.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lägg till måtten i en enda tabell.<ol>
<li>Kombinera alla mått i en enda utdatatabell genom att dra och släppa noden Lägg till kolumn till analysflödesdiagrammet och anslut den till mätnoderna Längd och Summa Obj-intensitet. Välj Datahantering > grundläggande > tilläggskolumn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mät cilia.<ol>
<li>Mät cilia genom att klicka på Kör. Denna process tar en liten stund att mäta alla cilier i de experimentella bilderna. Längder och intensiteter visas i ett nytt analysresultatfönster. OBS: Tabellen kan ibland innehålla data från masker som Ai kände igen som cilier men var för små för att upptäckas av det mänskliga ögat och elimineras i steg 3.4. Dessa objekt kan tas bort från datauppsättningen med hjälp av ett filter före statistisk analys. Här användes ett filter på 1 μm för mätningar av in vitro-cilialängd i figur 2 och 2 μm för in vivo cilia. Detta kan göras innan du exporterar data med hjälp av vägen nedan. Välj Fönstret Analysresultat > Definiera filter > Ange värde > använda filter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exportdata för statistisk analys.</li>
</ol>5. Colocalization studier
OBS: Colocalization analys kan ingå i samma GA3 recept som används för mätningar av cilia längd och intensitet analys. Om du använder samma recept öppnar du filer enligt beskrivningen nedan och mäter längden och intensiteten för båda kanalerna tillsammans med colocaliseringskoefficienterna i samma analyspipeline.
<ol><li>Öppna den experimentella datauppsättningen.<ol>
<li>Öppna de experimentella konfokala bilderna av cilia i programvaran genom att konvertera exemplet .tif filer till .nd2-filer. Välj Arkiv > Importera/exportera > Skapa ND-fil från Filsekvens.</li>
		<li>I popup-fönstret väljer du de 16-bitars djup monokroma filerna från alla kanaler av intresse från fönsterutforskaren som finns i den första kolumnen i popup-fönstret. Välj Multipoint- eller Z-serie på den första rullgardinsmenyn och ange ett värde som motsvarar det totala antalet bilder eller staplar.</li>
		<li>I den andra listrutan väljer du Våglängd och ändrar värdet till det totala antalet kanaler i mappen. Programvaran låser automatiskt upp ett våglängdsvalsfönster längst ner till höger i popup-fönstret. Använd listrutan Färg för att välja färg på varje kanal. Ge varje kanal ett annat namn under kolumnen Namn. När all information har uppdaterats klickar du på Konvertera. Programvaran genererar automatiskt en All image fil överlagd med alla enskilda bilder från alla valda kanaler.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalibrera bilder.<ol>
<li>Ange pixelstorleken i bildens nedre vänstra hörn. Högerklicka på Uncalibrated > Kalibrera dokument > Pixelstorlek.</li>
	</ol></li>
	<li>Kör den tränade Ai på den första kanalen.<ol>
<li>Börja identifiera cilierna på en av de öppnade kanalerna (t.ex. ACIII; Bild 5A) använda Ai. Programvaran kommer nu att rita binärer på ACIII-märkta cilia baserat på den utbildning den fick för denna kanal. Den här processen tar några sekunder. Välj NIS.ai > Segment.ai > källkanaler > ACIII.</li>
	</ol></li>
	<li>Kör den tränade Ai på den andra kanalen.<ol>
<li>Börja identifiera cilia på den andra öppnade kanalen (t.ex. MCHR1; Bild 5B) använda Ai. Programvaran kommer nu att rita binärer på MCHR1-märkta cilia baserat på den utbildning den fick för denna kanal. Denna process kommer att ta en liten stund. Välj NIS.ai > Segment.ai > källkanaler > MCHR1.</li>
	</ol></li>
	<li>Kontrollera om det finns felidentifierade binärfiler.<ol>
<li>När Ai:n har identifierat cilia och ritat binärfiler kontrollerar du bilderna efter felidentifierade objekt. Ta bort felidentifierade binärfiler manuellt om det behövs. Välj Visa > analyskontroller > binärt verktygsfält > Ta bort objekt.
</li>
	</ol></li>
	<li>Skapa nytt GA3-recept.<ol>
<li>Nu när cilierna har identifierats och segmenterats, fortsätt till colocalization-analysen med GA3-verktyget. Detta öppnar ett nytt fönster med ett tomt utrymme i mitten där analysen ska definieras. Ett fönster med alla identifierade binärfiler och kanaler genereras. Kontrollera att alla önskade kanaler och binärfiler som krävs för analys finns och väljs. Välj Bild > nytt GA3-recept.</li>
	</ol></li>
	<li>Ta bort objekt som vidrör ramens kant.<ol>
<li>Eftersom Ai kommer att segmentera alla cilia-liknande objekt i ramen, kommer den också att upptäcka ofullständiga cilier längs ramens kanter. Dessa objekt kan antingen tas bort manuellt i steg 5.5 eller så kan de tas bort automatiskt i GA3. Välj Binär bearbetning > Ta bort objekt > Vidröra kantlinjer.
</li>
	</ol></li>
	<li>Ställ in colocalization-vägen i GA3.<ol>
<li>Om du vill mäta överlappningen mellan de två kanalerna inom cilia använder du Manders koefficientkorrelation. Dra och släpp noden Manders Coefficient i det tomma utrymmet i GA3-receptet och anslut den till lämpliga binära och kanaler. Här ansluter "anslutning A" till ACIII-binärfilen, "anslutning B" med MCHR1-kanalen och "anslutning C" med ACIII-kanalen för att bestämma överlappningen av MCHR1 inom ACIII binär. Välj Mät > objekt ratiometry > Manders Coefficient. OBS: Programvaran gör det möjligt att mäta colocalization med Pearson Coefficient Correlation med samma steg som beskrivs i detta protokoll40.</li>
	</ol></li>
	<li>Lägg till måtten i en enda tabell.<ol>
<li>Kombinera alla mått i en enda utdatatabell. Välj Datahantering > grundläggande > tilläggskolumn.</li>
	</ol></li>
	<li>Mät colocalization.<ol>
<li>Mät cilia genom att klicka på Kör. Denna process tar en liten stund att mäta alla cilier i de experimentella bilderna. Data visas i ett nytt analysresultatfönster.</li>
	</ol></li>
	<li>Exportdata för statistisk analys.</li>
</ol>

Medförfattaren Wesley Lewis är anställd av Nikon. Det finns inga finansiella upplysningar.

Längd- och intensitetsmätningar är vanliga sätt som primära cilia analyseras, men det finns ingen standardiserad konventionell metod som används i fältet. Identifiering och kvantifiering av primära cilier med hjälp av programvara som ImageJ är tidskrävande och benägen för användarens partiskhet och fel. Detta gör det svårt att noggrant analysera stora datamängder. Här visar vi att användning av ett Ai-program kan övervinna många av dessa utmaningar vilket gör hög genomströmningsanalys av primära cilia uppnåeliga. Här beskriver vi proceduren för att träna en Ai-baserad applikation för att känna igen primära cilier och beskriva de steg som krävs för att analysera längd och intensitet.
Medan den inledande utbildningen av Ai för att känna igen cilia kräver betydande tid från användaren, kan den användas på alla datauppsättningar som förvärvats med samma parametrar när den är klar. Den binära masken som genereras av Ai:n kan ändras så att eventuella fel kan korrigeras. Fel i cilia-identifieringen bör dock signalera användaren att Ai behöver ytterligare tränas med ytterligare bilder. En stor fördel med denna metod är att Ai kan tränas att känna igen cilia i olika provtyper i både 2D och 3D. Tidigare analysmetoder som genereras inom laboratorier har olika begränsningar, inklusive att kräva manuell tröskel för identifiering och problem med att identifiera cilia avbildade från vävnadssektioner där celltätheten är hög36,46,47. Dessa metoder är också specialiserade för cilia-analys medan analys med NIS Elements programvara kan utvärdera flera aspekter av bilderna samtidigt. Eftersom Ai som beskrivs här är en del av NIS Elements mjukvarupaket kan bilder som förvärvats med hjälp av ett Nikon-mikroskop enkelt fortsättas till analys. Avbildning med Nikon krävs dock inte för användning av denna metod. Oavsett det infångade rådatafilformatet kan ".tif" filer öppnas av NIS Elements att använda i Ai.
Denna Ai-applikation inom NIS Elements är allmänt tillgänglig och möjligen redan en del av bildanalysprogramvara som används av laboratorier som studerar primära cilier. När förekomsten av Ai-teknik expanderar kan annan bildbehandlingsprogramvara utöka sina analysalternativ till att omfatta en liknande Ai-modul. Att tillämpa Ai-analys på ciliaidentifiering kan användas för flera olika aspekter av ciliaanalys. Medan vi skisserade metoder för några enkla analyser som längd (figur 2 och 3), intensitet (figur 4) och colocalization (figur 5) kan mer sofistikerad analys läggas till GA3-analysarbetsflödet som i figur 6. I stället för att mäta intensiteten hos ett komplett cilium kan till exempel skillnader i intensitet inom en delregion av ett cilium vara av intresse för att bedöma sub-ciliary lokalisering. Skillnader i intensitet inom en underregion av ett cilium kan tyda på att proteinet ackumuleras vid spetsen eller basen av ciliumet, till exempel hur Gli-proteiner berikas vid spetsen av cilia48. Dessutom kan denna Ai-applikation användas för att enkelt identifiera skillnader mellan genotyper eller behandlingsgrupper. Medan vårt labb främst använder denna metod för att analysera cilia avbildade från hjärnsektioner eller neuronala kulturer, kan det tillämpas på bilder som förvärvats från olika cellinjer eller andra vävnadstyper. Flexibiliteten hos provtyp som denna applikation kan användas på gör denna analysmetod värdefull för många olika grupper som studerar primära cilier eller någon diskret organell som bedöms såsom mitokondrier, kärna eller ER.

Primära cilier är sensoriska organeller som sticker ut från de flesta däggdjurscelltyper1,2,3,4. De är i allmänhet ensamma bilagor som är kritiska för att samordna olika cellsignaleringsvägar genom att integrera extracellulära signaler5,6,7. Primära cilia spelar viktiga roller under embryonal utveckling och vuxna vävnad homeostas, och störningar av deras funktion eller morfologi är associerad med flera genetiska störningar, som kollektivt kallas ciliopathies. På grund av cilias nästan allestädes närvarande natur är ciliopatier förknippade med ett brett spektrum av kliniska funktioner som kan påverka alla organsystem8,9,10,11,12. I djurmodeller av ciliopatier manifesteras förlust av ciliär struktur eller signalkapacitet i flera kliniskt relevanta fenotyper inklusive hyperfagiassocierad fetma3,13,14,15. I många modellsystem har cilialängdsändringar visat sig påverka deras signalkapacitet och funktioner16,17,18,19. Det finns dock flera tidskrävande och tekniska utmaningar förknippade med att noggrant och reproducerbart bedöma cilia längd och sammansättning.
Det vuxna däggdjurets centrala nervsystem (CNS) är ett biologiskt sammanhang som har inneburit en utmaning för att förstå cilia morfologi och funktion. Medan det verkar som om nervceller och celler i hela CNS har cilier, på grund av de begränsade verktygen och förmågorna att observera och analysera dessa cilier förblir en förståelse av deras funktioner svårfångad20. Till exempel märker den prototypiska ciliamarkören, acetylerad α-tubulin, inte neuronala cilia20. Svårigheten att studera dessa cilier löstes delvis med upptäckten av flera G-proteinkopplade receptorer (GPCR), signalmaskiner och membranassocierade proteiner som berikas på membranet av neuronal cilia21,22. Alla dessa enkla grundläggande observationer antyder vikten och mångfalden av CNS cilia, som hittills verkar oöverträffad av andra vävnader. Till exempel kan variation i cilialängd och GPCR-lokalisering observeras i hela hjärnan, med längder i vissa neuronala kärnor som är olika jämfört med andra kärnor19,23. På samma sätt visar deras GPCR-innehåll och signalmaskiner komplimanger mångfald baserat på neuroanatomisk plats och neuronal typ2,24,25,26,27,28,29. Dessa enkla observationer visar att däggdjur CNS cilia längd och sammansättning är tätt reglerade, precis som i modellorganismer, som Chlamydomonas reinhardtii, men effekten av dessa längdskillnader på cilifunktion, signalering och i slutändan beteende förblir oklart16,30,31,32.
Att noggrant mäta cililängd och sammansättning visar sig vara en teknisk utmaning som är benägen för användarfel och irreproduktivitet. För närvarande identifieras cilia in vivo och in vitro oftast med hjälp av immunofluorescent metoder som märker ciliary proteiner eller cilia-berikade fluorescerande reporter alleler33,34,35. Längden på dessa fluorescerande taggade cilia mäts sedan från en 2-dimensionell (2D) bild med hjälp av linjemätningsverktyg i bildanalysprogram som ImageJ36. Denna process är inte bara tråkig och arbetsintensiv utan också benägen för partiskhet och fel. Samma hinder uppstår vid mätning av cilia-intensiteter, vilket hjälper till att indikera förändringar i cilia struktur37. För att minimera inkonsekvenserna i dessa typer av bildanalyser blir ai-program (artificiell intelligens) allt vanligare och billigare alternativ38.
Ai är utvecklingen av datorsystem som använder fördelen med datoralgoritmer och programmering för att utföra uppgifter som vanligtvis skulle kräva mänsklig intelligens39. Ai-enheter lär sig att uppfatta återkommande mönster, parametrar och egenskaper och vidta åtgärder för att maximera oddsen för att skapa framgångsrika resultat. Ai är mångsidigt och kan tränas för att känna igen specifika objekt eller strukturer av intresse, till exempel cilia, och sedan programmeras för att köra en mängd olika analyser på de identifierade objekten. Därför kan komplexa bilddata genereras snabbt och reproducerbart av Ai38. Automatisering och Ai-analys av tagna bilder kommer att öka effektiviteten och effektiviteten samtidigt som eventuella mänskliga fel och partiskhetbegränsas 39. Att etablera en Ai-baserad metodik för ciliaidentifiering skapar ett konsekvent sätt för alla forskargrupper att analysera och tolka ciliadata.
Här använder vi en Ai-modul för att identifiera cilia både in vivo och in vitro på 2D-bilder. Med hjälp av en uppsättning exempelbilder tränas Ai:n för att identifiera cilia. När träningen är klar används den angivna Ai för att tillämpa en binär mask över Ai-identifierade cilia i en bild. De binärfiler som tillämpas av Ai är modifierbara, om det behövs, för att säkerställa att alla cilia i bilderna identifieras korrekt och att icke-specifik identifiering elimineras. Efter att ha använt Ai för att identifiera cilia används specialbyggda allmänna analysprogram (GA) för att utföra olika analyser som att mäta cililängd och fluorescensintensitet. De insamlade uppgifterna exporteras till en tabell som lätt kan läsas, tolkas och användas för statistiska analyser (figur 1). Användningen av automatiserad teknik och Ai för att identifiera cilia och få specifika mätningar mellan experimentella grupper kommer att hjälpa till i framtida studier som syftar till att förstå effekten av CNS cilia-funktion och morfologi på cellcellskommunikation och beteende.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Intel Xeon, 3.6 GHz, 32GB RAM</td>
			<td>Intel Corporation</td>
			<td>W-2123</td>
			<td>Processor used for running NIS Elements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements Software</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Ai and GA3 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadro RTX 4000 Graphics card</td>
			<td>NVIDIA Corporation</td>
			<td>Quadro RTX 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10 Professional 64-bit</td>
			<td>Microsoft Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Operating system used for running NIS Elements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Workstation</td>
			<td>HP Development Company, L.P.</td>
			<td>HP&#160;Z4G4</td>
			<td>Workstation used for running NIS Elements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

artificial intelligence approaches to assessing primary cilia

Cilia är mikrotubulebaserade cellulära bilagor som fungerar som signalcentra för en mångfald av signalvägar i många däggdjurscelltyper. Cilialängden är mycket bevarad, hårt reglerad och varierar mellan olika celltyper och vävnader och har varit inblandad i att direkt påverka deras signalkapacitet. Till exempel har cilia visat sig ändra sina längder som svar på aktivering av ciliary G protein-kopplade receptorer. Men att noggrant och reproducerbart mäta längden på många cilier är ett tidskrävande och arbetsintensivt förfarande. Nuvarande tillvägagångssätt är också fel- och partiska. Ai-program (Artificial Intelligence) kan användas för att övervinna många av dessa utmaningar på grund av funktioner som tillåter assimilering, manipulering och optimering av omfattande datauppsättningar. Här visar vi att en Ai-modul kan tränas att känna igen cilia i bilder från både in vivo- och in vitro-prover. Efter att ha använt den utbildade Ai för att identifiera cilia kan vi designa och snabbt använda applikationer som analyserar hundratals cilier i ett enda prov för längd, fluorescensintensitet och samlokalisering. Detta opartiska tillvägagångssätt ökade vårt självförtroende och stringens när vi jämförde prover från olika primära neuronala preps in vitro samt över olika hjärnregioner inom ett djur och mellan djur. Dessutom kan denna teknik användas för att tillförlitligt analysera cilia dynamik från alla celltyper och vävnad på ett sätt med hög genomströmning över flera prover och behandlingsgrupper. I slutändan kommer Ai-baserade metoder sannolikt att bli standard eftersom de flesta fält rör sig mot mindre partiska och mer reproducerbara metoder för bildförvärv och analys.

Watch this Scientific Journal Video about Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia at JoVE.com

Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia

Användningen av artificiell intelligens (Ai) för att analysera bilder framträder som ett kraftfullt, mindre partiskt och snabbt tillvägagångssätt jämfört med vanliga metoder. Här tränade vi Ai att känna igen en cellulär organell, primär cilia, och analysera egenskaper som längd och färgningsintensitet på ett rigoröst och reproducerbart sätt.

Artificiell intelligens metoder för att bedöma primära Cilia

Cilia are microtubule based cellular appendages that function as signaling centers for a diversity of signaling pathways in many mammalian cell types. ...

Nuvarande metoder för ciliaanalys är arbetsintensiva och benägna att fel och partiskhet. Vårt tillvägagångssätt syftar till att effektivisera tid och ansträngning samtidigt som vi minskar potentiella fel. Den största fördelen som denna teknik erbjuder är ökad stringens och reproducerbarhet och kvantitativ bildanalys.Denna typ av tillvägagångssätt är inte bara relevant för cilia analys, men kan tillämpas i stor utsträckning på många cellbiologiska frågor, inklusive de som handlar om andra organeller och cytoskeletala proteiner. Börja med att öppna träningsdatauppsättningen, välja fil på menyn, klicka på importera export och välj skapa ND-fil från filsekvensen. Markera mappen som innehåller träningsdatauppsättningen så öppnas listan över filer i mitten av dialogfönstret.Definiera manuellt organisationen av filer med minst ett alternativ i den nedrullningsbar menyn. Ange motsvarande numeriska värden under varje markerat alternativ och välj inga där alternativen inte är markerade. Klicka på konvertera för att öppna ND-dokumentet.Om du vill kalibrera bilden högerklickar du på det odelibrerade alternativet i bildens nedre vänstra hörn. Klicka på kalibrera dokument, klicka sedan på pixelstorlek, ange värdet och klicka på okej. Välj vyanalyskontroller, öppna det binära verktygsfältet och välj identifiera eller rita objekt automatiskt för att identifiera cilia genom att exakt spåra enskilda ciliary strukturer på alla öppnade ramar.För att träna AI: n väljer du nis. ai, klicka på tågsegmentet. ai för att öppna tågsegmentet.ai-rutan och välj sedan den källkanal som ska användas för träning. Välj lämpliga GroundTruth-binärer för att träna AI: n. Välj önskat antal iterationer för att träna AI beroende på binär storlek och distribution, välj sedan målmappen för att spara den utbildade AI-filen och klicka på tåget för att träna programvaran. Den här processen tar flera timmar.Öppna de experimentella konfokala bilderna av cilia enligt beskrivningen tidigare genom att konvertera provet. TIF-filer till ND2-filer. I popup-fönstret väljer du flera punkter på den första listrutan och anger ett värde som motsvarar det totala antalet bilder.I den andra listrutan väljer du våglängd och ändrar värdet till det totala antalet kanaler i mappen. Programvaran låser automatiskt upp ett våglängdsvalsfönster, som ligger längst ner, till höger i popup-fönstret. I fönstret för val av våglängd använder du den nedrullningsbara färgmenyn för att välja färgen på varje kanal.Ge varje kanal ett annat namn under namnkolumnen. När all information har uppdaterats klickar du på Konvertera. Kalibrera bilderna enligt beskrivningen tidigare.Kontrollera att pixel storleken på den experimentella data uppsättningen överensstämmer med utbildnings data uppsättningen. Identifiera cilia på den första kanalen genom att använda den utbildade AI:n från föregående steg. Öppna nis.ai på menyn väljer du segment. ai väljer du sedan AC3 i källkanalerna. Identifiera sedan cilierna på den andra kanalen genom att välja MCHR1 i källkanalerna.Programvaran kommer att rita binärer på den märkta cilia. Kontrollera sedan bilderna efter felidentifierade binärfiler. Välj ta bort objekt i det binära verktygsfältet om du vill ta bort de felidentifierade binärfilerna manuellt.När cilierna har identifierats och segmenterats, analysera olika ciliaparametrar, såsom längder och intensiteter, med hjälp av det allmänna analys tre-verktyget. Välj bild på menyn och klicka på nytt GA3-recept. Ett nytt fönster med tomt utrymme i mitten öppnas.GA3 identifierar automatiskt binärfilerna på lämpligt sätt märkta enligt AI:n och inkluderar motsvarande nod. GA3 kommer också automatiskt att upptäcka kanalerna i bilderna och visa sina flikar under kanaler. AI:n segmenterar alla cilierliknande objekt i ramen och upptäcker ofullständiga cilier längs ramens kanter.Om du vill ta bort dem markerar du binär bearbetning, tar bort objekt och drar sedan noden för beröringskantlinjer till det tomma utrymmet och ansluter noden till lämpliga binärfiler. Om du vill mäta cililängd väljer du måttobjektets storlek och sedan längd. Dra och släpp parametern till mitten och anslut till lämplig binär nod.Om du vill mäta cilia-intensitet markerar du viss objektintensitet. Dra och släpp parametern till mitten och anslut till lämplig binär nod och kanal av intresse. I mätmenyn går du till objekt ratiometry och väljer Manders koefficient för att ställa in colocalization-vägen i GA3 genom att mäta överlappningen av två kanaler inom enskilda cilier.Dra och släpp Manders koefficientnod i det tomma utrymmet och anslut den till lämpliga binära och kanaler. ApEn mätningarna och den enskilda tabellen genom att öppna datahanteringsmenyn. I den grundläggande kategorin väljer du ApEn-kolumnen och klickar sedan på Kör nu för att mäta cilia.Alla mått visas i en enda utdatatabell. De representativa bilderna visar att den utbildade AI korrekt identifierade cilia in vitro i bilder av IMCD celler, primära hypotalamus kulturer och hippocampal kulturer, men inga andra icke ciliary strukturer såsom cytokinetic broar. Längden på cilierna varierade från 0,5 till 4,5 mikrometer i IMCD-celler och två till 12 mikrometer i den hypotalamus och hippocampala kulturen.AI mätte längden på AC3 märkt cilia in vivo i bilderna av vår arcuate kärna, paraventrikulära kärna och cornu ammonis en regioner. Enligt analysen varierade hypotalamus cilia in vivo från en till 15 mikrometer, sett i vita och bruna barer. Medan cilia och cornu ammonis-regionen varierade från en till 10 mikrometer, som ses i gråa barer.Intressant nog var intensiteten i ciliary MCHR1 starkare i paraventricular kärnan än den i arcuate kärnan. MCHR1:s intensitet gentemot AC3 planerades för att mäta deras överlappning. Majoriteten av cilierna var positiva för båda markörer medan vissa cilia var positiva för antingen AC3 eller MCHR1.För att kvantifiera colocalization av MTHR1 inom AC3 mättes Manders överlappningskoefficient och det fanns en betydande ökning av överlappningen i paraventricular kärnan än i arcuate kärnan. För att mäta intensiteten längs ciliaens längd definierades cilia polaritet med Centrin2-GFP som basal kroppsmarkör. Detta gjorde det möjligt att skilja basen av cilia från spetsarna av ARL13B-M körsbärspositiva cilia.Förändringar i ARL13B intensitet längs längden av cilia observerades där ARL13B intensitet var högre vid basen än vid spetsen av cilium i arcuate kärnan, sett till vänster, liksom PVN, som ses till höger. När du analyserar data med den här metoden är det viktigt att se till att kvaliteten och upplösningen för den experimentella data uppsättningen överensstämmer med den som används för att träna AI. Det viktigaste verktyget för denna metod är efter att ha upptäckt cilia av AI, användaren kan vara kreativ om vilka egenskaper som analyseras genom att anpassa analysarbetsflödet integrerat i programvaran.

Research

JoVE Journal

Biology

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

Skörd sperma och artificiell insemination av Möss

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals.  Peromyscus species are used in a wide range of research ...

Experimental Approaches to Tissue Engineering

Experimentella metoder för att Tissue Engineering

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Beredning av Artificiell bilayers för elektrofysiologi Experiment

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Analys av geners funktion och Visualisering av Cilia-genererade vätskeflöde i Kupffer s vesikel

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Bedöma Artspecifika Bidrag Till Kraniofaciala utveckling Använda Quail-anka chimärer

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Experimentella metoder för att studera mitokondrie Lokalisering och funktion av en kärnteknisk Cell Cycle kinas, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Använda mikroflödessystem enheter för att mäta livslängd och Cellular fenotyper i Single Budding jästceller

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro och In Vivo -metoder för att fastställa tarmens epitelceller permeabilitet

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetisk-aktiverad Cell sortering strategier för att isolera och rena Synovial vätska-Derived mesenkymala stamceller från en kanin-modell

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Enkel Detektion av primär Cilier genom immunofluorescens

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...