Name: artificial intelligence approaches to assessing primary cilia
Uploaded: 2021-05-01T14:00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü R01 DK114008 tarafından NFB'ye ve Amerikan Kalp Derneği Bursu Rb'ye #18PRE34020122 finanse edildi. Nikon Software'in Rich Gruskin Genel Müdürü Melissa Bentley, Courtney Haycraft ve Teresa Mastracci'ye el yazması hakkındaki içgörülü yorumları için teşekkür ederiz.

1. Ham görüntüler elde edin
<ol><li>Gerektiğinde düzeltme ve immünoloji örnekleri20.<ol>
<li>Nyquist çözünürlüğüyle aynı piksel boyutunu kullanarak maksimum bit derinliğinde konfokal mikroskop kullanan görüntü cilia.</li>
		<li>Görüntüleri tek renkli Etiketli Görüntü Biçimi (.tif) dosyaları olarak dışa aktarma. NOT: Bu protokol, Ai modülünün özellikle NIS Elements yazılımı içinde nasıl kullanılacağını özetlemektedir. Görüntüler .nd2 dosyaları olarak alınmışsa, görüntüleri .tif dosyaları olarak dışa aktarma gerekli değildir ve kullanıcı doğrudan 2.3 adımına devam edebilir. Görüntüler farklı bir sistemde edinilmişse, NIS Elements lisansı ayrı olarak satın alınabilir ve .tif dosyalar sonraki adımlarda özetlendiği gibi dönüştürülebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Cilia'yı tanımlamak için Ai'yi eğitin
<ol><li>Eğitim veri kümesini açın.<ol>
<li>Yazılımı eğitmek ve tek bir klasörde kopyalamak için kare başına en az bir cilium içeren yaklaşık 50 örnek görüntü seçin. Bu klasör, görüntüleri açarken yazılımı yönlendirmek için kullanılır. Bu 50 kareyi tek bir ND2 belgesinde, kare başına en az bir cilium ile açın. Dosya > Al/Ver > Dosya Sırasından ND Dosyası Oluştur 'useçin.</li>
		<li>Eğitim veri kümesini içeren klasörü seçin. Bu, iletişim penceresinin ortasındaki dosyaların listesini açar. Yukarıdaki açılır menüde en az bir seçenek kullanarak dosyaların organizasyonunu el ile tanımlayın. Seçenekler çok noktalı (birden fazla maksimum projeksiyon dosyası için), Z serisi (z yığın görüntüsü için), zaman (zaman atlamalı görüntü için) ve dalga boyudur (birden çok kanaldaki dosyalar için).</li>
		<li>Seçili her seçeneğin altına karşılık gelen sayısal değerleri girin. Seçeneklerin seçilmediği her yerde Yok'u seçin. ND belgesini açmak için Dönüştür'ü tıklatın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Görüntüleri kalibre edin.<ol>
<li>Görüntünün sol alt köşesine piksel boyutunu girin: Belgeyi Piksel Boyutu > Kalibre > Sağtıklatın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cilia'yı teşhis edin.<ol>
<li>İkili Araç Çubuğu'ndaki Otomatik Algıla veya Nesne Çiz 'i kullanarak tüm açılan çerçevelerdeki tek tek siliary yapıları tam olarak izleyerek cilia'yı el ile tanımlayın. Bu, ilgi çekici nesnelere ikili maskeler çizecektir. Bu ikili dosyalar, gelecekteki deneysel görüntü analizinde piksel tabanlı özellikler üzerinde cilia'yı tanımlamak için yazılımı eğitmek için örnek nesneler olarak hizmet edecektir. nesne çizmek > İkili Araç Çubuğu > > Analiz Denetimlerini Görüntüle 'yiseçin. NOT: Yazılım, açılan çerçevelerin tümünde ikili dosyaları algılayamadığı sürece eğitime başlanmayacağından, ikili dosyaları olmayan herhangi bir çerçeveyi kaldırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ai'yi eğit.<ol>
<li>Yazılımı eğitmeye başlayın. Bu, treni Segment.ai kutusunu açacaktır. NIS.ai > Tren Segment.ai 'niseçin.</li>
		<li>Tren Segment.ai kutusunda, eğitim için kullanılacak kaynak kanalı seçin. Birden çok kanaldaki dosyalar açıksa, kaynak kanal olarak yalnızca bir kanal seçin. Ardından, Ai'nin eğitilmesi için uygun zemin gerçeği ikili dosyalarını seçin. Son olarak, ikili dosyaların boyutuna ve dağıtımına bağlı olarak Ai'yi eğitmek için gereken yineleme sayısını seçin. NOT: İkili dosyalar çevreden kolayca algılanabilir ve görüntü boyunca iyi dağıtılırsa, yazılımın görüntüleri tanımlamak için eğitilmek için 1000'den az yinelemeye ihtiyacı olabilir. Görüntüler düşük sinyal-gürültü oranına sahipse, Ai'nin test örneklerinde cilia'yı yüksek güvenle tanımlamasını sağlamak için eğitim sırasında en az 1000 yineleme çalıştırmak idealdir.</li>
		<li>Eğitilen Ai dosyasını (.sai) kaydetmek için hedef klasörü seçin ve yazılımı eğitmek için Eğit'i tıklatın. Yazılım şimdi izlenen ikili dosyalara dayanarak cilia tanımlamak için kendini eğitmeye devam edecek. Bu işlem birkaç saat sürer. NOT: Eğitim sırasında, yazılım eğitim kaybını gösteren bir grafik görüntüler. Grafik başlangıçta, eğitimin geri kalanı için platolaştığı ideal olarak% 1'lik bir kayba koniklemeden önce bir ani artış gösterecektir. Tren Segment.ai kutusunda grafiği kaydet ekran görüntüsü kutusunu işaretleyerek grafiği ileridebaşvurmaküzere kaydedin ( Ek Şekil 1 ).</li>
		<li>Eğitimde daha fazla iyileştirme gerekiyorsa, aynı veri kümesinde eğitime devam edin. Alternatif olarak, aynı parametrelere sahip yeni bir veri kümesi üzerinde eğitim. Zaten eğitilmiş bir Ai'yi farklı parametrelere veya farklı ilgi çekici nesnelere sahip yeni bir veri kümesi üzerinde eğitmeniz tavsiye edilmez. Eğit'i seçin segment.ai > Eğitime Devam > Eğitimli Ai Dosyasını Seçin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Eğitimli Ai kullanarak cilia'yı tanımlayın
<ol><li>Deneysel veri kümesini açın.<ol>
<li>Örnek .tif dosyalarını 2.1 adımına benzer şekilde .nd2 dosyalarına dönüştürerek yazılımdaki cilia'nın deneysel konfokal görüntülerini açın. Dosya > Al/Ver > Dosya Sırasından ND Dosyası Oluştur 'useçin. NOT: Görüntüler, Ai'yi eğitmek için kullanılan piksel boyutunda olmalıdır. Görüntüler zaten ND2 biçimindeyse, 3.3 adımına atlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Görüntüleri kalibre edin.<ol>
<li>Görüntünün sol alt köşesine piksel boyutunu girin. Belgeyi Piksel Boyutu > Kalibre > Ayarlanmamış 'ısağ tıklatın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Açılan dosyalarda eğitilmiş Ai'yi çalıştırın.<ol>
<li>Ai kullanarak cilia tanımlamaya başlayın. Yazılım şimdi önceki adımda aldığı eğitime dayanarak cilia üzerinde ikili dosyalar çizecek. Bu işlem birkaç saniye sürecektir. NIS.ai > Segment.aiseçin. NOT: Birden fazla kanal açıksa yazılım kanalı seçmesini ister. Kanallar burada kendi adlarıyla listelenir. Değilse, 'Mono' işaretli kutu otomatik olarak seçilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yanlış tanımlamalı ikili dosyalar için görüntüleri denetleyin.<ol>
<li>Ai cilia'yı tanımladıktan ve ikili dosyalar çizdikten sonra, yanlışlıkla tanımlanan nesneler için görüntüleri kontrol edin. İsterseniz, yanlış tanımlamalı ikili dosyaları el ile silin. Nesneyi Sil > İkili Araç Çubuğu > > Çözümleme Denetimlerini Görüntüle 'yiseçin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Cilia uzunluğu ve yoğunluğunun ölçülmesi
<ol><li>Yeni bir Genel Analiz 3 (GA3) tarifi oluşturun.<ol>
<li>Şimdi cilia tanımlandı ve segmentlere, GA3 aracını kullanarak uzunluklar ve yoğunluklar gibi farklı cilia parametrelerini analiz etmeye devam edin. Bu, analizin tanımlanacağı merkezde boş bir alan içeren yeni bir pencere açacaktır. Resim > Yeni GA3 Tarifi 'niseçin. 
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çözümlemek için ikili dosyaları seçin.<ol>
<li>Cilia zaten Segment.ai kullanılarak segmentlere ayrıştırıldığından, GA3 Ai'ye göre uygun şekilde etiketlenmiş ikili dosyaları otomatik olarak algılar ve düğümü içerir. 'İkiliDosyalar > Otomatik Detect_AI' veya 'İkili Dosyalar > Object_AI Çiz' seçeneğini belirleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analiz için gereken kanalları seçin. GA3 ayrıca görüntülerdeki kanalları otomatik olarak algılar ve sekmelerini Kanallaraltında görüntüler.</li>
	<li>Çerçevenin kenarlık kısmına dokunan nesneleri kaldırın.<ol>
<li>Ai, çerçevedeki nesneler gibi tüm cilia'yı segmentlere ayıracağından, çerçevenin kenarları boyunca tamamlanmamış cilia'yı da algılayacaktır. Bu nesneler adım 3.4'te el ile kaldırılabilir veya GA3'te otomatik olarak kaldırılabilir. İkili İşleme'yi seçin > Kenarlıklara Dokunan nesneler > kaldırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cilia'yı ölçmek için parametreleri seçin.<ol>
<li>Cilia uzunluğu (Uzunluk) ve yoğunluklar (Toplam Nesne Yoğunluğu) gibi ölçüm için parametreleri sürükleyip bırakın. Düğümleri uygun ikili düğüme (bağlantı A) ve kanal düğümlerine (B bağlantısı) bağlayın. Düğümün hangi bağlantıya ait olduğunu göstermek için araç ipucu için düğüm bağlantısının üzerine gelin. Nesne Boyutu > Uzunluğu > Ölçüm'> ve Nesne Yoğunluğunu Toplam Toplam Yoğunluğu > Ölçü'leriseçin. NOT: Düğüm Uzunluğu yalnızca ikili düğüme bağlanırken, Toplam Obj Yoğunluğu hem ikili hem de kanal düğümlerine bağlanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ölçümleri tek bir tabloya ekle.<ol>
<li>Düğüm Ekleme Sütununu analiz akış grafiğine sürükleyip bırakarak tüm ölçümleri tek bir çıktı tablosunda birleştirin ve ölçüm düğümlerine, Uzunluk ve Toplam Obj Yoğunluğunabağlayın. Temel > Ekleme Sütunu > Veri Yönetimi 'niseçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cilia'yı ölçün.<ol>
<li>Çalıştır'ı tıklatarak cilia'yı ölçün. Bu işlem, deneysel görüntülerdeki tüm cilia'yı ölçmek için birkaç dakika sürer. Uzunluklar ve yoğunluklar yeni bir Analiz Sonuçları penceresinde görünür. NOT: Tablo bazen Ai'nin cilia olarak tanıdığı ancak insan gözüyle tespit edilemeyecek kadar küçük olan ve 3.4. Bu nesneler istatistiksel çözümlemeden önce bir filtre kullanılarak veri kümesinden kaldırılabilir. Burada Şekil 2'de in vitro cilia uzunluk ölçümleri için 1 μm, in vivo cilia için 2 μm filtre kullanılmıştır. Bu, aşağıdaki yolu kullanarak veri dışa aktarmadan önce yapılabilir. Analiz Sonuçları penceresini seçin > Filtre tanımlayın > Filtreyi > Girin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İstatistiksel analiz için verileri dışa aktar.</li>
</ol>5. Kolokalizasyon çalışmaları
NOT: Kolikalizasyon analizi, cilia uzunluğu ve yoğunluk analizi ölçümleri için kullanılan aynı GA3 tarifine dahil edilebilir. Aynı tarifi kullanıyorsanız, dosyaları aşağıda açıklandığı gibi açın ve aynı analiz işlem hattındaki colocalization katsayılarıyla birlikte her iki kanalın uzunluklarını ve yoğunluklarını ölçün.
<ol><li>Deneysel veri kümesini açın.<ol>
<li>Örnek .tif dosyalarını .nd2 dosyalarına dönüştürerek yazılımdaki cilia'nın deneysel konfokal görüntülerini açın. Dosya > Al/Ver > Dosya Sırasından ND Dosyası Oluştur 'useçin.</li>
		<li>Açılır pencerede, açılır pencerenin ilk sütununda bulunan pencere gezgininden tüm ilgi çekici kanallardan 16 bit derinlik tek renkli dosyaları seçin. İlk açılan menüden Multipoint veya Z Serisi'ni seçin ve sırasıyla toplam görüntü veya yığın sayısına karşılık gelen bir değer girin.</li>
		<li>İkinci açılan kutuda Dalga Boyu'nu seçin ve değeri klasördeki toplam kanal sayısına değiştirin. Yazılım, açılır pencerenin sağ alt ucunda bulunan bir Dalga Boyu seçim penceresinin kilidini otomatik olarak açar. Her kanalın rengini seçmek için Renk açılır menüsünü kullanın. Ad sütununun altında her kanala farklı bir ad sağlayın. Tüm bilgiler güncelleştirildikten sonra Dönüştür 'ütıklatın. Yazılım otomatik olarak tüm seçilen kanallardan tüm tek tek görüntülerle üst üste bindirilmiş bir Tüm görüntü dosyası oluşturur.</li>
	</ol></li>
	<li>Görüntüleri kalibre edin.<ol>
<li>Görüntünün sol alt köşesine piksel boyutunu girin. Belgeyi Piksel Boyutu > Kalibre > Ayarlanmamış 'ısağ tıklatın.</li>
	</ol></li>
	<li>Eğitimli Ai'yi ilk kanaldan çalıştırın.<ol>
<li>Açılan kanallardan birinde (örneğin, ACIII; Şekil 5A) Ai kullanarak. Yazılım artık bu kanal için aldığı eğitime dayanarak ACIII etiketli cilia üzerine ikili dosyalar çizecek. Bu işlem birkaç saniye sürecektir. ACIII > NIS.ai > Segment.ai > Kaynak kanallarınıseçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Eğitimli Ai'yi ikinci kanalda çalıştır.<ol>
<li>Diğer açılan kanalda (örneğin, MCHR1; Şekil 5B) Ai kullanarak. Yazılım şimdi bu kanal için aldığı eğitime dayanarak MCHR1 etiketli cilia'ya ikili dosyalar çizecek. Bu işlem birkaç dakika sürecektir. MCHR1 > NIS.ai > Segment.ai > Kaynak kanallarınıseçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Yanlış tanımlamalı ikili dosyalar için görüntüleri denetleyin.<ol>
<li>Ai cilia'yı tanımladıktan ve ikili dosyalar çizdikten sonra, yanlış tanımlanmış nesneler için görüntüleri kontrol edin. Gerekirse yanlış tanımlamalı ikili dosyaları el ile silin. Nesneyi Sil > İkili Araç Çubuğu > > Çözümleme Denetimlerini Görüntüle 'yiseçin.
</li>
	</ol></li>
	<li>Yeni GA3 tarifi oluşturun.<ol>
<li>Şimdi cilia tanımlandı ve segmentlere, GA3 aracını kullanarak kolokalizasyon analizine devam edin. Bu, analizin tanımlanacağı merkezde boş bir alan içeren yeni bir pencere açacaktır. Tanımlanan tüm ikili dosyaların ve kanalların yer alacağı bir pencere oluşturulur. Analiz için gereken tüm istenen kanalların ve ikili dosyaların mevcut ve seçili olduğunu doğrulayın. Resim > Yeni GA3 Tarifi 'niseçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Çerçevenin kenarlık kısmına dokunan nesneleri kaldırın.<ol>
<li>Ai, çerçevedeki tüm cilia benzeri nesneleri segmentlere ayıracağından, çerçevenin kenarları boyunca tamamlanmamış cilia'yı da algılayacaktır. Bu nesneler adım 5.5'te el ile kaldırılabilir veya GA3'te otomatik olarak kaldırılabilir. İkili İşleme'yi seçin > Kenarlıklara Dokunma > nesneleri kaldırın.
</li>
	</ol></li>
	<li>GA3'te kolokalizasyon yolunu kurun.<ol>
<li>Cilia içindeki iki kanalın çakışmasını ölçmek için Mander'in Katsayı Korelasyonunu kullanın. Manders Katsayı düğümünü GA3 tarifinin boş alanına sürükleyip bırakın ve uygun ikili ve kanallara bağlayın. Burada ,'connection A', ACIII ikilisi içinde MCHR1'in çakışmasını belirlemek için ACIII ikilisine, MCHR1 kanalıyla 'B bağlantısına' ve ACIII kanalına 'C bağlantısına' bağlanır. Manders Katsayısı > Ölçüm > Nesne OranMetrisi 'niseçin. NOT: Yazılım, bu protokolde açıklandığı adımları kullanarak Pearson Katsayı Korelasyonunu kullanarak kolokalizasyonun ölçülmesine izin verir40.</li>
	</ol></li>
	<li>Ölçümleri tek bir tabloya ekle.<ol>
<li>Tüm ölçümleri tek bir çıktı tablosunda birleştirin. Temel > Ekleme Sütunu > Veri Yönetimi 'niseçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Kolokalizasyonu ölçün.<ol>
<li>Çalıştır'ı tıklatarak cilia'yı ölçün. Bu işlem, deneysel görüntülerdeki tüm cilia'yı ölçmek için birkaç dakika sürer. Veriler yeni bir Analiz Sonuçları penceresinde görünecektir.</li>
	</ol></li>
	<li>İstatistiksel analiz için verileri dışa aktar.</li>
</ol>

Ortak yazar Wesley Lewis Nikon'un bir çalışanıdır. Herhangi bir finansal açıklama yoktur.

Uzunluk ve yoğunluk ölçümleri birincil cilia'nın analiz edildiği yaygın yollardır, ancak alanda kullanılan standartlaştırılmış bir geleneksel yöntem yoktur. ImageJ gibi yazılımlar kullanılarak birincil cilia'nın tanımlanması ve ölçülmesi zaman alıcıdır ve kullanıcı önyargısına ve hatasına eğilimlidir. Bu, büyük veri kümelerini doğru bir şekilde analiz etmeyi zorlaştırır. Burada, bir Ai programı kullanmanın, birincil cilia'nın yüksek verim analizini ulaşılabilir hale getiren bu zorlukların çoğunun üstesinden gelebileceğini gösteriyoruz. Burada, birincil cilia'yı tanımak ve uzunluğu ve yoğunluğu analiz etmek için gereken adımları özetlemek için Ai tabanlı bir uygulamayı eğitme prosedürünü açıklıyoruz.
Ai'nin cilia'yı tanımak için ilk eğitimi kullanıcıdan önemli bir zaman gerektirirken, tamamlandığında aynı parametrelerle elde edilen herhangi bir veri kümesinde kullanılabilir. Ai tarafından oluşturulan ikili maske, herhangi bir hatanın düzeltilebileceği şekilde değiştirilebilir. Bununla birlikte, cilia tanımlamadaki hatalar kullanıcıya Ai'nin ek görüntülerle daha fazla eğitilmesi gerektiğini işaret etmelidir. Bu yöntemin en büyük avantajlarından biri, Ai'nin hem 2D hem de 3D olarak farklı örnek türlerinde cilia'yı tanımak için eğitilebilmesidir. Laboratuvarlarda oluşturulan önceki analiz yöntemleri, hücre yoğunluğunun yüksek olduğu doku bölümlerinden görüntülenen cilia'yı tanımlamak için manuel eşikleme ve problemler dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalara sahiptir36,46,47. Nis Elements yazılımı kullanılarak yapılan analizler görüntülerin çeşitli yönlerini aynı anda değerlendirebilirken, bu yöntemler cilia analizi için de uzmanlaşmıştır. Burada açıklanan Ai, NIS Elements yazılım paketinin bir parçası olduğundan, Nikon mikroskobu kullanılarak elde edilen görüntüler analize kolayca devam edilebilir. Ancak, bu yöntemin kullanımı için Nikon ile görüntüleme gerekli değildir. Yakalanan ham veri dosyası biçiminden bağımsız olarak, ".tif" dosyaları Ai'de kullanmak için NIS Elements tarafından açılabilir.
NIS Elements içindeki bu Ai uygulaması yaygın olarak mevcuttur ve muhtemelen birincil cilia'yı inceleyen laboratuvarlar tarafından kullanılan görüntü analizi yazılımının bir parçasıdır. Ai teknolojisinin yaygınlığı genişlerken, diğer görüntüleme yazılımları analiz seçeneklerini benzer bir Ai modülünü içerecek şekilde genişletebilir. Cilia tanımlamasına Ai analizi uygulamak, cilia analizinin birkaç farklı yönü için kullanılabilir. Uzunluk (Şekil 2 ve 3 ), yoğunluk ( Şekil 4) ve kolokalizasyon (Şekil 5) gibi birkaç basit analiz için yöntemleri özetlerken, GA3 analiz iş akışına Şekil 6'daolduğu gibi daha sofistike analizler eklenebilir. Örneğin, tam bir siliyumun yoğunluğunu ölçmek yerine, bir siliyumun bir alt bölgesindeki yoğunluk farklılıkları, sub-siliary lokalizasyonunu değerlendirmek için ilgi çekici olabilir. Bir sicim alt bölgesinde yoğunluktaki farklılıklar, gli proteinlerinin cilia48'inucunda nasıl zenginleştirilmesi gibi, proteinin siciumun ucunda veya tabanında biriktiğini gösterebilir. Ek olarak, bu Ai uygulaması genotipler veya tedavi grupları arasındaki farklılıkları kolayca tanımlamak için kullanılabilir. Laboratuvarımız öncelikle beyin bölümlerinden veya nöronal kültürlerden alınan cilia'yı analiz etmek için bu yöntemi kullanırken, çeşitli hücre çizgilerinden veya diğer doku türlerinden elde edilen görüntülere uygulanabilir. Bu uygulamanın kullanılabileceği örnek türünün esnekliği, bu analiz yöntemini birincil cilia veya mitokondri, çekirdek veya ER gibi değerlendirilen herhangi bir ayrı organel üzerinde çalışan birçok farklı grup için değerli kılar.

Birincil cilia, çoğu memeli hücre tipi 1 , 2,3,4'tençıkıntılı duyusal organellerdir. Genellikle hücre dışı sinyalleri entegre ederek çeşitli hücre sinyal yollarını koordine etmek için kritik olan yalnız ekler5,6,7. Primer cilia embriyonik gelişim ve erişkin doku homeostazı sırasında önemli roller oynar ve işlevlerinin veya morfolojilerinin bozulması, toplu olarak ciliopatiler olarak adlandırılan çeşitli genetik bozukluklarla ilişkilidir. Cilia'nın neredeyse her yerde bulunan doğası nedeniyle, ciliopatiler tüm organ sistemlerini etkileyebilecek çok çeşitli klinik özelliklerle ilişkilidir 8,9,10,11,12. Ciliopatilerin hayvan modellerinde, silier yapı kaybı veya sinyal kapasitesi, hiperfaji ile ilişkili obezite 3,13,14,15dahil olmak üzere klinik olarak ilgili çeşitli fenotiplerde kendini gösterir. Birçok model sisteminde, cilia uzunluk değişikliklerinin sinyal kapasitelerini ve işlevlerini etkilediği gösterilmiştir16,17,18,19. Bununla birlikte, cilia uzunluğu ve bileşimini doğru ve tekrar tekrar değerlendirmekle ilişkili birkaç zaman alıcı ve teknik zorluk vardır.
Yetişkin memeli merkezi sinir sistemi (CNS), cilia morfolojisini ve işlevini anlamak için bir zorluk oluşturan biyolojik bir bağlamdır. CNS'deki nöronların ve hücrelerin cilia'ya sahip olduğu görünse de, bu cilia'yı gözlemlemek ve analiz etmek için sınırlı araçlar ve yetenekler nedeniyle işlevlerinin anlaşılması zor kalır20. Örneğin, asetillenmiş α-tubulin olan prototipik cilia işaretleyicisi nöronal cilia20'yi etiketlemez. Bu cilia'yı incelemenin zorluğu, nöronal cilia21,22membranında zenginleştirilmiş birkaç G protein bağlantılı reseptör (GPCR), sinyal makineleri ve membran ilişkili proteinlerin keşfi ile kısmen çözüldü. Tüm bu basit temel gözlemler, şimdiye kadar diğer dokular tarafından benzersiz görünen CNS cilia'nın önemine ve çeşitliliğine işaret ediyor. Örneğin, cilia uzunluğu ve GPCR lokalizasyonundaki varyasyon beyin boyunca gözlenebilir, bazı nöronal çekirdeklerdeki uzunluklar diğer çekirdeklerle karşılaştırıldığında farklıdır19,23. Benzer şekilde, GPCR içeriği ve sinyal makineleri iltifatı nöroanatomik konuma ve nöroanal tip 2,24,25,26,27,28,29'agöre çeşitlilik gösterir. Bu basit gözlemler, memeli CNS cilia uzunluğunun ve bileşiminin, Chlamydomonas reinhardtiigibi model organizmalarda olduğu gibi sıkı bir şekilde düzenlendiğini göstermektedir, ancak bu uzunluk farklılıklarının cilia işlevi, sinyalizasyon ve nihayetinde davranış üzerindeki etkisi belirsizliğini korumaktadır16,30,31,32.
Cilia uzunluğu ve bileşiminin doğru bir şekilde ölçülmesi, kullanıcı hatasına ve geri alınamazlığa eğilimli teknik bir zorluk olduğunu kanıtlamaktadır. Şu anda cilia in vivo ve in vitro en sık silier proteinleri veya cilia ile zenginleştirilmiş floresan muhabir alellerini etiketleyen immünofluoresan yaklaşımlar kullanılarak tanımlanır33,34,35. Floresan olarak etiketlenen bu cilia'nın uzunlukları daha sonra ImageJ 36 gibi görüntü analiz programlarında çizgi ölçüm araçları kullanılarak 2 boyutlu (2D) bir görüntüdenölçülür. Bu süreç sadece sıkıcı ve emek yoğun değil, aynı zamanda önyargı ve hataya da eğilimlidir. Bu aynı engeller, cilia yapısındaki değişiklikleri göstermeye yardımcı olan cilia yoğunluklarını ölçerken ortaya çıkar37. Bu tür görüntü analizlerindeki tutarsızlıkları en aza indirmek için, yapay zeka (Ai) programları daha yaygın ve uygun fiyatlı seçenekler haline geliyor38.
Ai, genellikle insan zekası gerektiren görevleri yürütmek için bilgisayar algoritmalarının ve programlamanın avantajını kullanan bilgisayar sistemlerininilerlemesidir 39. Ai cihazlarına yinelenen kalıpları, parametreleri ve özellikleri algılamaları ve başarılı sonuçlar yaratma olasılığını en üst düzeye çıkarmak için eylemlerde bulunanlar öğretilir. Ai çok yönlüdür ve cilia gibi belirli nesneleri veya ilgi çekici yapıları tanımak için eğitilebilir ve daha sonra tanımlanan nesneler üzerinde çeşitli analizler yapmak üzere programlanabilir. Bu nedenle, karmaşık görüntü verileri Ai38tarafından hızlı ve tekrarlanabilir . Yakalanan görüntülerin otomasyonu ve Ai analizi, herhangi bir potansiyel insan hatasını ve önyargısını sınırlarken etkinliği ve verimliliği artıracaktır39. Cilia tanımlaması için Ai tabanlı bir metodoloji oluşturmak, tüm araştırma gruplarının cilia verilerini analiz etmesi ve yorumlaması için tutarlı bir yol oluşturur.
Burada, 2D görüntülerde hem in vivo hem de in vitro cilia'yı tanımlamak için bir Ai modülü kullanıyoruz. Bir dizi örnek görüntü kullanan Ai, cilia'yı tanımlamak için eğitilir. Eğitim tamamlandıktan sonra, belirlenen Ai, bir görüntüde Ai tanımlanan cilia üzerine ikili maske uygulamak için kullanılır. Ai tarafından uygulanan ikili dosyalar, gerekirse görüntülerdeki tüm cilia'nın düzgün bir şekilde tanımlanmasını ve spesifik olmayan tanımlamanın ortadan kaldırılmasını sağlamak için değiştirilebilir. Cilia'yı tanımlamak için Ai'yi kullandıktan sonra, cilia uzunluğu ve floresan yoğunluğunu ölçmek gibi farklı analizleri gerçekleştirmek için özel olarak oluşturulmuş genel analiz (GA) programları kullanılır. Toplanan veriler kolayca okunabilen, yorumlanabilen ve istatistiksel analizler için kullanılabilecek bir tabloya dışa aktarılıyor (Şekil 1). Cilia'yı tanımlamak ve deneysel gruplar arasında belirli ölçümler elde etmek için otomatik teknoloji ve Ai'nin kullanılması, CNS cilia fonksiyonu ve morfolojisinin hücre-hücre iletişimi ve davranışı üzerindeki etkisini anlamaya yönelik gelecekteki çalışmalarda yardımcı olacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Intel Xeon, 3.6 GHz, 32GB RAM</td>
			<td>Intel Corporation</td>
			<td>W-2123</td>
			<td>Processor used for running NIS Elements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements Software</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Ai and GA3 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadro RTX 4000 Graphics card</td>
			<td>NVIDIA Corporation</td>
			<td>Quadro RTX 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows 10 Professional 64-bit</td>
			<td>Microsoft Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Operating system used for running NIS Elements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Workstation</td>
			<td>HP Development Company, L.P.</td>
			<td>HP&#160;Z4G4</td>
			<td>Workstation used for running NIS Elements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

artificial intelligence approaches to assessing primary cilia

Cilia, birçok memeli hücre tipinde sinyal yolları çeşitliliği için sinyal merkezleri olarak işlev gösteren mikrotübül bazlı hücresel uzantılardır. Cilia uzunluğu yüksek oranda korunmuş, sıkı bir şekilde düzenlenmiştir ve farklı hücre tipleri ve dokular arasında değişir ve sinyal kapasitelerini doğrudan etkilemede suçlanmıştır. Örneğin, cilia'nın silier G protein bağlantılı reseptörlerin aktivasyonuna yanıt olarak uzunluklarını değiştirdiği gösterilmiştir. Bununla birlikte, çok sayıda cilia'nın uzunluklarını doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçmek zaman alıcı ve emek yoğun bir prosedürdür. Mevcut yaklaşımlar da hata ve önyargıya eğilimlidir. Yapay zeka (Ai) programları, kapsamlı veri kümelerinin asimilasyonuna, manipülasyonuna ve optimizasyonuna izin veren yetenekler nedeniyle bu zorlukların çoğunun üstesinden gelmek için kullanılabilir. Burada, bir Ai modülün hem in vivo hem de in vitro örneklerden görüntülerdeki cilia'yı tanımak için eğitilebileceğini gösteriyoruz. Cilia'yı tanımlamak için eğitilmiş Ai'yi kullandıktan sonra, uzunluk, floresan yoğunluğu ve birlikte lokalizasyon için yüzlerce cilia'yı tek bir örnekte analiz eden uygulamalar tasarlayabilir ve hızla kullanabiliriz. Bu tarafsız yaklaşım, farklı primer nöronal preps in vitro'dan ve bir hayvan içindeki ve hayvanlar arasındaki farklı beyin bölgelerinden örnekleri karşılaştırırken güvenimizi ve katılığımızı artırdı. Ayrıca, bu teknik, herhangi bir hücre tipinden ve dokudan cilia dinamiklerini birden fazla örnek ve tedavi grubunda yüksek verimli bir şekilde güvenilir bir şekilde analiz etmek için kullanılabilir. Sonuç olarak, çoğu alan görüntü alma ve analiz için daha az önyargılı ve daha tekrarlanabilir yaklaşımlara doğru ilerledikçe yapay zeka tabanlı yaklaşımlar büyük olasılıkla standart hale gelecektir.

Watch this Scientific Journal Video about Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia at JoVE.com

Artificial Intelligence Approaches to Assessing Primary Cilia

Görüntüleri analiz etmek için yapay zekanın (Ai) kullanımı, yaygın olarak kullanılan yöntemlere kıyasla güçlü, daha az önyargılı ve hızlı bir yaklaşım olarak ortaya çıkıyor. Burada Ai'yi hücresel bir organel, birincil cilia'yı tanıması ve uzunluk ve lekelenme yoğunluğu gibi özellikleri titiz ve tekrarlanabilir bir şekilde analiz etmesi için eğitdik.

Birincil Cilia'yı Değerlendirmede Yapay Zeka Yaklaşımları

Cilia are microtubule based cellular appendages that function as signaling centers for a diversity of signaling pathways in many mammalian cell types. ...

Mevcut cilia analizi yöntemleri emek yoğundur ve hataya ve önyargıya eğilimlidir. Yaklaşımımız, olası hataları azaltırken zaman ve çabayı kolaylaştırmayı amaçlamaktadır. Bu tekniğin sunduğu temel avantaj, artan titizlik ve tekrarlanabilirlik ve nicel görüntü analizidir.Bu tür bir yaklaşım sadece cilia analizi ile ilgili değildir, aynı zamanda diğer organeller ve sitoskeletal proteinlerle ilgilenenler de dahil olmak üzere birçok hücre biyolojik sorusuna geniş ölçüde uygulanabilir. Başlamak için, eğitim veri kümesini açın, menüden dosyayı seçin, dışa aktar'ı tıklatın ve dosya sırasından ND dosyası oluştur'u seçin. Eğitim veri kümesini içeren klasörü seçtiğinizde, dosya listesi iletişim penceresinin ortasında açılır.Açılan menüde en az bir seçenek kullanarak dosyaların organizasyonunu el ile tanımlayın. Seçilen her seçeneğin altına karşılık gelen sayısal değerleri girin ve seçeneklerin seçilmediği her yerde hiçbiri'ni seçin. ND belgesini açmak için dönüştür'ü tıklatın.Görüntüyü kalibre etmek için görüntünün sol alt köşesindeki ayarlanmamış seçeneğe sağ tıklayın. Belgeyi kalibre edin'i tıklatın, sonra piksel boyutunu tıklatın, değeri girin ve Tamam'ı tıklatın. Görünüm analizi denetimlerini seçin, ikili araç çubuğunu açın ve açılan tüm çerçevelerdeki tek tek siliary yapıları hassas bir şekilde izleyerek cilia'yı elle tanımlamak için nesneyi otomatik algıla veya çiz'i seçin.Yapay zekayı eğitmek için nis'i seçin. ai, tren segmenti tıklayın. ai tren segmentini açmak için.ve ardından eğitim için kullanılacak kaynak kanalı seçin. Yapay zekayı eğitmek için uygun GroundTruth ikili dosyalarını seçin. İkili boyuta ve dağıtıma bağlı olarak yapay zekayı eğitmek için gerekli yineleme sayısını seçin, ardından eğitilen AI dosyasını kaydetmek için hedef klasörü seçin ve yazılımı eğitmek için tren'i tıklatın. Bu işlem birkaç saat sürer.Örneği dönüştürerek daha önce açıklandığı gibi cilia'nın deneysel konfokal görüntülerini açın. TIF dosyalarını ND2 dosyalarına. Açılır pencerede, ilk açılır menüden çok nokta seçin ve görüntülerin toplam sayısına karşılık gelen bir değer girin.İkinci açılan kutuda dalga boylarını seçin ve değeri klasördeki kanalların toplam sayısına değiştirin. Yazılım, açılır pencerenin sağ alt kısmında bulunan bir dalga boyu seçim penceresinin kilidini otomatik olarak açar. Dalga boyu seçim penceresinde, her kanalın rengini seçmek için renk açılır menüsünü kullanın.Her kanala ad sütunu altında farklı bir ad sağlayın. Tüm bilgiler güncelleştirildikten sonra dönüştür'ü tıklatın. Görüntüleri daha önce açıklandığı gibi kalibre edin.Deneysel veri kümesinin piksel boyutunun eğitim veri kümesininkiyle tutarlı olduğundan emin olun. Önceki adımdaki eğitilmiş yapay zekayı kullanarak ilk kanalda cilia'yı tanımlayın. Niş'i açın.menüden ai, segmenti seçin. ai, ardından kaynak kanallarda AC3'ü seçin. Ardından kaynak kanallarda MCHR1'i seçerek ikinci kanaldaki cilia'yı tanımlayın.Yazılım etiketli cilia üzerinde ikili çizecektir. Daha sonra yanlış tanımlamalı ikili dosyalar için görüntüleri kontrol edin. Yanlış tanımlamalı ikili dosyaları el ile silmek için ikili araç çubuğunda nesneyi sil'i seçin.Cilia belirlendikten ve segmentlere ayrıldığında, genel analiz üç aracını kullanarak uzunluklar ve yoğunluklar gibi farklı cilia parametrelerini analiz edin. Menüden görüntüyü seçin ve yeni GA3 tarifine tıklayın. Merkezde boş alan bulunan yeni bir pencere açılacaktır.GA3, yapay zekaya göre uygun şekilde etiketlenmiş ikili dosyaları otomatik olarak algılar ve ilgili düğümü içerir. GA3 ayrıca görüntülerdeki kanalları otomatik olarak algılar ve sekmelerini kanalların altında görüntüler. Yapay zeka, çerçevedeki nesneler gibi tüm cilia'ları segmentlere ayıracak ve çerçevenin kenarları boyunca tamamlanmamış cilia'yı algılayacak.Bunları kaldırmak için ikili işlemeyi seçin, nesneleri kaldırın ve sonra dokunan kenarlıklar düğümünü boş alana sürükleyin ve düğümü uygun ikili dosyalara bağlayın. Cilia uzunluğunu ölçmek için ölçüm nesnesi boyutunu ve ardından uzunluğu seçin. Parametreyi merkeze sürükleyip bırakın ve uygun ikili düğüme bağlanın.Cilia yoğunluklarını ölçmek için bazı nesne yoğunluğu seçin. Parametreyi merkeze sürükleyip bırakın ve uygun ikili düğüme ve ilgi alanı kanalına bağlanın. Ölçüm menüsünde, nesne oranmetrisine gidin ve tek tek cilia içindeki iki kanalın çakışmasını ölçerek GA3'teki colocalization yolunu ayarlamak için Mander'in katsayısını seçin.Mander'ın katsayı düğümünü boş alana sürükleyip bırakın ve uygun ikili ve kanallara bağlayın. Veri yönetimi menüsünü açarak ölçümleri ve tek tabloyu seçin. Temel kategoride, ApEn sütununu seçin ve sonra cilia'yı ölçmek için Şimdi çalıştır'ı tıklatın.Tüm ölçümler tek bir çıktı tablosunda görünecektir. Temsili görüntüler, eğitimli yapay zekanın IMCD hücrelerinin, birincil hipotalamik kültürlerin ve hipokampal kültürlerin görüntülerinde cilia in vitro'yu doğru bir şekilde tanımladığını, ancak sitokintik köprüler gibi başka siliyer olmayan yapıların olmadığını göstermektedir. Cilia'nın uzunluğu IMCD hücrelerinde 0,5 ila 4,5 mikrometre, hipotalamik ve hipokampal kültürde ise iki ila 12 mikrometre arasında değişmektedir.Yapay zeka, arcuate çekirdeğimiz, paraventriküler çekirdeğimiz ve cornu ammonis bir bölgemizin görüntülerinde AC3 etiketli cilia in vivo uzunluklarını ölçtü. Analize göre, hipotalamik cilia in vivo, beyaz ve kahverengi çubuklarda görüldüğü gibi bir ila 15 mikrometre arasında değişiyordu. Cilia ve cornu ammonis bölgesi gri çubuklarda görüldüğü gibi bir ila 10 mikrometre arasında değişmektedir.İlginçtir ki, siliary MCHR1'in yoğunluğu paraventriküler çekirdekte, arcuate çekirdeğindekinden daha güçlüydü. MCHR1'in AC3'e karşı yoğunlukları çakışmalarını ölçmek için çizildi. Cilia'nın çoğunluğu her iki belirteç için de pozitifken, bazı cilialar AC3 veya MCHR1 için pozitifti.MTHR1'in AC3 içindeki kolokalizasyonunu ölçmek için Mander'in örtüşme katsayısı ölçüldü ve paraventriküler çekirdekteki örtüşmede arcuate çekirdeğine göre önemli bir artış oldu. Cilia uzunluğu boyunca yoğunluğu ölçmek için, bazal gövde işaretleyicisi olarak Centrin2-GFP kullanılarak cilia polaritesi tanımlanmıştır. Bu, cilia tabanını ARL13B-M kiraz pozitif cilia'nın uçlarından ayırt etmeye izin etti.Cilia uzunluğu boyunca ARL13B yoğunluğundaki değişiklikler, ARL13B yoğunluğunun tabanda, sağda görüldüğü gibi solda ve PVN'de görülen arcuate çekirdeğindeki ssiyumun ucundan daha yüksek olduğu gözlendi. Bu yaklaşımla verileri analiz ederken, deneysel veri kümesinin kalitesinin ve çözünürlüğünün yapay zekayı eğitmek için kullanılanlarla tutarlı olduğundan emin olmak önemlidir. Bu yaklaşımın ana faydası, cilia'yı yapay zeka tarafından algıladıktan sonra, kullanıcı yazılıma entegre analiz iş akışını özelleştirerek hangi özelliklerin analiz edildiği konusunda yaratıcı olabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

Farelerin Hasat Sperm ve Suni Tohumlama

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals.  Peromyscus species are used in a wide range of research ...

Experimental Approaches to Tissue Engineering

Doku Mühendisliği Deneysel Yaklaşımlar

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Elektrofizyoloji Deneyler Yapay Bilayers hazırlanması

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Kupffer en veziküllü Gen Fonksiyonu ve Cilia Oluşturulan Akışkanın Görselleştirme Analizi

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Bıldırcın-ördek Chimeras kullanma Kraniyofasiyal Kalkınma için Türlere özgü Katılımlar değerlendirilmesi

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Deneysel Yaklaşımlar Mitokondriyal Yerelleşme ve Nükleer Hücre Döngüsü Kinaz, Cdk1 Fonksiyonu Eğitim için

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Mikroakışkan Aygıtlar Kullanma Tek Budding Maya Hücreleri ömrü ve Hücresel fenotipleri Ölçmek için

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Vitro ve In Vivo yaklaşımlar Bağırsak epitel hücre geçirgenliği belirlemek için

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Manyetik aktif hücre stratejileri yalıtmak ve Sinovyal sıvı elde edilen mezenkimal kök hücre bir tavşan modelinden arındırmak için sıralama

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

İmmünfluoresan siyon ile Primer Silya'nın Basit Tespiti

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...