Name: simple in-house ultra-high performance capillary column manufacturing with the flashpack approach
Uploaded: 2021-12-04T14:00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach at JoVE.com

Het werk werd ondersteund door RSF-subsidie 20-14-00121. De auteurs danken P. V. Shliaha (Memorial Sloan Kettering Cancer Center) voor vruchtbare discussies.

Het verpakkingsprotocol bestaat uit vijf stappen(figuur 1): 1)Pakstationvoorbereiding, 2) capillaire bereiding, 3) sorptiemiddeldrijfmestbereiding, 4) capillaire verpakking in de drukbom en 5) kolomverpakking in het HPLC-systeem, snijden tot de grootte en UHPLC-verbindingsinstallatie. De FlashPack-optimalisatie vereist aanpassingen in secties 3 en 4 in vergelijking met het gemeenschappelijke protocol.
1. Montage van pakstations
<ol><li>Bereid een gastank gevuld met stikstof, helium of argon voor, voorzien van een eentraps gasregelaar met een uitlaatdruk > 50 bar. De maximale druk wordt beperkt door de compatibiliteit van de drukbom.</li>
	<li>Sluit de regelaar aan op de ontluchtingsklep van de drukbom.</li>
	<li>Als de drukbom niet is uitgerust met een geïntegreerde magneetroerder, plaats de bom dan op een magneetroerder.</li>
	<li>Sluit een smalle ID-kunststofbuis (bijv. 0,13 mm) aan op de ontluchtingsuitlaat van de drukbom en plaats deze in een vat met water.</li>
</ol>2. Capillaire bereiding
<ol><li>Bereid een gefrituurd capillair met een geïntegreerde glazen frit gevormd uit Kasil en formamide15 of een getrokken emitter capillair bereid door een lasertrekker16. Het capillair is 10-15 cm langer gemaakt dan de beoogde kolomlengte. OPMERKING: Zie tabel 1 voor de bespreking van mogelijke problemen in verband met verschillende capillaire maten en frittypen. Tabel 2 bevat een voorbeeld van een P2000 laser puller programma voor het maken van pulled-emitter capillairen.</li>
	<li>Bescherm een getrokken emitteruiteinde met een gesneden pipetpunt met gelbelasting.<ol>
<li>Knip de punt zo dat deze strak om het 360 μm OD-capillair past (het kan langs het capillair worden bewogen, maar vereist enige inspanning om dat te doen).</li>
		<li>Schuif de gesneden pipetpunt vanuit de richting van de capillaire voorkant op het capillair en beweeg deze naar het uiteinde van de emitter.</li>
		<li>Schuif de beschermpunt naar achteren wanneer de kolom aan het spuiten is. Schuif de punt naar voren om de emitter in de punt te laten eindigen wanneer de kolom niet spuit (zelfs als de kolom onder de stroom zit, maar nog steeds niet spuit).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Sorbent slurry bereiding
<ol><li>Bereid een injectieflacon met sorptiemiddel voor: Plaats ~50 mg droog sorptiemiddel in een centrifugebuis van 1,5 ml. Hier wordt Reprosil Pur C18 als voorbeeld gebruikt.</li>
	<li>Voeg 1 ml methanol toe aan de absorberende buis.</li>
	<li>Om het volledig te mengen, vortex de buis gedurende 10 s met behulp van een vortex mixer.</li>
	<li>Soniceer in een ultrasoonapparaatbad gedurende 10 s.</li>
	<li>Laat het sorptiemiddel 20-30 min goed weken. Draai dan en soniceer het nogmaals.</li>
	<li>Bereid een werkende injectieflacon met sorptiemiddel voor. Gebruik een conische injectieflacon met bodem die in de bom past. OPMERKING: Het kan een andere centrifugebuis van 1,5 ml of een andere injectieflacon zijn, afhankelijk van het specifieke drukbomontwerp. Voor dit experiment wordt gebruik gemaakt van conische onderste schroefdopbuis die tot de hoogte van de drukbom is gesneden.</li>
	<li>Resuspend het sorptiemiddel in de voorraadsorbentflacon en breng 500 μL over in de werkende injectieflacon met sorptiemiddel met een magneetbalk van 2 x 3 mm.</li>
	<li>Voeg methanol tot ~1 ml toe aan de werkflacon.</li>
	<li>Laat de werkflacon 10 minuten op tafel staan om het sorptiemiddel door de zwaartekracht te laten bezinken.</li>
	<li>Als de sorptielaag na het bezinken minder dan 4 mm is, voeg dan meer van de voorraadsorbent slurry toe en wacht tot het sorptiemiddel nog 10 minuten is bezinkt. OPMERKING: De voorbereide werkflacon is bedoeld voor de voorbereiding van meerdere kolommen gedurende maanden. Als de werkende injectieflacon met sorptiemiddel langer dan 2 uur zonder te roeren blijft, moet deze gedurende 10 s worden gevortexed, gedurende 10 s worden gesoniseerd en door de zwaartekracht worden bezinkt. Routinematig wordt het sorptiemiddel 's ochtends vóór het verpakken geresuspendeerd. Dan is het goed voor het inpakken voor de hele dag als er geen lange pauzes zijn tussen het sequentiële kolom verpakken. Als het sorptiemiddel in de werkflacon uitdroogt, voegt u methanol toe en voert u de volledige sorptiepreparaatprocedure uit zoals voor de injectieflacon met voorraadsorptie (stappen 3.2-3.5).</li>
</ol>4. Capillaire verpakking in een drukbom
LET OP: Draag altijd een beschermende bril wanneer u met de drukbom werkt. Draag geen handschoenen. Deze verminderen de tastzin die nodig is voor een goede behandeling van haarvaten met een kleine diameter ernstig en leiden tot fouten.
<ol><li>Plaats de injectieflacon met sorptiemiddel in de drukbom en bevestig alle moeren stevig.</li>
	<li>Start de rotatie bij 60-100 tpm.</li>
	<li>Steek het gefrituurde of getrokken emitter capillair in de bom: duw het naar de bodem van de injectieflacon en til het vervolgens 2-3 mm op en bevestig de moer. OPMERKING: Pas een minimaal vereiste kracht toe om het capillair te fixeren om capillaire en ferruleschade te voorkomen. Het beste is het aanspannen van de hand. Als een inbussleutel wordt gebruikt, moet u minimaal voldoende inspanning leveren om aan te spannen.</li>
	<li>Controleer of het capillair goed is gefixeerd - het moet onmogelijk zijn om het capillair te bewegen door het met de hand uit te trekken.</li>
	<li>Open heel langzaam het drukbomventiel terwijl je het open uiteinde van het capillair van je gezicht gericht houdt.</li>
	<li>Bekijk de eerste stappen van het verpakkingsproces. OPMERKING: Onmiddellijk na drukvulling vult het sorptiemiddel het capillair en wordt het over de hele lengte ondoorzichtig. Zodra het sorptiemiddel zich in het distale uiteinde begint te verpakken, neemt de tegendruk toe, vertraagt de stroom en verandert de gelijkmatige sorbent slurry in het capillair in verschillende sorptiepakketten gescheiden door sorbentvrije openingen. Reeds verpakt sorptiemiddel is zichtbaar als een dichtgekleurd continu groeiend gebied.</li>
	<li>Houd de met sorptiemiddel gevulde gebieden gedurende de gehele duur van het verpakkingsproces op ten minste 70% van de capillaire lengte met kleine sorptievrije openingen.</li>
	<li>Er zijn verschillende veelvoorkomende problemen om in de gaten te houden tijdens het verpakkingsproces, die aanpassing van de installatie tijdens de vlucht vereisen om een efficiënte sorptiemiddelafgifte in het capillair te houden. OPMERKING: Meer details over de aanpassing van de efficiëntie van de sorptiemiddeltoevoer worden beschreven in tabel 3.<ol>
<li>Probleem 1: Wanneer nieuw sorptiemiddel stopt met het binnendringen van het capillair terwijl het sorptiemiddel dat er al in zit, blijft bewegen, volgt u de onderstaande stappen. OPMERKING: Dit is het meest voorkomende probleem. In de meeste gevallen wordt de capillaire ingang geblokkeerd door zelfaggregaterende sorptieclusters. Pas de volgende stappen één voor één toe totdat de sorptiestroom is hersteld en sla vervolgens de rest van de probleemgerelateerde stappen over.<ol>
<li>Verhoog de rotatiesnelheid tot 500 tpm en verlaag deze onmiddellijk terug naar 60-100 tpm. Meestal herstelt het de sorptiestroom. Controleer of de rotatiesnelheid ten minste 60 tpm is voor de rest van het verpakkingsproces.</li>
			<li>Als het niet helpt, ontlucht dan kort de verpakkingsbom en druk deze onmiddellijk terug.</li>
			<li>Als het niet helpt of de blokkering opnieuw gebeurt, verplaats dan het capillair in de absorberende laag. De afwezigheid van het sorptiemiddel kan te wijten zijn aan het feit dat het capillaire open uiteinde te hoog boven de magneetbalk is, zodat het kolomuiteinde het niet raakt, of dat het capillair in de bodem van de injectieflacon steekt. Ontlucht eerst de bom volledig, maak de moer los, duw het capillair naar de bodem en trek het vervolgens 2 mm naar achteren. Bevestig de moer.</li>
			<li>Als de blokkering aanhoudt, ontlucht u het systeem, haalt u de injectieflacon met het sorptiemiddel en de vortex eruit en maakt u deze opnieuw soniceren. Controleer het capillaire frontale uiteinde op schade onder de microscoop en snijd indien nodig ~ 5 mm van de voorkant.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Probleem 2: Wanneer het sorptiemiddel slechts een klein deel van het capillair vult met lange lege gebieden, volgt u de onderstaande stappen.<ol>
<li>Controleer de rotatiesnelheid. Als de rotatie te langzaam is, is het breken van de koepel niet efficiënt genoeg. Verhoog de rotatiesnelheid tot ~150 rpm.</li>
			<li>Als de rotatie te snel is, wordt het sorptiemiddel geresuspendeerd in het grotere flaconvolume en is de lokale sorptiemiddelconcentratie rond de kolomingang laag. Vertraag de rotatiesnelheid tot 60-100 RPM.</li>
			<li>Controleer het sorptiegehalte. Hetzelfde probleem met weinig sorptiemiddel in het capillair wordt waargenomen wanneer er niet genoeg sorptiemiddel in de injectieflacon zit. Wanneer het sorptiemiddel is opgebruikt, vult u de injectieflacon met het nieuwe sorptiemiddel om de sorptielaag niet minder dan 4 mm hoog te houden na door zwaartekracht veroorzaakte bezinking.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Blijf de kolom inpakken totdat de doelkolomlengte plus 5-7 cm is bereikt.</li>
	<li>Stop de rotatie en maak de bom heel langzaam onder druk.<ol>
<li>Open de bomklep een beetje en wacht tot de bubbel in de waterfles is gezakt. Open vervolgens de klep iets breder en wacht opnieuw tot de bel barst om te vertragen.</li>
		<li>Laat de druk in stappen los totdat er geen gas uit de klep komt. OPMERKING: Open de klep niet helemaal in één keer - dit zal leiden tot borrelen in het capillair en het sorptiemiddel dat teruggaat in de injectieflacon. Als dat gebeurt, zet je de bom onder druk en wacht je tot de kolom weer vol zit.</li>
	</ol></li>
	<li>Wanneer het gas niet meer uit de ontluchtingsklep komt, haalt u het verpakte capillair uit de drukbom. OPMERKING: Laat de kolom niet uitdrogen. Indien niet onmiddellijk aangesloten op het HPLC-systeem voor verdere verpakking, plaatst u het verpakte capillair in opslag door het in zijn geheel onder te dompelen in een 10% EtOH-oplossing. Een vloeistofdichte polypropyleen voedselopslagcontainer kan worden gebruikt voor capillaire opslag. Losgekoppelde HPLC-kolommen worden op dezelfde manier opgeslagen.</li>
	<li>Als er geen verdere verpakking gepland is, haalt u de injectieflacon met het absorberend middel uit de bom en sluit u deze goed af. Bewaar het voor verdere kolomverpakking.</li>
</ol>5. Verpakking in de HPLC-kolom
<ol><li>Sluit het verpakte capillair aan op het HPLC-systeem via een HPLC-verbinding.</li>
	<li>Start de stroom bij 95% oplosmiddel B (80 of 100% acetonitril, 0,1% mierenzuur (FA)) gericht op een druk van 250-300 bar. Gebruik voor 40 cm verpakt capillair het debiet van 200-300 nL / min. OPMERKING: Het pakdebiet is 200 nL/min voor een kolom van 40-50 cm met een ID van 100 μm verpakt met 2 μm sorptiemiddel. Enkele andere kolomgrootten zijn opgenomen in tabel 4. De stroomsnelheden voor andere kolomlengten en -ID's worden geschat op basis van de directe evenredigheid tussen de tegendruk en de kolomlengte en doorsnede. Het exacte debiet wordt aangepast aan de werkelijke verpakte lengte, die standaard langer is dan de beoogde kolomlengte. Merk ook op dat de druk van 300 bar gericht is op de fysieke druklimiet van de HPLC-verbinding. Voor verbindingen met een hogere druk moeten hogere debieten tot aan de verbindingsdruklimiet worden gebruikt voor een snellere verpakking.</li>
	<li>Kijk uit of het losse sorptiemiddel in het capillair wordt verpakt en wordt toegevoegd aan de totale verpakte lengte.</li>
	<li>Zonder de stroom te stoppen, dompelt u het kolomlichaam twee keer in het ultrasoonapparaatbad. OPMERKING: Dompel kolomuiteinden en capillaire verbindingen niet onder - slechts een deel van het kolomlichaam. Sonicatiestap helpt de reproduceerbaarheid van kolommen te verbeteren, vooral voor extreem lange kolommen >50 cm lang (ongepubliceerde gegevens); het voegt echter een willekeurige kans toe om de zelfassemblerende sorptiefrie in het emitteruiteinde van het getrokken emittercapillair te breken en de kolom volledig te blokkeren. Hoewel ultrasoonapparaat universeel kan worden toegepast op alle kolommen met glazen fritten, raden we aan om getrokken emitterkolommen alleen te soniceren voor de kolomlengte > 50 cm.</li>
	<li>Wanneer het absorberende bed stopt met krimpen, dompelt u het kolomlichaam twee keer meer in het ultrasoonapparaatbad zonder de stroom te stoppen.</li>
	<li>Voer de kolom nog eens 10 minuten uit bij 300 bars.</li>
	<li>Stop de stroom, wacht tot de druk daalt tot onder de drie bar en koppel de kolom los.</li>
	<li>Inspecteer de kolom visueel op het ontbreken van openingen en verkleuringen. Als er een wordt gevonden, kan ultrasoonapparaat onder de stroom worden herhaald. Voor kritische experimenten kunt u overwegen een nieuwe kolom te maken.</li>
	<li>Knip de kolom op de gewenste lengte. OPMERKING: Goed gedaan snijden is een voorwaarde voor kolomefficiëntie. Maak een inkeping in polyimidecoating met de scribent, kraak het capillair gedeeltelijk en trek twee stukken uit elkaar.</li>
	<li>Polijst de voorkant van de kolom op een keramische wafer of met lappende film.</li>
	<li>Sluit de kolom opnieuw aan op het LC-systeem met behulp van een UHPLC-verbinding.</li>
	<li>Start het werkdebiet bij 2% B, afhankelijk van de kolom-ID volgens tabel 4. Wacht tot de druk in evenwicht is en controleer de kolomrugdruk. OPMERKING: Het werkdebiet wordt aangepast aan de kolomparameters. Een 30 cm lange 100 μm ID-kolom wordt bijvoorbeeld uitgevoerd op 500 nL / min.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de tegendruk binnen 5% van de verwachte waarde ligt (zie tabel 5), Dit bevestigt dat de kolom goed is verpakt en klaar is voor gebruik. OPMERKING: De kolomtegendruk is de totale druk in het gradiëntkanaal van het HPLC-systeem met de kolom verbonden minus de tegendruk van de haarvaten vóór de kolom. Tegelijkertijd zijn de waarden in tabel 5 willekeurig (ze geven een willekeurige schaal van wat te verwachten). De intralaboratorium-gelijkenis van de tegendruk van kolom tot kolom is een belangrijkere indicator dat alles naar behoren werkt. De werkelijke absolute tegendruk hangt af van vele parameters, zoals de grootte en kenmerken van het sorptiemiddel, de capillaire ID, fabrikant en batch, de vorm van het getrokken emitteruiteinde of de dichtheid en lengte van de glasfriet, de oplosmiddeleigenschappen en de omgevingstemperatuur in de kamer, enz. Als de tegendruk te hoog is, zie tabel 1 voor mogelijke problemen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shishkova, E., Hebert, A. S., Now Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Now,+more+than+ever,+proteomics+needs+better+chromatography.">Now, more than ever, proteomics needs better chromatography.</a> Cell Systems. 3 (4), 321-324 (2016).</li><li>Shliaha, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle-down+proteomic+analyses+with+ion+mobility+separations+of+endogenous+isomeric+proteoforms.">Middle-down proteomic analyses with ion mobility separations of endogenous isomeric proteoforms.</a> Analytical Chemistry. 92 (3), 2364-2368 (2020).</li><li>. Pressure injection cells - next advance - laboratory instruments Available from: <a target="_blank" href="https://www.nextadvance.com/pressure-injection-cells-lc-ms-capillary-column-packing-loader/?target=Overview">https://www.nextadvance.com/pressure-injection-cells-lc-ms-capillary-column-packing-loader/?target=Overview</a> (2021)</li><li>Kovalchuk, S. I., Jensen, O. N., Rogowska-Wrzesinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlashPack:+Fast+and+simple+preparation+of+ultrahigh-performance+capillary+columns+for+LC-MS.">FlashPack: Fast and simple preparation of ultrahigh-performance capillary columns for LC-MS.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 18 (2), 383-390 (2019).</li><li>MacNair, J. E., Lewis, K. C., Jorgenson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh-pressure+reversed-phase+liquid+chromatography+in+packed+capillary+columns.">Ultrahigh-pressure reversed-phase liquid chromatography in packed capillary columns.</a> Analytical Chemistry. 69 (6), 983-989 (1997).</li><li>Bruns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slurry+concentration+effects+on+the+bed+morphology+and+separation+efficiency+of+capillaries+packed+with+sub-2+&#181;m+particles.">Slurry concentration effects on the bed morphology and separation efficiency of capillaries packed with sub-2 &#181;m particles.</a> Journal of Chromatography. A. 1318, 189-197 (2013).</li><li>Godinho, J. M., Reising, A. E., Tallarek, U., Jorgenson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+high+slurry+concentration+and+sonication+to+pack+high-efficiency,+meter-long+capillary+ultrahigh+pressure+liquid+chromatography+columns.">Implementation of high slurry concentration and sonication to pack high-efficiency, meter-long capillary ultrahigh pressure liquid chromatography columns.</a> Journal of Chromatography. A. 1462, 165-169 (2016).</li><li>Andrzejczak, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+phytoglobin+overexpression+on+the+plant+proteome+during+nonhost+response+of+barley+(Hordeum+vulgare)+to+wheat+powdery+mildew+(Blumeria+graminis+f.+sp.+tritici).">The effect of phytoglobin overexpression on the plant proteome during nonhost response of barley (Hordeum vulgare) to wheat powdery mildew (Blumeria graminis f. sp. tritici).</a> Scientific Reports. 10 (1), 9192 (2020).</li><li>Elchaninov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+transcriptome,+proteome,+and+miRNA+profile+of+kupffer+cells+and+monocytes.">Comparative analysis of the transcriptome, proteome, and miRNA profile of kupffer cells and monocytes.</a> Biomedicines. 8 (12), 627 (2020).</li><li>Babenko, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Draft+genome+sequences+of+Hirudo+medicinalis+and+salivary+transcriptome+of+three+closely+related+medicinal+leeches.">Draft genome sequences of Hirudo medicinalis and salivary transcriptome of three closely related medicinal leeches.</a> BMC Genomics. 21 (1), 331 (2020).</li><li>Babenko, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+unusual+peptides+with+new+Cys+frameworks+in+the+venom+of+the+cold-water+sea+anemone+Cnidopus+japonicus.">Identification of unusual peptides with new Cys frameworks in the venom of the cold-water sea anemone Cnidopus japonicus.</a> Scientific Reports. 7 (1), 14534 (2017).</li><li>Loughran, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusually+efficient+CUG+initiation+of+an+overlapping+reading+frame+in+POLG+mRNA+yields+novel+protein+POLGARF.">Unusually efficient CUG initiation of an overlapping reading frame in POLG mRNA yields novel protein POLGARF.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (40), 24936-24946 (2020).</li><li>Radzisheuskaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT5+methylome+profiling+uncovers+a+direct+link+to+splicing+regulation+in+acute+myeloid+leukemia.">PRMT5 methylome profiling uncovers a direct link to splicing regulation in acute myeloid leukemia.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (11), 999-1012 (2019).</li><li>Rubtsova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+encoded+in+human+telomerase+RNA+is+involved+in+cell+protective+pathways.">Protein encoded in human telomerase RNA is involved in cell protective pathways.</a> Nucleic Acids Research. 46 (17), 8966-8977 (2018).</li><li>Maiolica, A., Borsotti, D., Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-made+frits+for+nanoscale+columns+in+proteomics.">Self-made frits for nanoscale columns in proteomics.</a> PROTEOMICS. 5 (15), 3847-3850 (2005).</li><li>Ishihama, Y., Rappsilber, J., Andersen, J. S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcolumns+with+self-assembled+particle+frits+for+proteomics.">Microcolumns with self-assembled particle frits for proteomics.</a> Journal of Chromatography. A. 979 (1-2), 233-239 (2002).</li><li>Shishkova, E., Hebert, A. S., Westphall, M. S., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+pressure+(&gt;30,000+psi)+packing+of+capillary+columns+enhancing+depth+of+shotgun+proteomic+analyses.">Ultra-high pressure (&gt;30,000 psi) packing of capillary columns enhancing depth of shotgun proteomic analyses.</a> Analytical Chemistry. 90 (19), 11503-11508 (2018).</li></ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

In-house capillaire kolomverpakking is zeer populair in grote laboratoria die aan meerdere onafhankelijke projecten werken. Een gangbare verpakkingsmethode van een sorptieveuspensie met lage concentratie heeft echter grote beperkingen in de snelheid en is niet in staat om lange UHPLC-kolommen te produceren.
FlashPack is een aanpassing van de standaard verpakkingsprocedure die verpakking vanuit een zeer hoge sorptieconcentratie mogelijk maakt. De theoretische basis van de methode ligt in de continue sorptieve koepel destabilisatie bij de kolomingang gedurende de gehele verpakkingsduur. Dit laatste wordt technisch bereikt door kolomingang continu te raken met een magneetbalk. De methode van koepelonstabilisatie is opzettelijk ontwikkeld om de verpakkingsopstelling volledig vergelijkbaar te hebben met het gebruikelijke verpakkingsproces, maar de truc van FlashPack ligt in de details van de sorberende slurrybereiding, capillaire positionering en het gebruik van magneetbalken tijdens het verpakkingsproces.
De absorberende slurry wordt bereid als een sedimentsorberende laag in een groot oplosmiddelvolume. Het is interessant dat de op drukbommen gebaseerde verpakking niet dezelfde verpakkingsvoorwaarden vereist voor kolom tot kolom. In FlashPack weten we nooit de exacte concentratie van sorptiemiddeldrijfmest rond de kolomingang. Het is onmogelijk om precies te meten en te controleren, omdat het ook verandert tijdens het verpakkingsproces. De laatste kolommen zijn echter nog steeds zeer reproduceerbaar4, ongeacht hoe de verpakking is bereikt.
De basis voor de snelle verpakking ligt in de efficiënte sorbent koepel destabilisatie. Om deze reden is het belangrijk om het absorberende sorptiemiddel dat het capillair binnendringt te beheersen en de optimale koepel destabilisatieomstandigheden gedurende de gehele verpakkingsduur te handhaven. Er zijn verschillende mogelijke problemen die een efficiënte sorptiemiddelafgifte kunnen verhinderen. Enkele voorbeelden hiervan zijn sorbentlaag resuspensie door snelle magnetische staafrotatie, inefficiënte koepel destabilisatie als gevolg van een verkeerde relatieve capillaire positionering van de magneetbalk of een te langzame rotatie van de magneetbalk. De problemen zelf en hoe deze moeten worden aangepakt, worden in detail besproken in het protocolgedeelte.
Nadat de kolom is ingepakt, is de belangrijkste kolomparameter die u moet controleren de kolomtegendruk. De drukwaarden in tabel 5 bieden een referentiepunt voor wat wordt verwacht voor een van de populaire sub 2 μm kraalgrootte sorbent-ReproSil PUR C18 AQ (1,9 μm). Tegelijkertijd kan extra tegendruk worden toegevoegd door de frit of een te nauw getrokken emitter en men moet daar constant op letten. Als het verpakken in een getrokken emitter wordt gedaan, raden we nog steeds aan om de verwachte kolomtegendruk voor het specifieke gebruikte sorptiemiddel te meten door eerst gefrituurde haarvaten te verpakken en vervolgens te zien of de zelfassemblerende frit te veel toevoegt. Gebruik voor problemen met hoge druk de richtlijnen in tabel 1 om het probleem te lokaliseren.
Onze ervaring is dat een verpakte kolom zonder verkleuringen, openingen en met de juiste tegendruk in 100% van de gevallen werkt en de scheidingskwaliteit dicht bij wat kan worden verwacht van de kolomlengte en sorptie-eigenschappen. Een kolom met verkleuringen werkt niet gegarandeerd goed, maar kan toch bevredigende resultaten geven.
Meestal, als er problemen zijn met de scheidingskwaliteit, komen ze niet van de kolom zelf, maar eerder van andere delen van het scheidingssysteem, namelijk pompen, oplosmiddelen of verbindingen. Vooral potentieel schadelijk zijn eventuele verbindingen na de kolom. Een slechte verbinding met een dood volume tussen de emitter en de gefrituurde kolom leidt tot grote piekverbreding en tailing als gevolg van zeer lage stroomsnelheden in capillaire chromatografie.
Een ander belangrijk probleem dat specifiek is voor de FlashPack-aanpak is dat het veel dure sorptiemiddelen gebruikt in een werkende sorbent slurry-injectieflacon. Houd er rekening mee dat de absorberende slurry in FlashPack bedoeld is voor meervoudig gebruik. Zorg voor het sorptiemiddel. Vermijd onnodig roeren van de magneetstaaf om het sorptiemiddelslijpen te verminderen - vergeet niet om de rotatie te stoppen zodra de verpakking is voltooid. En laat de open injectieflacon met sorptiemiddel niet in de drukbom om te voorkomen dat het sorptiemiddel droogt. Hoewel het sorptiemiddel daarna nog steeds kan worden gebruikt, kost het tijd om de sorbent-slurry opnieuw te maken.
De methode werkt even goed voor zowel gefrituurde haarvaten als pulled-emitter haarvaten. Het FlashPack-principe verhoogt de paksnelheid voor capillaire IDs van 20 naar 250 μm (kleiner en groter werden niet getest). Het is ook van toepassing op alle sorptiemiddelen, zowel volledig als oppervlakkig poreus, die we zouden kunnen testen (wat aangeeft dat de sorptiemiddel koepelvorming in hoge sorbent slurryconcentratie niet specifiek beperkt is tot RP-sorptiemiddelen). Bovendien hebben oplosmiddelparameters duidelijk invloed op de verpakking op basis van hun fysische en chemische kenmerken. Minder viskeuze aceton geeft bijvoorbeeld een nog hogere paksnelheid dan methanol bij dezelfde pakdruk. Het is echter ook minder polair dan methanol en vermindert sorptiedeeltjes die aan elkaar kleven. Het effect op zichzelf voorkomt sorbent koepelvorming in het begin van de verpakking wanneer de stroomsnelheid nog hoog is. Vermindering van de interactie tussen absorberende deeltjes leidt echter ook tot minder betrouwbare zelfassemblerende fritvorming en frequentere pulled-end-blokkering tijdens het verpakken. Dus, terwijl aceton beter is voor het verpakken van gefrituurde haarvaten, is het minder geschikt voor pulled-emitter capillairen, waarbij de methanol als een slurry-oplosmiddel langzamer is, maar geschikt voor beide soorten uiteinden. Verpakking van hexaan of dichloormethaan (DCM) zijn extreme gevallen van overschakelen naar aceton uit methanol: ze zijn nog minder polair, dus ze voorkomen de vorming van sorbent koepel volledig, maar ze zijn helemaal niet geschikt voor pulled-emitter verpakking. Bovendien werd opgemerkt dat een extreem lage DCM-polariteit ertoe leidt dat absorberende deeltjes aan de interne capillaire wand blijven plakken en er een dikke laag op maken. De laagdikte groeit geleidelijk en willekeurige lokale blokken vormen zich, wat resulteert in de kolom verpakt in verschillende delen gescheiden door gebieden zonder sorptiemiddel. Een dergelijk effect werd waargenomen voor C18 Peptide Aeris sorbent.
Een ander waargenomen probleem was dat YMC Triart C18-sorptiemiddel niet goed in methanol werd gesuspendeerd, maar om een soort vlokken te vormen. Dat voorkomt echter niet dat het vol komt te zitten met de FlashPack en een zeer behoorlijke scheidingsefficiëntie geeft (ongepubliceerde gegevens). Hoewel methanol in sommige gevallen niet optimaal was, was het dus het meest universele oplosmiddel om te werken voor alle geteste sorptiemiddelen en kolommen. Het is noodzakelijk om te vermelden dat we nog niet hebben geanalyseerd hoe verschillende mestoplomiddelen de kolomscheidingsefficiëntie beïnvloeden. Tegelijkertijd is de efficiëntie van kolommen verpakt uit methanol al volledig gelijk aan commerciële kolommen voor dezelfde sorptiemiddelen4.
FlashPack is niet de enige bestaande aanpak om de paksnelheid van UHPLC-kolommen te verbeteren. Snel verpakken met een hoge sorptiemiddelconcentratie is ook mogelijk met behulp van ultrahogedrukverpakking7. Het voordeel van FlashPack is dat het veel eenvoudiger is omdat het geen speciale ultrahogedrukpompen en drukbommen vereist voor sorbentafgifte en capillaire verbindingen. Tegelijkertijd werd aangetoond dat de kolommen die bij extreme druk zijn verpakt, een scheidingsefficiëntie kunnen hebben die hoger is dan kolommen met een lagere druk17. En hoewel FlashPack kolommen produceert die identiek zijn aan commerciële kolommen die worden gebruikt in de vergelijking4, waarvoor we de verpakkingsmethode niet kennen, werd nog niet getest hoe FlashPack-kolommen staan tegen ultrahoge druk verpakte kolommen.
Samenvattend kan de beschreven FlashPack-methode eenvoudig worden aangepast aan het bestaande verpakkingsprotocol in het laboratorium met enkele aanpassingen aan het protocol, terwijl de installatie volledig hetzelfde blijft. Het versnelt de HPLC capillaire kolomverpakking tot minuten tijd en maakt de productie van lange UHP capillaire kolommen mogelijk, wat duidelijk onmogelijk is met de standaard verpakkingsprocedure. De totale zuinigheid in tijd en geld voor het laboratorium door toepassing van de FlashPack-aanpak kan worden geteld in tienduizenden euro's per jaar. Bovendien opent de mogelijkheid om UHP-capillaire kolommen lokaal te produceren de mogelijkheden voor experimentaanpassing die onmogelijk zijn met de beschikbare commerciële producten.

Moderne proteomics is gebaseerd op vloeistofchromatografie-gekoppelde massaspectrometrie met de ultra-high performance nano-flow chromatografie (50-150 μm kolom interne diameter (ID)) scheiding die de beste analysesnelheid en gevoeligheid biedt1. Hoewel er tal van commerciële UHPLC-capillaire kolommen beschikbaar zijn, vormt hun prijs een groot deel van de kosten van verbruiksartikelen, vooral wanneer meerdere uiteenlopende projecten in het laboratorium worden uitgevoerd en projectspecifieke kolomverontreiniging een frequent probleem is. Bovendien maakt het verpakken van kolommen in eigen huis het gebruik van aangepaste experimentspecifieke sorptiemiddelen (zoals bijvoorbeeld polyCAT-A-sorptiemiddel2)en kolomkenmerken mogelijk die niet beschikbaar zijn om te kopen als een kant-en-klare kolom.
Om dat het hoofd te bieden, pakken veel laboratoria capillaire kolommen in huis. De gebruikelijke verpakkingsprocedure met een drukbom van 100 bar (drukinjectiecel)3 is echter niet geschikt voor de UHPLC-kolomverpakking vanwege de hoge tegendruk van sub-2 μm UHPLC-sorptiemiddelen, wat resulteert in een dramatische verlaging van de verpakkingssnelheid in vergelijking met grotere HPLC-sorptiemiddelen. Hoewel korte UHPLC-kolommen nog steeds zeer langzaam kunnen worden verpakt, is de productie van lange UHPLC-kolommen fysiek onmogelijk4.
Standaard capillaire kolomverpakking gebeurt bij relatief lage drukken - tot 100 bar, en met een zeer lage sorberende slurryconcentratie. Daarom zijn er twee mogelijke richtingen beschikbaar om het proces te versnellen. Het is mogelijk om de pakdruk te verhogen5. Dit vereist echter speciale apparatuur en, praktisch, installatie van een nieuwe methode in het laboratorium. Een andere manier is om de sorptiemiddeldrijfmestconcentratie te verhogen6. Verpakking met hoge sorptiemiddelconcentratie wordt in een eerdere publicatie beschreven in combinatie met ultrahoge verpakkingsdruk7. Bij een druk van 100 bar, die in de meeste bestaande verpakkingsbommen wordt gebruikt, resulteert een hogere sorptieconcentratie echter in een vertraging van de verpakkingssnelheid of een regelrechte stopzetting van de verpakking. Het effect werd onlangs aangetoond als gevolg van sorbent clustering bij de kolomingang, en een eenvoudige truc van sorbent koepel destabilisatie door hameren de kolom ingang met een magneet staaf in een sorbent flacon werd voorgesteld4. De resulterende methode, genaamd FlashPack, gebruikt dezelfde 100-bar drukbomverpakkingsopstelling. Tegelijkertijd maken kleine maar kritische wijzigingen in de verpakkingsprocedure het mogelijk om in minder dan een uur te verpakken met een zeer hoge sorptieve mestconcentratie en productie van zeer lange UHPLC-kolommen (50 tot 70 cm en langer), terwijl een korte kolom in minuten kan worden geproduceerd met de scheidingskwaliteit gelijk aan commerciële kolommen van dezelfde parameters4. De FlashPack-aanpak werd al met succes gebruikt in meerdere proteomics-projecten voor de voorbereiding van zowel omgekeerde fase(RP) 8,9,10,11,12,13,14 als hydrofiele interactie (HILIC)2 capillaire kolommen.
Hier beschrijven we in detail de aanpassingen die nodig zijn voor aanpassing van de FlashPack-benadering aan de standaard 100-bar drukbomverpakkingsprocedure.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.59002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Scoring Wafer</td>
			<td>Restek</td>
			<td>20116</td>
			<td>any ceramic wafer is suitable for capillary polishing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-chip bladed scribe</td>
			<td>NewObjective</td>
			<td>Diamond-chip bladed scribe</td>
			<td>recommended for capillary cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fused silica capillary 100 mm ID 375 mm OD</td>
			<td>CM Scientific</td>
			<td>TSP100375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GELoader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30001222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Ultimate3000 RSLCnano</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P2000/F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnet bar 2x5 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z283819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microspatula</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z193216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK ferrule 360 mm</td>
			<td>VICI</td>
			<td>JR-C360NFPK</td>
			<td>use to connect the column to UPLC union</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tip, 1000 uL</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z740095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 1000 uL</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman L P1000L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure bomb</td>
			<td>NextAdvance</td>
			<td>PC-77 MAG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>regulator</td>
			<td>GCE</td>
			<td>Jetcontrol 600 200/103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 mm</td>
			<td>Dr. Maisch</td>
			<td>r13.aq.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 0.5 mL</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AXYST050SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 1.5 mL</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AXYST150SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw caps with O-rings</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AXYSCOC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonication bath</td>
			<td>Elma</td>
			<td>Elmasonic S30 H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>union HPLC</td>
			<td>VICI</td>
			<td>JR-C360RU1PK6</td>
			<td>HPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>union UPLC</td>
			<td>VICI</td>
			<td>JR-C360RU1FS6</td>
			<td>UPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vortex</td>
			<td>BioSan</td>
			<td>V-1plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% (v/v) Formic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.59013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple in-house ultra-high performance capillary column manufacturing with the flashpack approach

Capillaire ultra-high performance vloeistofchromatografie (UHPLC) is momenteel een voorkeursmethode voor de monsterscheidingsstap in op LC-MS gebaseerde proteomics. Capillaire kolommen zijn echter veel minder robuust in vergelijking met hun hogere stromingstellertypen. Vanwege eenvoudige vervuiling en blokkering zijn ze vaak aan vervanging toe. Dat maakt ze een aanzienlijk duur onderdeel van de totale LC-MS-analysekosten. In-house verpakking van UHPLC capillaire kolommen bespaart veel geld en maakt maatwerk mogelijk. De standaard verpakkingsprocedure in de 100-bar drukbom werkt echter alleen goed voor HPLC-kolommen, maar is te traag voor UHPLC-sorptiemiddelen. Hier geven we een beschrijving van een geoptimaliseerd FlashPack-protocol dat wordt toegepast op dezelfde 100-bar drukbomopstelling. De methode is gebaseerd op verpakking uit slurry met ultrahoge sorptieconcentratie en is ontwikkeld voor de interne productie van UHPLC-capillaire kolommen van onbeperkte lengte binnen een redelijke tijd.

De FlashPack-aanpak is gebaseerd op de standaard verpakkingsconfiguratie en volgt dezelfde verpakkingspijplijn. Verpakken gebeurt in standaard gefrituurde of getrokken emitter haarvaten. De belangrijkste optimalisatie ligt in de concentratie van sorbent-drijfmest: de standaardmethode is niet compatibel met een hooggeconcentreerde sorptiesuspensie die in FlashPack wordt gebruikt. Het resultaat is een snelle productiemethode voor lange UHPLC-kolommen, bijvoorbeeld een kolom verpakt voor een lengte van 50 cm met 1,9 μm sorptiemiddel in minder dan 1 uur(figuur 2).
Om de toepassing van de FlashPack-benadering aan te tonen, werd een 30 cm 100 μm ID-capillaire kolom voorbereid(tabel 6). Het verpakken van ReprosilPur C18 1,9 μm sorptiemiddel werd gedaan bij 60 bar in een 50 cm lang 100 μm ID getrokken emitter capillair, bereid door een P2000 lasertrekker. Het capillair werd in 40 min verpakt tot ~40 cm met nog wat losse sorptiemiddel in het capillair. Het verpakte capillair werd aangesloten op een HPLC-systeem en liep op 300 nL/min met oplosmiddel B (80% acetonitril, 0,1% FA). Na twee rondes van 5 s sonicatie was de uiteindelijke verpakte lengte 43 cm. De kolom werd losgekoppeld, gesneden tot 30 cm en aangesloten op het HPLC-systeem met behulp van een UHPLC-aansluiting. We gebruiken routinematig 360 μm sleeveless PEEK moerferrule en 360 μm roestvrijstalen unie. Deze combinatie bevat ten minste 700 bar als deze sterk wordt aangedraaid. De gefabriceerde kolom heeft een tegendruk van 520 bar bij 2% oplosmiddel B bij 500 nL/min, wat overeenkomt met het verwachte waardebereik(tabel 5).
Als demonstratie van de kolomefficiëntie gebruikten we de gefabriceerde kolom van 30 cm om 50 fmol van een tryptisch vertering van cytochroom C-eiwit te scheiden in een gradiënt van 15 minuten van 2% tot 50% B. Geëxtraheerde ionchromatogrammen toonden aan dat de pieken zeer symmetrisch waren met minimale tailing. De gemiddelde FWHM was ongeveer 3 s(figuur 3).
Tabel 1: Problemen oplossen voor hoge werkdruk van de kolom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table1_HighColPressurev2.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 2: P2000/F laser puller programma. P2000/F laser puller programma voor de bereiding van getrokken emitter capillairen van 360 μm OD 100 μm ID gesmolten silica polyimide gecoate haarvaten zonder interne coating bij kamertemperatuur 23-25 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table2_P2000F%20laser%20puller%20program.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 3: FlashPack-specifieke verpakkingsproblemen en controlepunten om te controleren tijdens het verpakkingsproces. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table3_sorbentDeliveryIssuesss.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 4: Voorbeeldige verpakkings- en werkdebieten voor verschillende kolom-ID's en lengte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table4%20Exemplary%20packing%20and%20working%20flow%20rates.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 5: Verwachte tegendruk voor een kolom vol met 2 μm bolvormige sorptiemiddelen en uitgevoerd met werkdebiet (volgens de kolom-ID) in het RP-oplosmiddelsysteem bij RT. Klik hier om deze tabel te <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table5_Expected%20backpressure.xlsx" target="_blank">downloaden.</a>
Tabel 6: Voorbeeldige verpakking van 30 cm UHPLC kolom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table6_Exemplary%20packing%20of%2030%20cm%20UHPLC%20columnv2.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig01.jpg"> Figuur 1: Verpakkingsschema capillaire kolommen. Fase 1 tot en met 3 zijn voorbereidend, gevolgd door drukbom verpakking en afgewerkt door HPLC verpakking. Fase 3 en 4 zijn aangepast voor het ultra-efficiënte FlashPack-protocol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig02.jpg"> Figuur 2: Paksnelheid voor een gefrituurde capillaire 100 μm ID met ReprosilPur C18 AQ 1,9 μm bij 100 bar in methanol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig03.jpg"> Figuur 3: Geëxtraheerde ionchromatogrammen van tryptische peptiden van cytochroom C. Geëxtraheerde ionchromatogrammen van tryptische peptiden van cytochroom C na scheiding van 50 fmol in 30 cm lange 100 mm ID getrokken emitter capillaire kolom verpakt met ReprosilPur C18 AQ 1,9 μm in een gradiënt van buffer B (80% acetonitril, 0,1% FA) en in buffer A (2% acetonitril, 0,1% FA) van 2% tot 40% B in 15 min bij 500 nL/min bij RT. Detectie werd uitgevoerd met behulp van een massaspectrometer. Absolute intensiteiten en geëxtraheerde m/z-bereiken voor elk peptide worden rechts van de spectra weergegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach at JoVE.com

Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach

Hier presenteren we een protocol voor de geoptimaliseerde FlashPack capillaire kolomverpakkingsprocedure. Toepassing van een geoptimaliseerd protocol op een gemeenschappelijke 100-bar drukbomopstelling maakt 10 keer snellere verpakking en productie van lange ultra-high performance capillaire kolommen mogelijk.

Eenvoudige in-house ultra-high performance capillaire kolomproductie met de FlashPack-aanpak

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. ...

Eenvoudige in-house ultra-high performance capillaire kolomproductie met de FlashPack-aanpak. Het doel van deze procedure is om een geoptimaliseerd protocol te introduceren voor snelle en eenvoudige ultra high-performance capillaire kolomverpakking voor LC-MS proteomics-analyse. Moderne proteomics is gebaseerd op massaspectrometrie in combinatie met ultra-high performance capillaire vloeistofchromatografie.Peptidescheiding gebeurt meestal in capillaire kolommen met een inwendige diameter van 75 micrometer. Net als bij commerciële producten is het mogelijk om capillaire kolommen in eigen huis te bereiden. Op maat gemaakte kolommen vertonen scheidingskwaliteiten die vergelijkbaar zijn met commerciële analogieën, terwijl ze veel geld besparen en aanpassing van sorptiemiddel en kolomgrootte mogelijk maken.Hier demonstreren we een geoptimaliseerd verpakkingsproces voor de interne productie van capillaire kolommen, die we FlashPack noemen. Het idee achter de optimalisatie is om te verpakken vanuit een zeer hoge sorbent slurryconcentratie, terwijl nog steeds dezelfde gemeenschappelijke 100 bar drukbomverpakkingsopstelling wordt gebruikt. Dit vereist het continu opbreken van sorptieclusters, die zich bij hoge sorptiemiddelconcentratie rond de kolomingang vormen en voorkomen dat nieuw absorberend materiaal het capillair binnendringt.Technisch gezien bereiken we dat door een magneetbalk als hamer te gebruiken, constant te verwarmen en rond het capillair in de sorptiedraad te bewegen. Correct toegepaste FlashPack verhoogt de paksnelheid tot 10 keer. Dat maakt het geschikt voor het verpakken van ultra high performance sorptiemiddelen van zachtere micro metricbeat grootte en voor het vervaardigen van zeer lange kolommen tot een meter lengte in redelijke tijden.De kolomvoorbereidingsprocedure bestaat uit vijf stappen. Drie voorbereidende stappen, waaronder de assemblage van pakstations en capillaire en absorberende slurrybereiding. Vervolgens wordt het capillair eerst verpakt in de drukbom bij 60 tot 100 bar druk.Het wordt gevolgd door aansluiting van het verpakte capillair op het HPLC-systeem, waarbij het sorptiemiddel onder hoge druk wordt verpakt en de kolom op maat wordt gesneden. De FlashPack-procedure vereist dat wijzigingen worden aangebracht in de stappen drie en vier van het gemeenschappelijke protocol. Allereerst bereiden we een pakstation voor.Het bestaat uit een stikstofgastank met een uitlaatdruk van ten minste 50 bar. De tank is verbonden met de ontluchtingsklep van de drukbom, die in de magneetroerder wordt geplaatst. De uitlaat van de ontluchtingsklep wordt in een waterfles geplaatst via een smal ID PEEK-capillair, wat een fijne controle op de drukregeling mogelijk maakt.Vervolgens bereiden we een capillair voor. Verpakken kan worden gedaan in een gefrituurd capillair met een geïntegreerde glazen frit gevormd uit Kasil en formamide. Een andere optie is om te verpakken in een getrokken capillair bereid door sutter laser puller.Het capillair moet 10 tot 15 centimeter langer worden gemaakt dan de beoogde kolomlengte. De volgende video is voorbereid op het voorbeeld van een getrokken emitter capillaire verpakking. Bescherm een getrokken emitteruiteinde met een gesneden pipetpunt met gelbelasting.Zie de tekstversie van het manuscript voor meer informatie. De volgende fase is sorbent slurry-voorbereiding. Doe eerst ongeveer 50 milligram droog sorptiemiddel in een centrifugebuis van 1,5 milliliter.Dat wordt een voorraadsorberend flesje. Deze video is gemaakt met behulp van Reprosil Pur C18 AQ 1.9 micrometrisch sorptiemiddel van Dr.Maisch. Voeg één milliliter methanol toe aan de injectieflacon met het absorberende voorraad.Vortex gedurende 10 seconden. En soniceer nog eens 10 seconden in een ultrasoonapparaatbad. Laat het sorptiemiddel 20 tot 30 minuten grondig weken, draai dan vortex en soniceer het nogmaals.Bereid een werkende injectieflacon met sorptiemiddel voor. Het moet een conische bodemflacon zijn die in de bom past. Het kan een andere centrifugebuis van 1,5 milliliter of een andere injectieflacon zijn, afhankelijk van het specifieke drukbomontwerp.We gebruiken een omzoomde conische onderste schroefdopbuis die tot de hoogte van de drukbom is gesneden. Suspensie het sorptiemiddel opnieuw in de voorraad sorbentflacon en breng 500 microliter over in de werkende sorptieflacon samen met een magneetbalk van twee bij drie millimeter groot. Top naar de werkflacon tot één milliliter met methanol.Laat de werkflacon 10 minuten op tafel staan om het sorptiemiddel door de zwaartekracht te laten bezinken. Het resultaat van deze stap moet een conische bodemflacon zijn met de onderste laag los sorptiemiddel van ongeveer vier millimeter hoog. Als de laag te laag is, en wat meer sorptiemiddel uit de voorraadflacon.De aldus voorbereide werkflacon is bedoeld voor de voorbereiding van meerdere kolommen gedurende maanden. Als de werkende injectieflacon met sorptiemiddel langer dan twee uur zonder te roeren blijft, moet deze vóór het verpakken worden gevortexed, gesoniseerd en door de zwaartekracht opnieuw worden bezinkt. Wanneer alles is voorbereid, ga je verder met fase vier, waarbij je de drukbom inpakt.Draag altijd een beschermende bril bij het werken met gesmolten silicacapillairen en de drukbom. Tegelijkertijd worden beschermende handschoenen niet aanbevolen. Ze verminderen de tastzin die nodig is voor een goede behandeling van haarvaten met een kleine diameter ernstig en leiden tot fouten.Plaats de injectieflacon met het sorptiemiddel in de drukbom en bevestig alle knopen stevig. Start de rotatie met 60 tot 100 ronden per minuut, steek het gefrituurde of getrokken emitter capillair in de bom. Duw het naar de bodem van de injectieflacon, til het vervolgens twee tot drie millimeter op en bevestig de knoop.Pas de minimaal vereiste kracht toe om het capillair te fixeren. Controleer of het capillair goed is gefixeerd. Het moet onmogelijk zijn om het capillair te bewegen door het er met de hand uit te trekken.Open heel langzaam het drukbomventiel terwijl je het open uiteinde van het capillair weg van je gezicht houdt. Bekijk de eerste stappen van het verpakkingsproces. Onmiddellijk na druk vult het sorptiemiddel het capillair en wordt het over de hele lengte ondoorzichtig.Zodra het sorptiemiddel zich in het distale uiteinde begint te verpakken, neemt de tegendruk toe, vertraagt de stroom en verandert de gelijkmatige sorptiemest in het capillair in verschillende sorptiepakketten, gescheiden door sorptievrije openingen. Reeds verpakt sorptiemiddel is zichtbaar als een dichtgekleurd continu groeiend gebied. Houd de met sorptiemiddel gevulde gebieden gedurende de gehele duur van het verpakkingsproces op ten minste 70% van de capillaire lengte met kleine sorptievrije openingen.Er zijn verschillende veelvoorkomende problemen om in de gaten te houden tijdens het verpakkingsproces. Ze vereisen aanpassing van de opstelling tijdens de vlucht om een efficiënte sorptiemiddelafgifte in het capillair te houden. Het meest voorkomende probleem is wanneer nieuw sorptiemiddel stopt met het binnendringen van het capillair terwijl het sorptiemiddel dat al binnen is, blijft bewegen.In de meeste gevallen wordt de capillaire ingang geblokkeerd door zelfaggregaterende absorberende clusters. Pas deze stappen één voor één toe totdat de sorptiestroom is hersteld en sla vervolgens de rest van de probleemgerelateerde stappen over. Verhoog de rotatiesnelheid tot 500 ronden per minuut en verlaag deze onmiddellijk terug tot 60 RPM.Meestal herstelt het de sorptiestroom. Controleer of de rotatiesnelheid ten minste 60 RPM is voor de rest van het verpakkingsproces. Als het niet helpt, ontlucht dan kort de verpakkingsbom en druk deze onmiddellijk terug.Als het niet helpt, of als de blokkering opnieuw gebeurt, verplaats dan het capillair in de absorberende laag. De afwezigheid van het sorptiemiddel kan te wijten zijn aan het feit dat het capillaire open uiteinde te hoog boven de magneetbalk is, zodat het kolomuiteinde het niet raakt. Of het capillair is te laag geplaatst en steekt in de bodem van de injectieflacon.Ontlucht eerst de bom volledig, maak vervolgens de moer los, duw het capillair naar de bodem en trek het vervolgens twee millimeter naar achteren. Bevestig de moer. Open de klep om de bom onder druk te zetten en ga verder met inpakken.Meer informatie over de verpakkingsproblemen wordt beschreven in de tekstversie van de methode. Blijf de kolom inpakken totdat de doelkolomlengte plus vijf tot zeven centimeter is bereikt. Stop de rotatie en maak de bom heel langzaam onder druk.Open de bomklep een beetje en wacht tot de bubbel in de waterfles is gezakt. Open vervolgens de klep iets breder en wacht opnieuw tot de bel barst om te vertragen. Laat dus in incrementele stappen de druk los totdat er geen gas uit de klep komt.Open de klep niet helemaal in één keer. Het zal leiden tot borrelen in het capillair en het sorptiemiddel gaat terug in de injectieflacon. Als dat gebeurt, zet je de bom onder druk en wacht je tot de kolom weer vol zit.Wanneer het gas niet meer uit de ontluchtingsklep komt, haalt u het verpakte capillair uit de drukbom. Laat de kolom niet uitdrogen. Als het niet onmiddellijk op het HPLC-systeem is aangesloten voor verdere verpakking, bergt u het verpakte capillair op door het in zijn geheel onder te dompelen in een 10% ethanoloplossing.Losgekoppelde HPLC-kolommen worden op dezelfde manier opgeslagen. Als er voor vandaag geen verpakking meer gepland staat, haal dan de injectieflacon met sorptie uit de bom en sluit deze goed af. Bewaar het voor verdere verpakking van de kolom.Fase vijf, HPLC inpakken. Sluit het verpakte capillair aan op het HPLC-systeem via een HPLC-verbinding. Start de stroom van hoog organisch oplosmiddel.Pas de stroom aan op basis van de verpakte lengte en richt u op ongeveer 300 bar. Gebruik voor 40 centimeter verpakt capillair het debiet van 200-300 normale liter per minuut. Let op losse sorptiemiddel in het capillair dat wordt verpakt, wat bijdraagt aan de totale verpakte lengte.Zonder de stroom te stoppen, dompelt u het kolomlichaam twee keer in het ultrasoonapparaatbad. Het is belangrijk om slechts een deel van het kolomlichaam onder te dompelen. Dompel kolomuiteinden en capillaire verbindingen niet onder.Wanneer het absorberende bed stopt met krimpen, dompelt u het kolomlichaam twee keer meer in het ultrasoonapparaatbad zonder de stroom te stoppen. Voer de kolom nog eens 10 minuten uit bij 300 balken. Stop de stroom, wacht tot de druk daalt tot onder de drie bar en koppel de kolom los.Inspecteer de kolom visueel op het ontbreken van openingen en verkleuringen. Als er een wordt gevonden, kan ultrasoonapparaat onder de stroom worden herhaald. Voor kritische experimenten kunt u overwegen een nieuwe kolom te maken.Knip de kolom op de gewenste lengte. Goed uitgevoerd snijden is een voorwaarde voor kolomefficiëntie. Maak een inkeping in polyamide coating met de scribent.Scheur het capillair gedeeltelijk en trek twee stukken uit elkaar. Polijst de voorkant van de kolom op een keramische wafer of met lappende film. Sluit de kolom opnieuw aan op het LC-systeem met behulp van een ultrahogedrukverbinding.Start het werkdebiet op 2%B. Het werkdebiet wordt aangepast aan de kolomparameters. Zo draaien 100 micrometer ID-kolommen met 500 nanoliter per minuut.Wacht tot de druk in evenwicht is en controleer de tegendruk van de kolom. Een goed voorbereide kolom geeft tegendruk die evenredig is met de lengte en sorptie-eigenschappen. Bijvoorbeeld, 30 centimeter capillaire kolom verpakt met twee micrometer sorptiemiddel heeft een tegendruk van 450 tot 500 bar bij 2% oplosmiddel B.Als de geproduceerde kolom een tegendruk geeft binnen het verwachte bereik, is deze klaar voor gebruik.Als de tegendruk ver buiten het verwachte bereik ligt, is er iets mis met de kolom of met het LC-systeem. Verpakken met FlashPack produceert een capillair verpakt voor 50 centimeter met 1,9 micrometer sorptiemiddel in minder dan een uur bij 100 bar verpakkingsdruk. Als voorbeeld produceren we 30 centimeter 100 micrometer ID ultrahogedrukkolom verpakt in een getrokken emitter capillair met 1,9 micrometer ReprosilPur C18 AQ sorptiemiddel.Het verpakken gebeurde bij 60 repen in 50 centimeter lang getrokken emitter capillair. Het capillair werd in 40 minuten tot 40 centimeter verpakt met wat meer sorptiemiddel in het capillair dat niet was verpakt. Het verpakte capillair was aangesloten op het HPLC-systeem en liep met 300 nanoliter per minuut met oplosmiddel B, dat in ons geval 80% acetonitril, 0,1% mierenzuur was.De uiteindelijke ingepakte lengte was 43 centimeter. De kolom werd 30 centimeter gesneden. Bij 500 nanoliter per minuut werkstroom met 99% oplosmiddel B gaf de kolom de tegendruk van 275 bar, wat dicht bij de verwachte waarde ligt.Om de kolom te testen, scheidden we 50 fmol van een tryptische digest van cytochroom C-eiwit in een gradiënt van 15 minuten van 2-50% B. Chromatografische pieken waren zeer symmetrisch met minimale tailing. De gemiddelde FWHM lag rond de drie seconden.Het beschreven protocol is in staat om UHPLC-kolommen te produceren in een gemeenschappelijke 100 bar verpakking die binnen een redelijke tijd is ingesteld. Korte HPLC- of UPLC-kolommen kunnen in minuten tijd worden verpakt, terwijl lange kolommen van 30-50 centimeter in minder dan een uur worden verpakt. De methode is efficiënt voor het verpakken van sorptiemiddelen met RP en andere chemie in kolom-ID's.Geproduceerde kolommen zijn reproduceerbaar even effectief als elke andere commerciële kolom van vergelijkbare grootte en sorptieparameters.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Het onderzoeken van Proteasome Montage met Recombinant Archaea Proteasomen en denaturerende PAGE: The Case voor een gecombineerde aanpak

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Capillaire Elektroforese Scheiding van monoklonaal antilichaam isovormen gebruiken een neutrale capillair

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Verbeterde Sample Multiplexing Weefsels gebruik van Gecombineerd Precursor isotopische labeling en Isobaric Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Een eenvoudige methode voor High Throughput chemische Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Analyse van intrinsieke wanorde van de AtHIRD11 en bindende naar metaalionen door capillaire gelelektroforese en affiniteit capillaire elektroforese

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Een aanpasbare aanpak voor de enzymatische productie en zuivering van Diterpenoid natuurlijke producten

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Ultra-High-Speed Western Blot met behulp van Immunoreaction Enhancing Technology

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Een economisch en veelzijdig eiwitzuiveringssysteem met hoge doorvoer met behulp van een plaatadapter met meerdere kolommen

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Identificatie van de bindende eiwitten van kleine liganden met de differentiële radiale capillaire werking van ligandtest (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Absolute kwantificering van inositolpyrosfaten door capillaire elektroforese elektrospray ionisatie massaspectrometrie

Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) are an important group of intracellular signaling molecules. Derived from inositol phosphates (InsPs), these molecules ...