Name: simple in-house ultra-high performance capillary column manufacturing with the flashpack approach
Uploaded: 2021-12-04T14:00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach at JoVE.com

Le travail a été soutenu par la subvention RSF 20-14-00121. Les auteurs remercient P. V. Shliaha (Memorial Sloan Kettering Cancer Center) pour ses discussions fructueuses.

Le protocole d’emballage comprend cinq étapes(Figure 1): 1) Préparation de la station d’emballage, 2) préparation capillaire, 3) préparation de la boue absorbante, 4) emballage capillaire dans la bombe sous pression et 5) emballage de colonne dans le système HPLC, jusqu’à la taille et l’installation de connexion UHPLC. L’optimisation de FlashPack nécessite des ajustements dans les sections 3 et 4 par rapport au protocole commun.
1. Assemblage de la station d’emballage
<ol><li>Préparez un réservoir de gaz rempli d’azote, d’hélium ou d’argon équipé d’un régulateur de gaz à un étage dont la pression de sortie > 50 bars. La pression maximale est limitée par la compatibilité de la bombe sous pression.</li>
	<li>Connectez le régulateur à la vanne d’aération de la bombe sous pression.</li>
	<li>Si la bombe sous pression n’est pas équipée d’un agitateur magnétique intégré, placez la bombe sur un agitateur magnétique.</li>
	<li>Connectez un tube en plastique ID étroit (par exemple, 0,13 mm) à la sortie d’évent de la bombe sous pression et placez-le dans un récipient avec de l’eau.</li>
</ol>2. Préparation capillaire
<ol><li>Préparer un capillaire fritté avec une fritte de verre intégrée formée de Kasil et de formamide15 ou un capillaire émetteur tiré préparé par un arracheur laser16. Le capillaire est fait 10-15 cm plus long que la longueur de colonne prévue. REMARQUE : Voir le tableau 1 pour la discussion des problèmes possibles associés aux différentes tailles capillaires et types de frites. Le tableau 2 contient un exemple de programme d’attraction laser P2000 pour la fabrication de capillaires à émetteur tiré.</li>
	<li>Protégez une extrémité d’émetteur tirée avec une pointe de pipette à chargement de gel coupé.<ol>
<li>Coupez la pointe de manière à ce qu’elle s’adapte bien autour du capillaire OD de 360 μm (elle peut être déplacée le long du capillaire, mais nécessite un certain effort pour le faire).</li>
		<li>Faites glisser la pointe de la pipette coupée sur le capillaire à partir de la direction de l’extrémité avant capillaire et déplacez-la jusqu’à l’extrémité de l’émetteur.</li>
		<li>Faites glisser vers l’arrière l’embout de protection lorsque la colonne pulvérise. Faites glisser la pointe vers l’avant pour que l’émetteur se termine à l’intérieur de la pointe lorsque la colonne ne pulvérise pas (même lorsque la colonne est sous le flux, mais ne pulvérise toujours pas).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Préparation de boue sorbante
<ol><li>Préparer un flacon de sorbant : Placer environ 50 mg de sorbant sec dans un tube de centrifugeuse de 1,5 mL. Ici, Reprosil Pur C18 est utilisé comme exemple.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de méthanol dans le tube absorbant.</li>
	<li>Pour le mélanger complètement, vortex le tube pendant 10 s à l’aide d’un mélangeur vortex.</li>
	<li>Sonicate dans un bain de sonication pendant 10 s.</li>
	<li>Laissez le sorbant bien trempé pendant 20-30 min. Ensuite, vortexez-le et soniquez-le une fois de plus.</li>
	<li>Préparez un flacon de sorbant fonctionnel. Utilisez un flacon à fond conique qui s’insère dans la bombe. REMARQUE: Il peut s’agir d’un autre tube de centrifugeuse de 1,5 mL ou de tout autre flacon en fonction de la conception de la bombe sous pression particulière. Pour cette expérience, un tube de bouchon à vis de fond conique coupé à la hauteur de la bombe sous pression est utilisé.</li>
	<li>Resuspendez le sorbant dans le flacon de sorbant de stock et transférez 500 μL dans le flacon de sorbant de travail avec une barre magnétique de 2 x 3 mm de taille.</li>
	<li>Ajouter le méthanol jusqu’à ~1 mL au flacon de travail.</li>
	<li>Laissez le flacon de travail reposer sur la table pendant 10 minutes pour que le sorbant se dépose par gravité.</li>
	<li>Si, après décantation, la couche de sorbant est inférieure à 4 mm, ajoutez plus de boue de sorbant de stock et attendez que le sorbant se dépose pendant encore 10 minutes. REMARQUE: Le flacon de travail préparé est destiné à la préparation de plusieurs colonnes sur des mois. Si le flacon absorbant de travail reste sans agitation pendant plus de 2 h, il doit être tourbillonné pendant 10 s, sonique pendant 10 s et réglé par gravité. Régulièrement, le sorbant est réinsisté le matin avant l’emballage. Ensuite, il est bon d’emballer toute la journée s’il n’y a pas de longues pauses entre l’emballage séquentiel de la colonne. Si le sorbant dans le flacon de travail se dessèche, ajoutez du méthanol et exécutez la procédure de préparation complète du sorbant comme pour le flacon de sorbant de base (étapes 3.2-3.5).</li>
</ol>4. Emballage capillaire dans une bombe sous pression
ATTENTION : Portez toujours des lunettes de protection lorsque vous travaillez avec la bombe à pression. Ne portez pas de gants. Ceux-ci réduisent considérablement le sens du toucher requis pour une manipulation correcte des capillaires de petit diamètre et conduisent à des erreurs.
<ol><li>Placez le flacon absorbant dans la bombe sous pression et fixez bien tous les écrous.</li>
	<li>Démarrez la rotation à 60-100 tr/min.</li>
	<li>Insérez le capillaire émetteur fritté ou tiré dans la bombe: poussez-le tout en bas du flacon, puis soulevez-le de 2 à 3 mm et fixez l’écrou. REMARQUE: Appliquez une force minimale requise pour fixer le capillaire afin d’éviter les dommages capillaires et ferruleux. Le meilleur est le serrage à la main. Si une clé hexagonale est utilisée, appliquez un minimum d’effort suffisant pour le serrage.</li>
	<li>Vérifiez si le capillaire est correctement fixé - il doit être impossible de déplacer le capillaire en le tirant à la main.</li>
	<li>Ouvrez très lentement la soupape de la bombe sous pression tout en gardant l’extrémité ouverte du capillaire pointée loin de votre visage.</li>
	<li>Regardez les premières étapes du processus d’emballage. REMARQUE: Immédiatement après la pressurisation, le sorbant remplit le capillaire et il devient non transparent sur toute la longueur. Dès que le sorbant commence à s’emballer à l’intérieur de l’extrémité distale, la contre-pression augmente, le débit ralentit et la boue de sorbant uniforme à l’intérieur du capillaire se reforme en plusieurs paquets de sorbant séparés par des espaces sans sorbant. Le sorbant déjà emballé est visible comme une région densément colorée en croissance continue.</li>
	<li>Gardez les régions remplies de sorbant à au moins 70% de la longueur capillaire avec de petits espaces libres de sorbant pendant toute la durée du processus d’emballage.</li>
	<li>Il y a plusieurs problèmes courants à surveiller pendant le processus d’emballage, qui nécessitent un ajustement de la configuration en vol pour maintenir une livraison efficace du sorbant dans le capillaire. REMARQUE: Plus de détails sur l’ajustement de l’efficacité de livraison du sorbant sont décrits dans le tableau 3.<ol>
<li>Problème 1: Lorsque le nouveau sorbant cesse d’entrer dans le capillaire alors que le sorbant déjà à l’intérieur continue de bouger, suivez les étapes ci-dessous. REMARQUE: Il s’agit du problème le plus fréquent. Dans la plupart des cas, l’entrée capillaire est bloquée par des amas de sorbants auto-agrégeants. Appliquez les étapes suivantes une par une jusqu’à ce que le flux de sorbant soit rétabli, puis ignorez le reste des étapes liées au problème.<ol>
<li>Augmentez la vitesse de rotation à 500 tr/min et réduisez-la immédiatement à 60-100 tr/min. Habituellement, il restaure le flux de sorbant. Vérifiez que la vitesse de rotation est d’au moins 60 tr/min pour le reste du processus d’emballage.</li>
			<li>Si cela ne vous aide pas, évasez brièvement la bombe d’emballage et pressurisez-la immédiatement.</li>
			<li>Si cela n’aide pas ou si le blocage se reproduit, repositionnez le capillaire à l’intérieur de la couche de sorbant. L’absence du sorbant peut être due au fait que l’extrémité ouverte capillaire est soit trop haute au-dessus de la barre magnétique, de sorte que l’extrémité de la colonne ne la touche pas, soit au fait que le capillaire adhère au fond du flacon. Tout d’abord, évaz complètement la bombe, desserrez l’écrou, poussez le capillaire vers le bas, puis tirez-le de 2 mm en arrière. Fixez l’écrou.</li>
			<li>Si le blocage persiste, évaz le système, retirez le flacon absorbant et le vortex et soniquez-le une fois de plus. Vérifiez que l’extrémité frontale capillaire n’est pas endommagée au microscope et coupez ~ 5 mm de l’extrémité avant si nécessaire.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Problème 2: Lorsque le sorbant ne remplit qu’une petite partie du capillaire avec de longues régions vides, suivez les étapes ci-dessous.<ol>
<li>Vérifiez la vitesse de rotation. Si la rotation est trop lente, la rupture de la coupole n’est pas assez efficace. Augmentez la vitesse de rotation à ~150 tr/min.</li>
			<li>Si la rotation est trop rapide, le sorbant est remis en service dans le plus grand volume du flacon et la concentration locale de sorbant autour de l’entrée de la colonne est faible. Ralentissez la vitesse de rotation jusqu’à 60-100 tr / min.</li>
			<li>Vérifiez le niveau de sorbant. Le même problème avec peu de sorbant à l’intérieur du capillaire est observé lorsqu’il n’y a pas assez de sorbant dans le flacon. Lorsque le sorbant est épuisé, remplissez le flacon avec le nouveau sorbant pour maintenir la couche de sorbant d’au moins 4 mm de haut après la décantation induite par la gravité.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Continuez à emballer la colonne jusqu’à ce que la longueur de colonne cible plus 5-7 cm soit atteinte.</li>
	<li>Arrêtez la rotation et dépressurisez très lentement la bombe.<ol>
<li>Ouvrez un peu la valve de la bombe et attendez que la bulle éclate à l’intérieur de la bouteille d’eau pour s’apaiser. Ensuite, ouvrez la vanne un peu plus large et attendez à nouveau que la bulle éclate pour ralentir.</li>
		<li>Relâchez la pression par incréments jusqu’à ce qu’aucun gaz ne sorte de la vanne. REMARQUE: N’ouvrez pas la valve tout à la fois - cela entraînera un bouillonnement à l’intérieur du capillaire et le sorbant retournera dans le flacon. Si cela se produit, pressurisez la bombe en arrière et attendez que la colonne soit à nouveau emballée.</li>
	</ol></li>
	<li>Lorsque le gaz cesse de sortir de la vanne d’aération, retirez le capillaire emballé de la bombe sous pression. REMARQUE: Ne laissez pas la colonne sécher. S’il n’est pas immédiatement connecté au système HPLC pour un emballage ultérieur, stockez le capillaire emballé en le submergeant dans son ensemble dans une solution EtOH à 10%. Un récipient de stockage d’aliments en polypropylène étanche aux liquides peut être utilisé pour le stockage capillaire. Les colonnes HPLC déconnectées sont stockées de la même manière.</li>
	<li>Si aucun autre emballage n’est prévu, retirez le flacon de sorbant de la bombe et fermez-le hermétiquement. Conservez-le pour un emballage ultérieur de la colonne.</li>
</ol>5. Emballage dans la colonne HPLC
<ol><li>Connectez le capillaire emballé au système HPLC via une connexion HPLC.</li>
	<li>Démarrer le débit à 95% de solvant B (80 ou 100% acétonitrile, 0,1% d’acide formique (AF)) en ciblant une pression de 250-300 bars. Pour les capillaires emballés de 40 cm, utilisez le débit de 200-300 nL / min. REMARQUE: Le débit d’emballage est de 200 nL / min pour une colonne de 40 à 50 cm avec un ID de 100 μm emballé avec un sorbant de 2 μm. D’autres tailles de colonne sont répertoriées dans le tableau 4. Les débits pour les autres longueurs de colonne et les autres indices sont estimés à partir de la proportionnalité directe entre la contre-pression et la longueur et la section transversale de la colonne. Le débit exact est ajusté à la longueur réelle emballée, qui est par défaut plus longue que la longueur de colonne ciblée. Notez également que la pression de 300 bars cible la limite de pression physique de la connexion HPLC. Pour les raccords à pression plus élevée, des débits plus élevés jusqu’à la limite de pression de raccordement doivent être utilisés pour un emballage plus rapide.</li>
	<li>Surveillez le sorbant lâche à l’intérieur du capillaire qui s’emballe et s’ajoute à la longueur totale emballée.</li>
	<li>Sans arrêter l’écoulement, trempez le corps de la colonne deux fois dans le bain de sonication. REMARQUE: Ne pas immerger les extrémités de colonne et les connexions capillaires - seulement une partie du corps de la colonne. L’étape de sonication permet d’améliorer la reproductibilité des colonnes, en particulier pour les colonnes extrêmement longues >50 cm de long (données non publiées); cependant, il ajoute une chance aléatoire de casser la fritte sorbante auto-assemblée à l’intérieur de l’extrémité émettrice du capillaire émetteur tiré et de bloquer complètement la colonne. Bien que la sonication puisse être universellement appliquée à toutes les colonnes frites de verre, nous suggérons de soniquer les colonnes émettrices tirées uniquement pour la longueur > colonne de 50 cm.</li>
	<li>Lorsque le lit absorbant cesse de rétrécir, plongez le corps de la colonne dans le bain de sonication deux fois plus sans arrêter le flux.</li>
	<li>Exécutez la colonne pendant 10 minutes supplémentaires à 300 barres.</li>
	<li>Arrêtez le débit, attendez que la pression descende en dessous de trois bars et déconnectez la colonne.</li>
	<li>Inspectez visuellement la colonne pour l’absence de trous et de décolorations. S’il y en a, la sonication sous l’écoulement peut être répétée. Pour les expériences critiques, envisagez de créer une nouvelle colonne.</li>
	<li>Coupez la colonne à la longueur souhaitée. REMARQUE: Une coupe correctement effectuée est une condition préalable à l’efficacité de la colonne. Faites une encoche dans le revêtement en polyimide avec le scribe, fissurez partiellement le capillaire et séparez deux morceaux.</li>
	<li>Polir l’extrémité avant de la colonne sur une plaquette en céramique ou avec un film de rodage.</li>
	<li>Reconnectez la colonne au système LC à l’aide d’une connexion UHPLC.</li>
	<li>Démarrez le débit de travail à 2% B en fonction de l’ID de colonne selon le tableau 4. Attendez que la pression s’équilibre et vérifiez la contre-pression de la colonne. REMARQUE: Le débit de travail est ajusté en fonction des paramètres de la colonne. Par exemple, une colonne ID de 100 μm de 30 cm de long est exécutée à 500 nL/min.</li>
	<li>Assurez-vous que la contre-pression est à moins de 5% de la valeur attendue (voir tableau 5), Cela confirme que la colonne est correctement emballée et prête à l’emploi. REMARQUE: La contre-pression de colonne est la pression totale dans le canal de gradient du système HPLC avec la colonne connectée moins la contre-pression des capillaires avant la colonne. Dans le même temps, les valeurs du tableau 5 sont arbitraires (elles donnent une échelle arbitraire de ce à quoi s’attendre). La similitude intra-laboratoire de la contre-pression d’une colonne à l’autre est un indicateur plus important que tout fonctionne correctement. La contre-pression absolue réelle dépend de nombreux paramètres, tels que la taille et les caractéristiques du sorbant, l’ID capillaire, le fabricant et le lot, la forme de l’extrémité de l’émetteur tiré ou la densité et la longueur de la fritte de verre, les caractéristiques du solvant et la température ambiante dans la pièce, etc. Si la contre-pression est trop élevée, voir le tableau 1 pour les problèmes possibles.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shishkova, E., Hebert, A. S., Now Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Now,+more+than+ever,+proteomics+needs+better+chromatography.">Now, more than ever, proteomics needs better chromatography.</a> Cell Systems. 3 (4), 321-324 (2016).</li><li>Shliaha, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle-down+proteomic+analyses+with+ion+mobility+separations+of+endogenous+isomeric+proteoforms.">Middle-down proteomic analyses with ion mobility separations of endogenous isomeric proteoforms.</a> Analytical Chemistry. 92 (3), 2364-2368 (2020).</li><li>. Pressure injection cells - next advance - laboratory instruments Available from: <a target="_blank" href="https://www.nextadvance.com/pressure-injection-cells-lc-ms-capillary-column-packing-loader/?target=Overview">https://www.nextadvance.com/pressure-injection-cells-lc-ms-capillary-column-packing-loader/?target=Overview</a> (2021)</li><li>Kovalchuk, S. I., Jensen, O. N., Rogowska-Wrzesinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlashPack:+Fast+and+simple+preparation+of+ultrahigh-performance+capillary+columns+for+LC-MS.">FlashPack: Fast and simple preparation of ultrahigh-performance capillary columns for LC-MS.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 18 (2), 383-390 (2019).</li><li>MacNair, J. E., Lewis, K. C., Jorgenson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh-pressure+reversed-phase+liquid+chromatography+in+packed+capillary+columns.">Ultrahigh-pressure reversed-phase liquid chromatography in packed capillary columns.</a> Analytical Chemistry. 69 (6), 983-989 (1997).</li><li>Bruns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slurry+concentration+effects+on+the+bed+morphology+and+separation+efficiency+of+capillaries+packed+with+sub-2+&#181;m+particles.">Slurry concentration effects on the bed morphology and separation efficiency of capillaries packed with sub-2 &#181;m particles.</a> Journal of Chromatography. A. 1318, 189-197 (2013).</li><li>Godinho, J. M., Reising, A. E., Tallarek, U., Jorgenson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+high+slurry+concentration+and+sonication+to+pack+high-efficiency,+meter-long+capillary+ultrahigh+pressure+liquid+chromatography+columns.">Implementation of high slurry concentration and sonication to pack high-efficiency, meter-long capillary ultrahigh pressure liquid chromatography columns.</a> Journal of Chromatography. A. 1462, 165-169 (2016).</li><li>Andrzejczak, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+phytoglobin+overexpression+on+the+plant+proteome+during+nonhost+response+of+barley+(Hordeum+vulgare)+to+wheat+powdery+mildew+(Blumeria+graminis+f.+sp.+tritici).">The effect of phytoglobin overexpression on the plant proteome during nonhost response of barley (Hordeum vulgare) to wheat powdery mildew (Blumeria graminis f. sp. tritici).</a> Scientific Reports. 10 (1), 9192 (2020).</li><li>Elchaninov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+transcriptome,+proteome,+and+miRNA+profile+of+kupffer+cells+and+monocytes.">Comparative analysis of the transcriptome, proteome, and miRNA profile of kupffer cells and monocytes.</a> Biomedicines. 8 (12), 627 (2020).</li><li>Babenko, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Draft+genome+sequences+of+Hirudo+medicinalis+and+salivary+transcriptome+of+three+closely+related+medicinal+leeches.">Draft genome sequences of Hirudo medicinalis and salivary transcriptome of three closely related medicinal leeches.</a> BMC Genomics. 21 (1), 331 (2020).</li><li>Babenko, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+unusual+peptides+with+new+Cys+frameworks+in+the+venom+of+the+cold-water+sea+anemone+Cnidopus+japonicus.">Identification of unusual peptides with new Cys frameworks in the venom of the cold-water sea anemone Cnidopus japonicus.</a> Scientific Reports. 7 (1), 14534 (2017).</li><li>Loughran, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusually+efficient+CUG+initiation+of+an+overlapping+reading+frame+in+POLG+mRNA+yields+novel+protein+POLGARF.">Unusually efficient CUG initiation of an overlapping reading frame in POLG mRNA yields novel protein POLGARF.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (40), 24936-24946 (2020).</li><li>Radzisheuskaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT5+methylome+profiling+uncovers+a+direct+link+to+splicing+regulation+in+acute+myeloid+leukemia.">PRMT5 methylome profiling uncovers a direct link to splicing regulation in acute myeloid leukemia.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (11), 999-1012 (2019).</li><li>Rubtsova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+encoded+in+human+telomerase+RNA+is+involved+in+cell+protective+pathways.">Protein encoded in human telomerase RNA is involved in cell protective pathways.</a> Nucleic Acids Research. 46 (17), 8966-8977 (2018).</li><li>Maiolica, A., Borsotti, D., Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-made+frits+for+nanoscale+columns+in+proteomics.">Self-made frits for nanoscale columns in proteomics.</a> PROTEOMICS. 5 (15), 3847-3850 (2005).</li><li>Ishihama, Y., Rappsilber, J., Andersen, J. S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcolumns+with+self-assembled+particle+frits+for+proteomics.">Microcolumns with self-assembled particle frits for proteomics.</a> Journal of Chromatography. A. 979 (1-2), 233-239 (2002).</li><li>Shishkova, E., Hebert, A. S., Westphall, M. S., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+pressure+(&gt;30,000+psi)+packing+of+capillary+columns+enhancing+depth+of+shotgun+proteomic+analyses.">Ultra-high pressure (&gt;30,000 psi) packing of capillary columns enhancing depth of shotgun proteomic analyses.</a> Analytical Chemistry. 90 (19), 11503-11508 (2018).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

L’emballage interne des colonnes capillaires est très populaire dans les grands laboratoires travaillant sur plusieurs projets indépendants. Cependant, une méthode d’emballage courante à partir d’une suspension de sorbant à faible concentration a des limites majeures dans la vitesse et est incapable de produire de longues colonnes UHPLC.
FlashPack est une modification de la procédure d’emballage standard qui rend possible l’emballage à partir d’une concentration de sorbant très élevée. La base théorique de la méthode réside dans la déstabilisation continue de la coupole sorbante à l’entrée de la colonne pendant toute la durée d’emballage. Ce dernier est techniquement obtenu par l’entrée de la colonne étant continuellement frappée avec une barre magnétique. La méthode de déstabilisation de la coupole est intentionnellement développée pour que la configuration d’emballage soit complètement similaire au processus d’emballage commun, mais l’astuce de FlashPack réside dans les détails de la préparation de la boue absorbante, du positionnement capillaire et de l’utilisation de la barre magnétique pendant le processus d’emballage.
La boue sorbante est préparée sous forme de couche absorbante de sédiments dans un grand volume de solvant. Il est intéressant de noter que l’emballage à base de bombe sous pression ne nécessite pas les mêmes conditions d’emballage pour une colonne à l’autre. Dans FlashPack, nous ne connaissons jamais la concentration exacte de boue sorbante autour de l’entrée de la colonne. Il est impossible de mesurer et de contrôler exactement, car il change également pendant le processus d’emballage. Cependant, les colonnes finales sont encore très reproductibles4 quelle que soit la façon dont l’emballage a été réalisé.
La base de l’emballage rapide réside dans la déstabilisation efficace de la coupole sorbante. Pour cette raison, il est important de contrôler l’entrée du sorbant dans le capillaire et de maintenir les conditions optimales de déstabilisation de la coupole pendant toute la durée d’emballage. Il existe plusieurs problèmes possibles qui pourraient empêcher une administration efficace du sorbant. Quelques exemples de ceux-ci sont la résuspension de la couche sorbante par rotation rapide de la barre magnétique, la déstabilisation inefficace de la coupole due soit à un mauvais positionnement relatif de la barre magnétique, soit à une rotation trop lente de la barre magnétique. Les questions elles-mêmes et la façon dont elles doivent être abordées sont discutées en détail dans la section du protocole.
Une fois la colonne emballée, le paramètre de colonne principal à vérifier est la contre-pression de la colonne. Les valeurs de pression indiquées dans le tableau 5 fournissent un point de référence pour ce qui est attendu pour l’un des sorbants populaires de taille inférieure à 2 μm de taille de bille-ReproSil PUR C18 AQ (1,9 μm). Dans le même temps, une contre-pression supplémentaire peut être ajoutée par la fritte ou un émetteur trop étroitement tiré et il faut surveiller constamment cela. Si l’emballage est effectué dans un émetteur tiré, nous suggérons toujours de mesurer la contre-pression de colonne attendue pour le sorbant particulier utilisé en emballant d’abord les capillaires frittés, puis de voir si la fritte auto-assemblée en ajoute trop. Pour tout problème de haute pression, utilisez les directives fournies dans le tableau 1 pour identifier le problème.
D’après notre expérience, une colonne emballée sans décolorations, espaces et avec la contre-pression appropriée fonctionne dans 100% des cas et donne une qualité de séparation proche de ce que l’on peut attendre de la longueur de la colonne et des caractéristiques de sorbant. Une colonne avec des décolorations n’est pas garantie de fonctionner correctement, mais peut tout de même donner des résultats satisfaisants.
La plupart du temps, s’il y a des problèmes avec la qualité de séparation, ils ne proviennent pas de la colonne elle-même, mais plutôt d’autres parties du système de séparation, à savoir les pompes, les solvants ou les connexions. Les connexions post-colonne sont particulièrement potentiellement dangereuses. Une mauvaise connexion avec un volume mort entre l’émetteur et la colonne frittée entraîne un élargissement et un résidu de pic majeurs en raison de débits très faibles en chromatographie capillaire.
Un autre problème important spécifique à l’approche FlashPack est qu’elle utilise beaucoup de sorbants coûteux dans un flacon de boue sorbant fonctionnel. N’oubliez pas que la boue sorbante de FlashPack est destinée à un usage multiple. Prenez soin du sorbant. Évitez l’agitation inutile de barres magnétiques pour réduire le broyage du sorbant - n’oubliez pas d’arrêter la rotation dès que l’emballage est terminé. Et ne laissez pas le flacon de sorbant ouvert dans la bombe sous pression pour éviter le séchage du sorbant. Bien que le sorbant puisse toujours être utilisé après cela, il faut du temps pour refaire la boue de sorbant.
La méthode fonctionne aussi bien pour les capillaires frittés que pour les capillaires à émetteur tiré. Le principe FlashPack augmente le taux d’emballage des pièces d’origine capillaire de 20 à 250 μm (les plus petits et les plus grands n’ont pas été testés). Il est également applicable à tous les sorbants, à la fois poreux et superficiellement poreux, que nous avons pu tester (reflétant que la formation de coupole sorbante à forte concentration de boue sorbante ne se limite pas spécifiquement aux sorbants RP). En outre, les paramètres du solvant affectent clairement l’emballage en fonction de leurs caractéristiques physiques et chimiques. Par exemple, moins d’acétone visqueuse donne un taux d’emballage encore plus élevé que le méthanol à la même pression d’emballage. Cependant, il est également moins polaire que le méthanol et réduit les particules absorbantes qui adhèrent les unes aux autres. L’effet en lui-même empêche la formation de coupole sorbante au début de l’emballage lorsque le débit est encore élevé. Cependant, la réduction de l’interaction des particules absorbantes conduit également à une formation de fritte auto-assemblée moins fiable et à un blocage plus fréquent des extrémités tirées pendant l’emballage. Ainsi, alors que l’acétone est meilleure pour l’emballage des capillaires frittés, elle convient moins aux capillaires à émetteur tiré, le méthanol en tant que solvant de boue étant plus lent mais adapté aux deux types de terminaison. L’emballage à partir d’hexane ou de dichlorométhane (DCM) sont des cas extrêmes de passage de l’acétone à partir de méthanol: ils sont encore moins polaires, ils empêchent donc complètement la formation de coupoles absorbantes, mais ils ne sont pas du tout adaptés à l’emballage à émetteur tiré. En outre, il a été noté que la polarité DCM extrêmement faible conduit à des particules sorbantes collant à la paroi capillaire interne et faisant une couche épaisse sur elle. L’épaisseur de la couche augmente progressivement et des blocs locaux aléatoires se forment, ce qui entraîne la colonne emballée en plusieurs parties séparées par des régions sans sorbant. Un tel effet a été observé pour le sorbant C18 Peptide Aeris.
Un autre problème observé était que le sorbant YMC Triart C18 n’était pas correctement en suspension dans le méthanol, mais formait une sorte de flocons. Cependant, cela ne l’empêche pas d’être emballé avec le FlashPack et de donner une efficacité de séparation très décente (données non publiées). Ainsi, bien qu’il ne soit pas optimal dans certains cas, le méthanol était le solvant le plus universel pour fonctionner pour tous les sorbants et colonnes testés. Il est nécessaire de mentionner que nous n’avons pas encore analysé comment différents solvants de boue affectent l’efficacité de la séparation des colonnes. Dans le même temps, l’efficacité des colonnes emballées à partir de méthanol est déjà complètement égale à celle des colonnes commerciales pour les mêmes sorbants4.
FlashPack n’est pas la seule approche existante pour améliorer le taux d’emballage des colonnes UHPLC. L’emballage rapide à partir d’une concentration élevée de boue sorbante est également possible avec l’utilisation d’un emballage à ultra-haute pression7. L’avantage de FlashPack est qu’il est beaucoup plus simple car il ne nécessite pas de pompes ultra-haute pression spéciales et de bombes sous pression pour la livraison de sorbant et les connexions capillaires. Dans le même temps, il a été démontré que les colonnes emballées à des pressions extrêmes peuvent avoir une efficacité de séparation supérieure à celle des colonnes emballées à basse pression17. Et bien que FlashPack produise des colonnes identiques à celles commerciales utilisées dans la comparaison4, pour lesquelles nous ne connaissons pas la méthode d’emballage, il n’a pas encore été testé comment les colonnes FlashPack résistent aux colonnes emballées à ultra-haute pression.
En résumé, la méthode FlashPack décrite peut être facilement adaptée au protocole d’emballage existant en laboratoire avec quelques ajustements apportés au protocole, tandis que la configuration reste complètement la même. Il accélère l’emballage de la colonne capillaire HPLC à quelques minutes et permet la production de longues colonnes capillaires UHP, ce qui est clairement impossible avec la procédure d’emballage standard. L’économie globale en temps et en argent pour le laboratoire par application de l’approche FlashPack peut être comptée en dizaines de milliers d’euros par an. De plus, la possibilité de produire localement des colonnes capillaires UHP ouvre des possibilités de personnalisation expérimentale impossible avec les produits commerciaux disponibles.

La protéomique moderne est basée sur la spectrométrie de masse couplée à la chromatographie liquide avec la chromatographie nano-flux ultra-haute performance (diamètre interne de la colonne (ID) de 50 à 150 μm) offrant la meilleure vitesse d’analyse et la meilleure sensibilité1. Bien que de nombreuses colonnes capillaires UHPLC commerciales soient disponibles, leur prix représente une part importante du coût des consommables, en particulier lorsque plusieurs projets divers sont exécutés en laboratoire et que la contamination des colonnes spécifiques au projet est un problème fréquent. En outre, l’emballage des colonnes en interne permet l’utilisation de sorbants personnalisés spécifiques à l’expérience (tels que, par exemple, le sorbant polyCAT-A2) et de caractéristiques de colonne non disponibles à l’achat en tant que colonne prête à l’emploi.
Pour faire face à cela, de nombreux laboratoires emballent des colonnes capillaires en interne. Cependant, la procédure d’emballage courante avec une bombe à pression de 100 bars (cellule d’injection de pression)3 est mal adaptée à l’emballage de colonne UHPLC en raison de la contre-pression élevée des sorbants UHPLC inférieurs à 2 μm, ce qui entraîne une réduction spectaculaire du taux d’emballage par rapport aux sorbants HPLC de plus grande taille. Alors que les colonnes UHPLC courtes peuvent encore être emballées très lentement, la fabrication de longues colonnes UHPLC est physiquement impossible4.
L’emballage standard de la colonne capillaire se fait à des pressions relativement basses, jusqu’à 100 bars, et avec une très faible concentration de boue absorbante. Par conséquent, deux directions possibles pour accélérer le processus sont disponibles. Il est possible d’augmenter la pression d’emballage5. Cependant, cela nécessite un équipement spécial et, pratiquement, l’installation d’une nouvelle méthode en laboratoire. Une autre façon est d’augmenter la concentration de boue sorbante6. L’emballage à haute concentration de boue sorbante est décrit en combinaison avec une pression d’emballage ultra-élevée dans une publication précédente7. Cependant, à une pression de 100 bars, qui est utilisée dans la plupart des bombes d’emballage existantes, une concentration plus élevée de sorbant entraîne soit un ralentissement du taux d’emballage, soit un arrêt pur et simple de l’emballage. Il a été récemment démontré que l’effet était dû à un regroupement de sorbants à l’entrée de la colonne, et une simple astuce de déstabilisation de la coupole sorbante en martelant l’entrée de la colonne avec une barre magnétique à l’intérieur d’un flacon de sorbant a été suggérée4. La méthode résultante, nommée FlashPack, utilise la même configuration d’emballage de bombe sous pression de 100 bars. Dans le même temps, des modifications mineures mais critiques dans la procédure d’emballage permettent l’emballage à partir d’une concentration de boue sorbante très élevée et la production de très longues colonnes UHPLC (50 à 70 cm et plus) en moins d’une heure, tandis qu’une colonne courte peut être produite en quelques minutes avec une qualité de séparation égale aux colonnes commerciales des mêmes paramètres4. L’approche FlashPack a déjà été utilisée avec succès dans de multiples projets de protéomique pour la préparation des colonnes capillaires en phase inverse (RP)8,9,10,11,12 , 13,14 et en interaction hydrophile (HILIC)2. 
Nous décrivons ici en détail les modifications nécessaires à l’adaptation de l’approche FlashPack à la procédure standard d’emballage de bombes sous pression de 100 bars.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.59002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Scoring Wafer</td>
			<td>Restek</td>
			<td>20116</td>
			<td>any ceramic wafer is suitable for capillary polishing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-chip bladed scribe</td>
			<td>NewObjective</td>
			<td>Diamond-chip bladed scribe</td>
			<td>recommended for capillary cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fused silica capillary 100 mm ID 375 mm OD</td>
			<td>CM Scientific</td>
			<td>TSP100375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GELoader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30001222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Ultimate3000 RSLCnano</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P2000/F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnet bar 2x5 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z283819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microspatula</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z193216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK ferrule 360 mm</td>
			<td>VICI</td>
			<td>JR-C360NFPK</td>
			<td>use to connect the column to UPLC union</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tip, 1000 uL</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z740095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 1000 uL</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman L P1000L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure bomb</td>
			<td>NextAdvance</td>
			<td>PC-77 MAG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>regulator</td>
			<td>GCE</td>
			<td>Jetcontrol 600 200/103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 mm</td>
			<td>Dr. Maisch</td>
			<td>r13.aq.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 0.5 mL</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AXYST050SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 1.5 mL</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AXYST150SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw caps with O-rings</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AXYSCOC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonication bath</td>
			<td>Elma</td>
			<td>Elmasonic S30 H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>union HPLC</td>
			<td>VICI</td>
			<td>JR-C360RU1PK6</td>
			<td>HPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>union UPLC</td>
			<td>VICI</td>
			<td>JR-C360RU1FS6</td>
			<td>UPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vortex</td>
			<td>BioSan</td>
			<td>V-1plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% (v/v) Formic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.59013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple in-house ultra-high performance capillary column manufacturing with the flashpack approach

La chromatographie liquide capillaire à ultra-haute performance (UHPLC) est actuellement une méthode de choix pour l’étape de séparation des échantillons dans la protéomique à base de LC-MS. Cependant, les colonnes capillaires sont beaucoup moins robustes par rapport à leurs contre-types de débit plus élevés. En raison de la facilité de contamination et de blocage, ils doivent souvent être remplacés. Cela en fait une partie nettement coûteuse du coût total de l’analyse LC-MS. L’emballage interne des colonnes capillaires UHPLC permet d’économiser beaucoup d’argent et de personnaliser. Cependant, la procédure d’emballage standard dans la bombe sous pression de 100 bars ne fonctionne bien que pour les colonnes HPLC, mais est trop lente pour les sorbants UHPLC. Nous fournissons ici une description d’un protocole FlashPack optimisé appliqué à la même configuration de bombe sous pression de 100 bars. La méthode est basée sur l’emballage à partir de boue à concentration de sorbant ultra-élevée et est développée pour la fabrication en interne de colonnes capillaires UHPLC de longueur illimitée dans un délai raisonnable.

L’approche FlashPack est basée sur la configuration d’emballage standard et suit le même pipeline d’emballage. L’emballage se fait dans des capillaires émetteurs frittés ou tirés standard. L’optimisation principale réside dans la concentration de boue de sorbant : la méthode standard est incompatible avec une suspension de sorbant hautement concentrée utilisée dans FlashPack. Le résultat est une méthode de production rapide pour les longues colonnes UHPLC, par exemple, une colonne emballée pour 50 cm de longueur avec 1,9 μm de sorbant en moins de 1 h(Figure 2).
Pour démontrer l’application de l’approche FlashPack, une colonne capillaire ID de 30 cm 100 μm a été préparée (Tableau 6). L’emballage du sorbant ReprosilPur C18 de 1,9 μm a été effectué à 60 bars dans un capillaire d’émetteur tiré ID de 50 cm de long et 100 μm, préparé par un arracheur laser P2000. Le capillaire a été emballé à ~ 40 cm en 40 minutes avec un peu plus de sorbant lâche laissé à l’intérieur du capillaire. Le capillaire emballé a été connecté à un système HPLC et fonctionnait à 300 nL / min avec du solvant B (80% d’acétonitrile, 0,1% DE FA). Après deux tours de sonication de 5 s, la longueur finale emballée était de 43 cm. La colonne a été déconnectée, coupée à 30 cm et connectée au système HPLC à l’aide d’une connexion UHPLC. Nous utilisons régulièrement une ferrule d’écrou en PEEK sans manchon de 360 μm et une union en acier inoxydable de 360 μm. Cette combinaison peut contenir au moins jusqu’à 700 barres si elle est fortement serrée. La colonne fabriquée a une contre-pression de 520 bars à 2% de solvant B à 500 nL / min, ce qui est conforme à la plage de valeurs attendue (Tableau 5).
Pour démontrer l’efficacité de la colonne, nous avons utilisé la colonne fabriquée de 30 cm pour séparer 50 fmol d’un digeste tryptique de la protéine C du cytochrome C dans un gradient de 15 min de 2% à 50% B. Les chromatogrammes ioniques extraits ont montré que les pics étaient très symétriques avec une queue minimale. Le FWHM moyen était d’environ 3 s (Figure 3).
Tableau 1 : Dépannage de la contre-pression de travail élevée de la colonne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table1_HighColPressurev2.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 2 : Programme d’attraction laser P2000/F. Programme d’attraction laser P2000/F pour la préparation de capillaires émetteurs tirés à partir de 360 μm OD 100 μm ID capillaires enduits de polyimide de silice fondue sans revêtement interne à des températures ambiantes de 23 à 25 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table2_P2000F%20laser%20puller%20program.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 3 : Problèmes d’emballage spécifiques à FlashPack et points de contrôle à contrôler pendant le processus d’emballage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table3_sorbentDeliveryIssuesss.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 4 : Exemples de débits d’emballage et de travail pour différents D’ENTREI et longueurs de colonne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table4%20Exemplary%20packing%20and%20working%20flow%20rates.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 5 : Contre-pression attendue pour une colonne remplie desorbants sphériques de 2 μ m et fonctionnant au débit de travail (selon l’ID de colonne) dans le système de solvant RP à RT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table5_Expected%20backpressure.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 6 : Emballage exemplaire de colonne UHPLC de 30 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table6_Exemplary%20packing%20of%2030%20cm%20UHPLC%20columnv2.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig01.jpg"> Figure 1: Schéma d’emballage de la colonne capillaire. Les étapes 1 à 3 sont préparatoires, suivies de l’emballage de bombes sous pression et terminées par l’emballage HPLC. Les étapes 3 et 4 sont modifiées pour le protocole FlashPack ultra-efficace. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig02.jpg"> Figure 2: Taux d’emballage pour un ID capillaire fritté de 100 μm avec ReprosilPur C18 AQ 1,9 μm à 100 bars dans du méthanol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig03.jpg"> Figure 3: Chromatogrammes ioniques extraits de peptides tryptiques du cytochrome C. Chromatogrammes ioniques extraits de peptides tryptiques du cytochrome C après séparation de 50 fmol dans une colonne capillaire d’émetteur tirée de 100 mm ID de 30 cm de long emballée avec ReprosilPur C18 AQ 1,9 μm dans un gradient de tampon B (80% acétonitrile, 0,1% FA) et dans le tampon A (2% acétonitrile, 0,1% FA) de 2% à 40% B en 15 min à 500 nL / min à RT. La détection a été effectuée à l’aide d’un spectromètre de masse. Les intensités absolues et les plages m/z extraites pour chaque peptide sont indiquées à droite des spectres. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach at JoVE.com

Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach

Nous présentons ici un protocole pour la procédure d’emballage optimisée des colonnes capillaires FlashPack. L’application d’un protocole optimisé à une configuration commune de bombe sous pression de 100 bars permet un emballage et une fabrication 10 fois plus rapides de longues colonnes capillaires ultra-haute performance.

Fabrication simple de colonnes capillaires ultra-haute performance en interne avec l’approche FlashPack

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. ...

Fabrication simple de colonnes capillaires ultra-haute performance en interne avec l’approche FlashPack. L’objectif de cette procédure est d’introduire un protocole optimisé pour un emballage rapide et facile de colonne capillaire ultra haute performance pour l’analyse protéomique LC-MS. La protéomique moderne est basée sur la spectrométrie de masse couplée à la chromatographie liquide capillaire ultra-haute performance.La séparation peptidique se fait principalement dans des colonnes capillaires d’un diamètre interne de 75 micromètres. Au même niveau que les produits commerciaux, il est possible de préparer des colonnes capillaires en interne. Les colonnes préparées sur mesure présentent des qualités de séparation similaires aux analogies commerciales, tout en économisant beaucoup d’argent et en permettant la personnalisation de la taille des sorbants et des colonnes.Nous démontrons ici une procédure d’emballage optimisée pour la fabrication interne de colonnes capillaires, que nous appelons FlashPack. L’idée derrière l’optimisation est d’emballer à partir d’une concentration de boue de sorbant très élevée, tout en utilisant la même configuration d’emballage de bombe sous pression de 100 bars. Cela nécessite une rupture continue des amas de sorbants, qui se forment autour de l’entrée de la colonne à une concentration élevée de sorbant et empêchent le nouveau matériau sorbant d’entrer dans le capillaire.Techniquement, nous y parvenons en utilisant une barre magnétique comme marteau, en chauffant et en se déplaçant constamment autour du capillaire à l’intérieur du fil absorbant. FlashPack correctement appliqué augmente le taux d’emballage jusqu’à 10 fois. Cela le rend approprié pour emballer des sorbants ultra haute performance de taille micro metricbeat plus douce et pour fabriquer de très longues colonnes jusqu’à une longueur d’un mètre dans des délais raisonnables.La procédure de préparation des colonnes se compose de cinq étapes. Trois étapes préparatoires, qui comprennent l’assemblage de la station d’emballage et la préparation de la boue capillaire et sorbante. Ensuite, le capillaire est d’abord emballé dans la bombe sous pression à une pression de 60 à 100 bars.Il est suivi par la connexion du capillaire emballé au système HPLC, l’emballage du sorbant à haute pression et la coupe de colonne à la taille. La procédure FlashPack nécessite que des modifications soient apportées aux étapes trois et quatre du protocole commun. Tout d’abord, nous préparons une station d’emballage.Il se compose d’un réservoir d’azote gazeux avec une pression de sortie d’au moins 50 bars. Le réservoir est connecté à la vanne d’aération de la bombe sous pression, qui est placée dans l’agitateur magnétique. La sortie de la vanne d’aération est insérée dans une bouteille d’eau par un capillaire ÉTROIT ID PEEK, ce qui permet un contrôle fin de la dépressurisation.Ensuite, nous préparons un capillaire. L’emballage peut être fait soit dans un capillaire fritté avec une fritte de verre intégrée formée de Kasil et de formamide. Une autre option consiste à emballer dans un capillaire tiré préparé par un arracheur laser sutter.Le capillaire doit être allongé de 10 à 15 centimètres par la longueur de colonne prévue. La vidéo suivante est préparée sur l’exemple d’un emballage capillaire à émetteur tiré. Protégez une extrémité d’émetteur tirée avec une pointe de pipette à chargement de gel coupé.Pour plus de détails, voir la version texte du manuscrit. L’étape suivante est la préparation de la boue sorbante. Tout d’abord, mettez environ 50 milligrammes de sorbant sec dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre.Ce sera un flacon de sorbant de stock. Cette vidéo a été préparée avec l’utilisation du sorbant micrométrique Reprosil Pur C18 AQ 1.9 de Dr.Maisch. Ajouter un millilitre de méthanol dans le flacon de sorbant de base.Vortex pendant 10 secondes. Et soniquez dans un bain de sonication pendant encore 10 secondes. Laissez le sorbant bien tremper pendant 20 à 30 minutes, puis vortexez et soniquez-le une fois de plus.Préparez un flacon de sorbant fonctionnel. Il doit s’agir d’un flacon à fond conique qui s’insère dans la bombe. Il peut s’agir d’un autre tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre ou de tout autre flacon en fonction de la conception particulière de la bombe sous pression.Nous utilisons un tube à bouchon à vis conique à jupe coupé à la hauteur de la bombe sous pression. Re-suspendez le sorbant dans le flacon de sorbant de stock et transférez 500 microlitres dans le flacon de sorbant de travail avec une barre magnétique de deux par trois millimètres de taille. Garnir le flacon de travail à un millilitre avec du méthanol.Laissez le flacon de travail reposer sur la table pendant 10 minutes pour que le sorbant se dépose par gravité. Le résultat de cette étape doit être un flacon de fond conique avec la couche inférieure de sorbant lâche d’environ quatre millimètres de haut. Si la couche est trop basse, et un peu plus de sorbant du flacon de stock.Ainsi, le flacon de travail préparé est destiné à la préparation de plusieurs colonnes sur une période de plusieurs mois. Si le flacon absorbant de travail reste sans agitation pendant plus de deux heures, il doit être tourbillonné, soniqué et déposé à nouveau par gravité avant l’emballage. Lorsque tout est préparé, passez à la quatrième étape, en emballant la bombe sous pression.Portez toujours des lunettes de protection lorsque vous travaillez avec des capillaires de silice fondue et la bombe à pression. Dans le même temps, les gants de protection ne sont pas recommandés. Ils réduisent considérablement le sens du toucher requis pour une manipulation correcte des capillaires de petit diamètre et conduisent à des erreurs.Placez le flacon absorbant dans la bombe à pression et fixez hermétiquement tous les nœuds. Commencez la rotation à 60 à 100 coups par minute, Insérez le capillaire émetteur fritté ou tiré dans la bombe. Poussez-le tout en bas du flacon, puis soulevez-le de deux à trois millimètres et fixez le nœud.Appliquez la force minimale requise pour fixer le capillaire. Vérifiez que le capillaire est correctement fixé. Il doit être impossible de déplacer le capillaire en le tirant à la main.Très lentement, ouvrez la soupape de la bombe sous pression tout en gardant l’extrémité ouverte du capillaire pointée loin de votre visage. Regardez les premières étapes du processus d’emballage. Immédiatement après la pressurisation, le sorbant remplit le capillaire et il devient non transparent sur toute la longueur.Dès que le sorbant commence à s’emballer à l’intérieur de l’extrémité distale, la contre-pression augmente, le débit ralentit et la boue de sorbant uniforme à l’intérieur du capillaire se reforme en plusieurs paquets de sorbant, séparés par des espaces libres de sorbant. Le sorbant déjà emballé est visible comme une région densément colorée en croissance continue. Gardez les régions remplies de sorbant à au moins 70% de la longueur capillaire avec de petits espaces sans sorbant pendant toute la durée du processus d’emballage.Il y a plusieurs problèmes courants à surveiller pendant le processus d’emballage. Ils nécessitent un ajustement de la configuration en vol pour maintenir une livraison efficace de sorbant dans le capillaire. Le problème le plus fréquent est lorsque le nouveau sorbant cesse d’entrer dans le capillaire alors que le sorbant déjà à l’intérieur continue de bouger.Dans la plupart des cas, l’entrée capillaire est bloquée par des amas de sorbants auto-agrégeants. Appliquez ces étapes une par une jusqu’à ce que le flux de sorbant soit rétabli, puis ignorez le reste des étapes liées au problème. Augmentez la vitesse de rotation à 500 tours par minute et réduisez-la immédiatement à 60 tr/ min.La plupart du temps, il restaure le flux de sorbant. Vérifiez que la vitesse de rotation est d’au moins 60 tr/ min pour le reste du processus d’emballage. Si cela ne vous aide pas, évasez brièvement la bombe d’emballage et pressurisez-la immédiatement.Si cela n’aide pas, ou si le blocage se reproduit, repositionnez le capillaire à l’intérieur de la couche de sorbant. L’absence du sorbant peut être due au fait que l’extrémité ouverte capillaire est soit trop haute au-dessus de la barre magnétique, de sorte que l’extrémité de la colonne ne la touche pas. Ou le capillaire est positionné trop bas et colle dans le fond du flacon.Tout d’abord, évaz complètement la bombe, puis desserrez l’écrou, poussez le capillaire vers le bas, puis tirez-le de deux millimètres en arrière. Fixez l’écrou. Ouvrez la vanne pour pressuriser la bombe et continuez à emballer.Plus de détails sur les problèmes d’emballage sont décrits dans la version texte de la méthode. Continuez à emballer la colonne jusqu’à ce que la longueur de colonne cible plus cinq à sept centimètres soit atteinte. Arrêtez la rotation et dépressurisez très lentement la bombe.Ouvrez un peu la valve de la bombe et attendez que la bulle éclate à l’intérieur de la bouteille d’eau pour s’apaiser. Ensuite, ouvrez la vanne un peu plus large et attendez à nouveau que la bulle éclate pour ralentir. Ainsi, par étapes progressives, relâchez la pression jusqu’à ce qu’aucun gaz ne sorte de la vanne.N’ouvrez pas la vanne d’un seul coup. Cela entraînera un bouillonnement à l’intérieur du capillaire et le sorbant retournera dans le flacon. Si cela se produit, pressurisez la bombe en arrière et attendez que la colonne soit à nouveau emballée.Lorsque le gaz cesse de sortir de la vanne d’aération, retirez le capillaire emballé de la bombe sous pression. Ne laissez pas la colonne sécher. S’il n’est pas immédiatement connecté au système HPLC pour un emballage ultérieur, mettez le capillaire emballé en stockage en le submergeant entier dans une solution d’éthanol à 10%.Les colonnes HPLC déconnectées sont stockées de la même manière. Si aucun autre emballage n’est prévu pour aujourd’hui, retirez le flacon de sorbant de la bombe et fermez-le hermétiquement. Conservez-le pour plus loin l’emballage de la colonne.Étape cinq, emballage HPLC. Connectez le capillaire emballé au système HPLC via une connexion HPLC. Commencez le flux de solvant organique élevé.Ajustez le débit en fonction de la longueur emballée en ciblant environ 300 bars. Pour les capillaires emballés de 40 centimètres, utilisez le débit de 200 à 300 litres normaux par minute. Surveillez le sorbant en vrac à l’intérieur du capillaire en cours d’emballage, ce qui ajoute à la longueur totale emballée.Sans arrêter l’écoulement, trempez le corps de la colonne deux fois dans le bain de sonication. Il est important de n’immerger qu’une partie du corps de la colonne. Ne pas immerger les extrémités de colonne et les connexions capillaires.Lorsque le lit absorbant cesse de rétrécir, plongez le corps de la colonne dans le bain de sonication deux fois plus sans arrêter le flux. Exécutez la colonne pendant 10 minutes supplémentaires à 300 barres. Arrêtez le débit, attendez que la pression descende en dessous de trois barres et déconnectez la colonne.Inspectez visuellement la colonne pour l’absence de trous et de décolorations. S’il y en a, la sonication sous l’écoulement peut être répétée. Pour les expériences critiques, envisagez de créer une nouvelle colonne.Coupez la colonne à la longueur souhaitée. Une coupe bien faite est une condition préalable à l’efficacité de la colonne. Faites une encoche dans le revêtement en polyamide avec le scribe.Fissurez partiellement le capillaire et séparez deux morceaux. Polir l’avant de la colonne sur une plaquette en céramique ou avec un film de rodage. Reconnectez la colonne au système LC à l’aide d’une connexion ultra haute pression.Démarrez le débit de travail à 2%B. Le débit de travail est ajusté en fonction des paramètres de la colonne. Par exemple, des colonnes d’identification de 100 micromètres sont exécutées à 500 nanolitres par minute.Attendez que la pression s’équilibre et vérifiez la contre-pression de la colonne. Une colonne bien préparée donne une contre-pression proportionnelle à sa longueur et à ses caractéristiques de sorbant. Par exemple, une colonne capillaire de 30 centimètres emballée avec deux micromètres de sorbant a une contre-pression de 450 à 500 bars à 2% de solvant B.Si la colonne produite donne une contre-pression dans la plage attendue, elle est prête à l’emploi.Si la contre-pression est bien en dehors de la plage attendue, quelque chose ne va pas soit avec la colonne, soit avec le système LC. L’emballage avec FlashPack produit un capillaire emballé pour 50 centimètres avec un sorbant de 1,9 micromètre en moins d’une heure à une pression d’emballage de 100 bars. À titre d’exemple, nous produisons une colonne ultra haute pression ID de 30 centimètres 100 micromètres emballée dans un capillaire émetteur tiré avec un sorbant ReprosilPur C18 AQ de 1,9 micromètre.L’emballage a été fait à 60 bars dans un capillaire émetteur tiré de 50 centimètres de long. Le capillaire a été emballé à 40 centimètres en 40 minutes avec un peu plus de sorbant à l’intérieur du capillaire non emballé. Le capillaire emballé a été connecté au système HPLC et fonctionnait à 300 nanolitres par minute avec du solvant B, qui dans notre cas était de 80% d’acétonitrile, 0,1% d’acide formique.La longueur finale emballée était de 43 centimètres. La colonne a été coupée de 30 centimètres. À 500 nanolitres par minute de débit de travail avec 99% de solvant B, la colonne a donné la contre-pression de 275 bars, ce qui est proche de la valeur attendue.Pour tester la colonne, nous avons séparé 50 fmol d’un digeste tryptique de la protéine cytochrome C dans un gradient de 15 minutes de 2 à 50% B. Les pics chromatographiques étaient très symétriques avec une queue minimale. La FWHM moyenne était d’environ trois secondes.Le protocole décrit est capable de produire des colonnes UHPLC dans une configuration d’emballage commune de 100 bars dans un délai raisonnable. Les colonnes HPLC ou UPLC courtes peuvent être emballées en quelques minutes, tandis que les longues colonnes de 30 à 50 centimètres sont emballées en moins d’une heure. La méthode est efficace pour emballer des sorbants avec RP et toute autre chimie dans n’importe quel D’entrée de colonne.Les colonnes produites sont reproductibles aussi efficaces que toute autre colonne commerciale de taille et de paramètres de sorbant similaires.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Examiner Assemblée protéasome avec recombinant Archaeal Protéasomes et dénaturant PAGE: le cas pour une approche combinée

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Recherche

Biochimie

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Electrophorèse Capillaire séparation de l&#39;anticorps monoclonal isoformes Utilisation d&#39;un Capillaire Neutre

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Exemple amélioré Multiplexage de tissus à l&#39;aide combinée Precursor et étiquetage Isotopique isobarique Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Une méthode Simple pour le criblage à haut débit chimique chez Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Analyse de AtHIRD11 désordre intrinsèque et la liaison vers les Ions métalliques par électrophorèse capillaire et l’électrophorèse capillaire affinité

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Une approche personnalisable pour la production et la purification enzymatiques des produits naturels Diterpenoid

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Tache occidentale à très grande vitesse utilisant la technologie d’amélioration de l’immunoréaction

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Un système de purification de protéines à haut débit économique et polyvalent à l’aide d’un adaptateur de plaque multicolonne

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Identification des protéines de liaison des petits ligands avec l’action capillaire radiale différentielle du test de ligand (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Quantification absolue des pyrophosphates d’inositol par spectrométrie de masse par électrophorèse capillaire par ionisation électrospray

Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) are an important group of intracellular signaling molecules. Derived from inositol phosphates (InsPs), these molecules ...