Name: simple in-house ultra-high performance capillary column manufacturing with the flashpack approach
Uploaded: 2021-12-04T14:00:00
Duration: 13 min 36 s
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Die Arbeit wurde durch den RSF-Zuschuss 20-14-00121 unterstützt. Die Autoren danken P. V. Shliaha (Memorial Sloan Kettering Cancer Center) für fruchtbare Diskussionen.

Das Packprotokoll besteht aus fünf Schritten(Abbildung 1):1) Vorbereitung der Packstation, 2) Kapillarvorbereitung, 3) Vorbereitung der Sorptionsschlämme, 4) Kapillarpackung in der Druckbombe und 5) Säulenaufpackung im HPLC-System, Schneiden auf die Größe und UHPLC-Verbindungsinstallation. Die FlashPack-Optimierung erfordert Anpassungen in den Abschnitten 3 und 4 im Vergleich zum gemeinsamen Protokoll.
1. Montage der Packstation
<ol><li>Bereiten Sie einen Gastank vor, der entweder mit Stickstoff, Helium oder Argon gefüllt ist und mit einem einstufigen Gasregler mit einem Ausgangsdruck > 50 bar ausgestattet ist. Der maximale Druck wird durch die Druckbombenkompatibilität begrenzt.</li>
	<li>Schließen Sie den Regler an das Entlüftungsventil der Druckbombe an.</li>
	<li>Wenn die Druckbombe nicht mit einem integrierten Magnetrührer ausgestattet ist, platzieren Sie die Bombe auf einem Magnetrührer.</li>
	<li>Schließen Sie einen schmalen ID-Kunststoffschlauch (z. B. 0,13 mm) an den Entlüftungsauslass der Druckbombe an und legen Sie ihn in einen Behälter mit Wasser.</li>
</ol>2. Kapillarpräparation
<ol><li>Bereiten Sie eine gefrittene Kapillare mit einer integrierten Glasfritte aus Kasil und Formamid15 oder einer gezogenen Emitterkapillare vor, die durch einen Laserzieher16hergestellt wird. Die Kapillare ist 10-15 cm länger als die vorgesehene Säulenlänge. HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für die Erörterung möglicher Probleme im Zusammenhang mit verschiedenen Kapillargrößen und Frittentypen. Tabelle 2 enthält ein Beispiel für ein P2000-Laserzieherprogramm zur Herstellung von Pulled-Emitter-Kapillaren.</li>
	<li>Schützen Sie ein gezogenes Emitterende mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze mit Gelbeladung.<ol>
<li>Schneiden Sie die Spitze so, dass sie eng um die 360 μm OD-Kapillare passt (sie kann entlang der Kapillare bewegt werden, erfordert jedoch einige Anstrengungen).</li>
		<li>Schieben Sie die geschnittene Pipettenspitze aus Richtung des Kapillarvorderendes auf die Kapillare und bewegen Sie sie bis zum Emitterende.</li>
		<li>Schieben Sie die Schutzspitze zurück, wenn die Säule sprüht. Schieben Sie die Spitze nach vorne, um das Emitterende in der Spitze zu haben, wenn die Säule nicht sprüht (auch wenn sich die Säule unter dem Durchfluss befindet, aber immer noch nicht sprüht).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Sorptionsschlämmbereitung
<ol><li>Bereiten Sie eine Durchstechflasche mit Sorptionsmittel vor: Geben Sie ~ 50 mg trockenes Sorptionsmittel in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. Hier wird Reprosil Pur C18 als Beispiel verwendet.</li>
	<li>1 ml Methanol in das Sorptionsröhrchen geben.</li>
	<li>Um es vollständig zu mischen, wirbeln Sie das Rohr für 10 s mit einem Wirbelmischer.</li>
	<li>Beschallung in einem Beschallungsbad für 10 s.</li>
	<li>Lassen Sie das Sorptionsmittel 20-30 min gründlich einweichen. Dann wirbeln Sie es noch einmal und beschallen Sie es.</li>
	<li>Bereiten Sie eine funktionierende Durchstechflasche mit Sorptionsmittel vor. Verwenden Sie eine konische Bodenfläschchen, die in die Bombe passt. HINWEIS: Es kann sich entweder um ein weiteres 1,5-ml-Zentrifugenrohr oder ein anderes Fläschchen handeln, abhängig von der jeweiligen Druckbombenkonstruktion. Für dieses Experiment wird ein konisches unteres Schraubverschlussrohr verwendet, das auf die Höhe der Druckbombe zugeschnitten ist.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Sorptionsmittel in der Durchstechflasche mit Sorptionsmittel und geben Sie 500 μL in die Arbeits-Sorptionsflasche mit einer Magnetstange von 2 x 3 mm Größe.</li>
	<li>Methanol bis zu ~ 1 ml in die Arbeitsflasche geben.</li>
	<li>Lassen Sie das Arbeitsfläschchen 10 Minuten auf dem Tisch stehen, damit sich das Sorptionsmittel durch Schwerkraft absetzt.</li>
	<li>Wenn die Sorptionsschicht nach dem Absetzen unter 4 mm liegt, fügen Sie mehr von der Sorptionsschlämme hinzu und warten Sie, bis sich das Sorptionsmittel für weitere 10 minuten abgesetzt hat. ANMERKUNG: Die vorbereitete Arbeitsfläschchen ist für die Vorbereitung mehrerer Säulen über Monate bestimmt. Wenn die Arbeitssubstechflasche länger als 2 h ohne Rühren bleibt, muss sie 10 s lang gewirbelt, 10 s lang beschallt und durch Schwerkraft abgesetzt werden. Routinemäßig wird das Sorptionsmittel am Morgen vor dem Packen resuspendiert. Dann ist es gut für das Packen für den ganzen Tag, wenn es keine langen Pausen zwischen dem sequentiellen Spaltenpacken gibt. Wenn das Sorptionsmittel in der Arbeitsfläschchen austrocknet, fügen Sie Methanol hinzu und führen Sie das vollständige Sorptionsmittelvorbereitungsverfahren wie bei der Durchstechflasche mit Stammsorbens durch (Schritte 3.2-3.5).</li>
</ol>4. Kapillarpackung in einer Druckbombe
ACHTUNG: Tragen Sie bei der Arbeit mit der Druckbombe immer eine Schutzbrille. Tragen Sie keine Handschuhe. Diese reduzieren den Tastsinn, der für den richtigen Umgang mit Kapillaren mit kleinem Durchmesser erforderlich ist, erheblich und führen zu Fehlern.
<ol><li>Legen Sie die Durchstechflasche in die Druckbombe und befestigen Sie alle Muttern fest.</li>
	<li>Starten Sie die Rotation mit 60-100 U / min.</li>
	<li>Führen Sie die gestreue oder gezogene Emitterkapillare in die Bombe ein: Drücken Sie sie bis zum Boden der Durchstechflasche, heben Sie sie dann 2-3 mm hoch und befestigen Sie die Mutter. HINWEIS: Wenden Sie eine minimal erforderliche Kraft an, um die Kapillare zu fixieren, um Kapillar- und Ferrulenschäden zu vermeiden. Das Beste ist das Anziehen von Hand. Wenn ein Sechskantschlüssel verwendet wird, wenden Sie einen minimalen ausreichenden Kraftaufwand für das Anziehen an.</li>
	<li>Überprüfen Sie, ob die Kapillare richtig fixiert ist - es muss unmöglich sein, die Kapillare zu bewegen, indem Sie sie von Hand herausziehen.</li>
	<li>Öffnen Sie das Druckbombenventil sehr langsam, während Sie das offene Ende der Kapillare vom Gesicht weg zeigen.</li>
	<li>Beobachten Sie die ersten Schritte des Verpackungsprozesses. HINWEIS: Unmittelbar nach der Druckbeaufschlagung füllt das Sorptionsmittel die Kapillare und wird für die gesamte Länge undurchsichtig. Sobald sich das Sorptionsmittel im distalen Ende einzupacken beginnt, nimmt der Gegendruck zu, der Fluss verlangsamt sich und die gleichmäßige Sorptionsschlämme in der Kapillare bildet sich in mehrere Sorptionsmittelpakete um, die durch sorptionsmittelfreie Lücken getrennt sind. Bereits gepacktes Sorptionsmittel ist als dicht gefärbtes, kontinuierlich wachsendes Gebiet sichtbar.</li>
	<li>Halten Sie die mit Sorptionsmittel gefüllten Bereiche während der gesamten Dauer des Verpackungsprozesses mindestens 70% der Kapillarlänge mit kleinen sorbentienfreien Lücken.</li>
	<li>Es gibt mehrere häufige Probleme, die während des Verpackungsprozesses zu beachten sind, die eine Anpassung des Setups während des Fluges erfordern, um eine effiziente Sorptionsmittelabgabe in die Kapillare zu gewährleisten. ANMERKUNG: Weitere Einzelheiten zur Einstellung der Sorptionsmittelabgabeeffizienz sind in Tabelle 3 beschrieben.<ol>
<li>Problem 1: Wenn das neue Sorptionsmittel nicht mehr in die Kapillare gelangt, während sich das bereits im Inneren befindliche Sorptionsmittel weiter bewegt, führen Sie die folgenden Schritte aus. HINWEIS: Dies ist das häufigste Problem. In den meisten Fällen wird der Kapillareingang durch selbstaggregierende Sorptionscluster blockiert. Wenden Sie die folgenden Schritte nacheinander an, bis der Sorptionsmittelfluss wiederhergestellt ist, und überspringen Sie dann die restlichen problembezogenen Schritte.<ol>
<li>Erhöhen Sie die Drehzahl auf 500 U / min und reduzieren Sie sie sofort wieder auf 60-100 U / min. Normalerweise stellt es den Sorptionsmittelfluss wieder her. Überprüfen Sie die Drehzahl für den Rest des Verpackungsprozesses auf mindestens 60 U / min.</li>
			<li>Wenn es nicht hilft, entlüften Sie die Packbombe kurz und setzen Sie sie sofort wieder unter Druck.</li>
			<li>Wenn es nicht hilft oder die Blockierung erneut auftritt, positionieren Sie die Kapillare innerhalb der Sorptionsschicht neu. Das Fehlen des Sorptionsmittels kann darauf zurückzuführen sein, dass das offene Kapillarende entweder zu hoch über der Magnetstange liegt, so dass das Säulenende es nicht berührt, oder dass die Kapillare in den Boden der Durchstechflasche einklebt. Entlüften Sie zuerst die Bombe vollständig, lösen Sie die Mutter, drücken Sie die Kapillare nach unten und ziehen Sie sie dann 2 mm zurück. Befestigen Sie die Mutter.</li>
			<li>Wenn die Blockierung anhält, entlüften Sie das System, nehmen Sie die Durchstechflasche und den Wirbel heraus und beschallen Sie es erneut. Überprüfen Sie das kapillare frontale Ende auf Beschädigungen unter dem Mikroskop und schneiden Sie bei Bedarf ~ 5 mm des vorderen Endes ab.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Problem 2: Wenn das Sorptionsmittel nur einen kleinen Teil der Kapillare mit langen leeren Bereichen füllt, führen Sie die folgenden Schritte aus.<ol>
<li>Überprüfen Sie die Drehzahl. Wenn die Rotation zu langsam ist, ist der Kuppelbruch nicht effizient genug. Erhöhen Sie die Drehzahl auf ~150 U/min.</li>
			<li>Wenn die Rotation zu schnell ist, wird das Sorptionsmittel in das größere Fläschchenvolumen resuspendiert und die lokale Sorptionsmittelkonzentration um den Säuleneingang ist niedrig. Verlangsamen Sie die Drehzahl auf 60-100 U / min.</li>
			<li>Überprüfen Sie den Sorptionsmittelspiegel. Das gleiche Problem mit wenig Sorbens in der Kapillare wird beobachtet, wenn nicht genügend Sorptionsmittel in der Durchstechflasche vorhanden ist. Wenn das Sorptionsmittel aufgebraucht ist, füllen Sie die Durchstechflasche mit dem neuen Sorptionsmittel, um die Sorptionsschicht nach schwerkraftinduziertem Absetzen nicht weniger als 4 mm hoch zu halten.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Packen Sie die Säule weiter, bis die Zielsäulenlänge plus 5-7 cm erreicht ist.</li>
	<li>Stoppen Sie die Rotation und verringern Sie die Bombe sehr langsam.<ol>
<li>Öffnen Sie das Bombenventil ein wenig und warten Sie, bis die Blase in der Wasserflasche platzt. Öffnen Sie dann das Ventil etwas weiter und warten Sie erneut, bis die Blase platzt.</li>
		<li>Geben Sie den Druck in Schritten ab, bis kein Gas mehr aus dem Ventil austritt. HINWEIS: Öffnen Sie das Ventil nicht ganz auf einmal - es führt zu einem Blubbern in der Kapillare und dem Sorptionsmittel, das zurück in die Durchstechflasche gelangt. Wenn das passiert, setzen Sie die Bombe unter Druck und warten Sie, bis die Säule wieder gepackt ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Wenn das Gas nicht mehr aus dem Entlüftungsventil kommt, nehmen Sie die gepackte Kapillare aus der Druckbombe. HINWEIS: Lassen Sie die Säule nicht austrocknen. Wenn sie nicht sofort zur weiteren Verpackung an das HPLC-System angeschlossen sind, lagern Sie die verpackte Kapillare ein, indem Sie sie vollständig in 10% ige EtOH-Lösung tauchen. Ein flüssigkeitsdichter Lebensmittelbehälter aus Polypropylen kann für die Kapillarlagerung verwendet werden. Getrennte HPLC-Säulen werden auf die gleiche Weise gespeichert.</li>
	<li>Wenn keine weitere Verpackung geplant ist, nehmen Sie das Sorptionsmittel aus der Bombe heraus und verschließen Sie es fest. Bewahren Sie es für weitere Säulenverpackungen auf.</li>
</ol>5. Verpackung in der HPLC-Säule
<ol><li>Verbinden Sie die gepackte Kapillare über eine HPLC-Verbindung mit dem HPLC-System.</li>
	<li>Beginnen Sie den Durchfluss mit 95% Lösungsmittel B (80 oder 100% Acetonitril, 0,1% Ameisensäure (FA)) mit einem Druck von 250-300 bar. Für 40 cm gepackte Kapillare verwenden Sie die Durchflussrate von 200-300 nL / min. HINWEIS: Der Packungsdurchfluss beträgt 200 nL/min für eine 40-50 cm Säule mit 100 μm ID, verpackt mit 2 μm Sorbens. Einige andere Spaltengrößen sind in Tabelle 4aufgeführt. Durchflussraten für andere Säulenlängen und IDs werden aus der direkten Proportionalität zwischen dem Gegendruck und der Säulenlänge und dem Querschnitt geschätzt. Die genaue Durchflussmenge wird an die tatsächliche Packlänge angepasst, die standardmäßig länger ist als die angestrebte Spaltenlänge. Beachten Sie auch, dass der Druck von 300 bar auf die physikalische Druckgrenze der HPLC-Verbindung abzielt. Für Verbindungen mit höherem Druck sind höhere Durchflussmengen bis zur Anschlussdruckgrenze für ein schnelleres Packen zu verwenden.</li>
	<li>Achten Sie darauf, dass das lose Sorbens in der Kapillare verpackt und zur Gesamtpacklänge hinzugefügt wird.</li>
	<li>Ohne den Fluss zu stoppen, tauchen Sie den Säulenkörper zweimal in das Beschallungsbad ein. HINWEIS: Tauchen Sie Säulenenden und Kapillarverbindungen nicht ein - nur einen Teil des Säulenkörpers. Der Ultraschallschritt trägt zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit der Säulen bei, insbesondere bei extrem langen Säulen >50 cm Länge (unveröffentlichte Daten); Es fügt jedoch eine zufällige Chance hinzu, die sich selbst zusammensetzende Sorptionsköder fritte innerhalb des Emitterendes der gezogenen Emitterkapillare zu brechen und die Säule vollständig zu blockieren. Während die Beschallung universell auf jede glasbedeckte Säule angewendet werden kann, empfehlen wir, gezogene Emittersäulen nur für die Säulenlänge > 50 cm zu beschallen.</li>
	<li>Wenn das Sorptionsbett aufhört zu schrumpfen, tauchen Sie den Säulenkörper noch zweimal in das Beschallungsbad ein, ohne den Fluss zu stoppen.</li>
	<li>Führen Sie die Säule weitere 10 Minuten bei 300 Balken aus.</li>
	<li>Stoppen Sie den Durchfluss, warten Sie, bis der Druck auf unter drei bar gesunken ist, und trennen Sie die Säule.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Säule visuell auf fehlende Lücken und Verfärbungen. Wenn welche gefunden werden, kann die Beschallung unter der Strömung wiederholt werden. Erwägen Sie für kritische Experimente, eine neue Spalte zu erstellen.</li>
	<li>Schneiden Sie die Spalte auf die gewünschte Länge aus. HINWEIS: Richtig ausgeführtes Schneiden ist eine Voraussetzung für die Säuleneffizienz. Machen Sie eine Kerbe in Polyimidbeschichtung mit dem Schreiber, knacken Sie teilweise die Kapillare und ziehen Sie zwei Stücke auseinander.</li>
	<li>Polieren Sie die Säulenfront auf einem Keramikwafer oder mit Läppfolie.</li>
	<li>Schließen Sie die Säule über eine UHPLC-Verbindung wieder an das LC-System an.</li>
	<li>Beginnen Sie die Arbeitsflussrate bei 2% B in Abhängigkeit von der Spalten-ID gemäß Tabelle 4. Warten Sie, bis sich der Druck ausgeglichen hat, und überprüfen Sie den Säulengegendruck. HINWEIS: Der Arbeitsdurchfluss wird entsprechend den Spaltenparametern angepasst. Beispielsweise wird eine 30 cm lange 100 μm ID-Säule mit 500 nL/min betrieben.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass der Gegendruck innerhalb von 5 % des erwarteten Wertes liegt (siehe Tabelle 5),um zu bestätigen, dass die Spalte ordnungsgemäß gepackt und einsatzbereit ist. HINWEIS: Der Säulengegendruck ist der Gesamtdruck im Gradientenkanal des HPLC-Systems mit angeschlossener Säule abzüglich des Gegendrucks der Kapillaren vor der Säule. Gleichzeitig sind die Werte in Tabelle 5 willkürlich (sie geben eine beliebige Skala dessen an, was zu erwarten ist). Die laborinterne Ähnlichkeit des Gegendrucks von Säule zu Säule ist ein wichtigerer Indikator dafür, dass alles richtig funktioniert. Der tatsächliche absolute Gegendruck hängt von vielen Parametern ab, wie z.B. der Sorptionsmittelgröße und -eigenschaften, der Kapillar-ID, Hersteller und Charge, der Form des gezogenen Emitterendes oder der Dichte und Länge der Glasfritte, den Lösungsmitteleigenschaften und der Umgebungstemperatur im Raum usw. Wenn der Gegendruck zu hoch ist, siehe Tabelle 1 für mögliche Probleme.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die hauseigene Kapillarsäulenpackung ist in großen Labors, die an mehreren unabhängigen Projekten arbeiten, sehr beliebt. Eine übliche Packungsmethode aus einer niedrig konzentrierten Sorptionsmittelsuspension hat jedoch große Einschränkungen in der Geschwindigkeit und ist nicht in der Lage, lange UHPLC-Säulen herzustellen.
FlashPack ist eine Modifikation des Standardverpackungsverfahrens, die das Verpacken ab einer sehr hohen Sorptionsmittelkonzentration ermöglicht. Die theoretische Grundlage der Methode liegt in der kontinuierlichen Sorptionsmittelkuppeldestabilisierung am Säuleneingang über die gesamte Packdauer. Letzteres wird technisch dadurch erreicht, dass der Säuleneingang kontinuierlich mit einer Magnetstange getroffen wird. Die Methode der Kuppeldestabilisierung wurde absichtlich entwickelt, um den Verpackungsaufbau dem üblichen Verpackungsprozess völlig ähnlich zu machen, aber der Trick von FlashPack liegt in den Details der Sorptionsschlammvorbereitung, der Kapillarpositionierung und der Magnetstabverwendung während des Verpackungsprozesses.
Die Sorptionsschlämme wird als Sedimentsorptionsschicht in einem großen Lösungsmittelvolumen hergestellt. Es ist interessant, dass die druckbombenbasierte Packung nicht die gleichen Packungsbedingungen für Kolonne zu Kolonne erfordert. In FlashPack kennen wir nie die genaue Sorptionsschlammkonzentration um den Säuleneingang. Es ist unmöglich, genau zu messen und zu kontrollieren, da es sich auch während des Verpackungsprozesses ändert. Die letzten Säulen sind jedoch immer noch sehr reproduzierbar4, unabhängig davon, wie die Packung erreicht wurde.
Die Basis für die schnelle Verpackung liegt in der effizienten Sorptionsmittelkuppeldestabilisierung. Aus diesem Grund ist es wichtig, das eindringende Sorptionsmittel in die Kapillare zu kontrollieren und die optimalen Kuppeldestabilisierungsbedingungen während der gesamten Packungsdauer aufrechtzuerhalten. Es gibt mehrere mögliche Probleme, die eine effiziente Sorptionsmittelabgabe verhindern können. Einige Beispiele hierfür sind die Resuspension der Sorptionsschicht durch schnelle Magnetstabrotation, eine ineffiziente Kuppeldestabilisierung aufgrund einer falschen relativen Kapillarpositionierung zur Magnetstabpositionierung oder eine zu langsame Magnetstabrotation. Die Probleme selbst und wie sie angegangen werden sollen, werden im Protokollabschnitt ausführlich diskutiert.
Nachdem die Spalte gepackt wurde, ist der wichtigste zu überprüfende Spaltenparameter der Spaltenrückdruck. Die in Tabelle 5 aufgeführten Druckwerte bieten einen Bezugspunkt zu dem, was für eines der beliebten Sorptionsmittel reproSil PUR C18 AQ (1,9 μm) unter 2 μm der Perlengröße erwartet wird. Gleichzeitig kann zusätzlicher Gegendruck durch die Fritte oder einen zu eng gezogenen Emitter hinzugefügt werden, und darauf sollte man ständig achten. Wenn das Packen in einen gezogenen Emitter erfolgt, empfehlen wir dennoch, den erwarteten Säulengegendruck für das jeweilige verwendete Sorptionsmittel zu messen, indem zuerst gefrittene Kapillaren verpackt werden und dann zu sehen, ob die selbstorganisierende Fritte zu viel hinzufügt. Verwenden Sie bei Hochdruckproblemen die Richtlinien in Tabelle 1, um das Problem zu ermitteln.
Nach unserer Erfahrung funktioniert eine gepackte Säule ohne Verfärbungen, Lücken und mit dem richtigen Gegendruck in 100% der Fälle und gibt die Trennqualität nahe an dem, was von der Säulenlänge und den Sorptionseigenschaften erwartet werden kann. Eine Säule mit Verfärbungen funktioniert nicht garantiert richtig, kann aber dennoch zufriedenstellende Ergebnisse liefern.
Wenn es Probleme mit der Trennqualität gibt, kommen sie meistens nicht von der Säule selbst, sondern von anderen Teilen des Trennsystems, nämlich Pumpen, Lösungsmitteln oder Anschlüssen. Besonders potenziell schädlich sind alle Post-Spalten-Verbindungen. Eine schlechte Verbindung mit einem toten Volumen zwischen dem Emitter und der gefrittenen Säule führt aufgrund sehr niedriger Durchflussraten in der Kapillarchromatographie zu einer starken Peakverbreiterung und Tailing.
Ein weiteres wichtiges Problem, das für den FlashPack-Ansatz spezifisch ist, ist, dass es viele teure Sorbentien in einem funktionierenden Sorptionsschlammfläschchen verwendet. Bitte beachten Sie, dass die Sorptionsschlämme in FlashPack für den Mehrfachgebrauch vorgesehen ist. Achten Sie auf das Sorptionsmittel. Vermeiden Sie unnötiges Rühren der Magnetstange, um das Schleifen von Sorptionsmitteln zu reduzieren - denken Sie daran, die Rotation zu stoppen, sobald die Verpackung fertig ist. Und lassen Sie das offene Sorptionsmittelfläschchen nicht in der Druckbombe, um eine Sorptionstrocknung zu vermeiden. Obwohl das Sorptionsmittel danach noch verwendet werden kann, braucht es Zeit, um die Sorptionsschlämme neu zu machen.
Die Methode funktioniert sowohl für gefrittene Kapillaren als auch für Pulled-Emitter-Kapillaren gleichermaßen gut. Das FlashPack-Prinzip erhöht die Packungsrate für Kapillar-IDs von 20 auf 250 μm (kleinere und größere wurden nicht getestet). Es ist auch auf alle Sorbentien anwendbar, sowohl vollständig als auch oberflächlich porös, die wir testen könnten (was zeigt, dass die Sorptionsmittelkuppelbildung in hoher Sorptionsschlammkonzentration nicht speziell auf RP-Sorbentien beschränkt ist). Außerdem beeinflussen Lösungsmittelparameter die Verpackung eindeutig entsprechend ihrer physikalischen und chemischen Eigenschaften. Zum Beispiel ergibt weniger viskoses Aceton eine noch höhere Packungsrate als Methanol bei gleichem Packungsdruck. Es ist jedoch auch weniger polar als Methanol und reduziert Sorptionspartikel, die aneinander haften. Der Effekt allein verhindert die Bildung von Sorptionskapulen zu Beginn der Packung, wenn die Durchflussrate noch hoch ist. Die Verringerung der Wechselwirkung mit Sorptionspartikeln führt jedoch auch zu einer weniger zuverlässigen selbstorganisierenden Frittenbildung und einer häufigeren Pulled-End-Blockierung während der Packung. Während Aceton also besser zum Verpacken von gesrittenen Kapillaren geeignet ist, ist es weniger für Pulled-Emitter-Kapillaren geeignet, wobei das Methanol als Güllelösungsmittel langsamer, aber für beide Arten von Enden geeignet ist. Packungen aus Hexan oder Dichlormethan (DCM) sind extreme Fälle der Umstellung auf Aceton von Methanol: Sie sind noch weniger polar, so dass sie die Bildung von Sorptionskapolen vollständig verhindern, jedoch überhaupt nicht für die Pulled-Emitter-Packung geeignet sind. Außerdem wurde festgestellt, dass eine extrem niedrige DCM-Polarität dazu führt, dass Sorptionspartikel an der inneren Kapillarwand haften bleiben und eine dicke Schicht darauf bilden. Die Schichtdicke wächst allmählich und es bilden sich zufällige lokale Blöcke, was dazu führt, dass die Säule in mehreren Teilen verpackt ist, die durch Regionen ohne Sorptionsmittel getrennt sind. Ein solcher Effekt wurde für das C18-Peptid-Aeris-Sorbens beobachtet.
Ein weiteres beobachtetes Problem war, dass das YMC Triart C18-Sorptionsmittel nicht richtig in Methanol suspendiert wurde, sondern eine Art Flocken bildete. Das hindert es jedoch nicht daran, mit dem FlashPack vollgepackt zu werden und eine sehr anständige Trenneffizienz (unveröffentlichte Daten) zu erzielen. Obwohl Methanol für einige Fälle nicht optimal war, war es das universellste Lösungsmittel, das für alle getesteten Sorbentien und Säulen geeignet war. Es ist notwendig zu erwähnen, dass wir noch nicht analysiert haben, wie sich verschiedene Schlammlösungsmittel auf die Säulenabscheideeffizienz auswirken. Gleichzeitig ist der Wirkungsgrad von aus Methanol gepackten Säulen bereits völlig gleichbedeutend mit handelsüblichen Säulen für die gleichen Sorbentien4.
FlashPack ist nicht der einzige bestehende Ansatz zur Verbesserung der Packrate von UHPLC-Säulen. Eine schnelle Packung aus hoher Sorptionsschlammkonzentration ist auch mit der Verwendung der Ultrahochdruckpackung7möglich. Der Vorteil von FlashPack ist, dass es viel einfacher ist, da es keine speziellen Ultrahochdruckpumpen und Druckbomben für die Sorptionsmittelabgabe und Kapillarverbindungen benötigt. Gleichzeitig wurde gezeigt, dass die säulen, die bei extremen Drücken gepackt sind, eine höhere Abscheideleistung aufweisen können als kolonsierte Kolonnen mit niedrigerem Druck17. Und während FlashPack Spalten produziert, die mit den im Vergleich4verwendeten Spalten identisch sind, für die wir die Verpackungsmethode nicht kennen, wurde noch nicht getestet, wie FlashPack-Säulen gegen Ultrahochdruck-Packsäulen bestehen.
Zusammenfassend lässt sich die beschriebene FlashPack-Methode mit einigen Anpassungen am Protokoll leicht an das bestehende Packprotokoll im Labor anpassen, während das Setup völlig gleich bleibt. Es beschleunigt die Packung der HPLC-Kapillarsäule auf Minuten und ermöglicht die Herstellung langer UHP-Kapillarsäulen, was mit dem Standardverpackungsverfahren schlichtweg unmöglich ist. Die Gesamtwirtschaftlichkeit in Zeit und Geld für das Labor durch die Anwendung des FlashPack-Ansatzes kann in Zehntausenden von Euro pro Jahr gezählt werden. Darüber hinaus eröffnet die Fähigkeit, UHP-Kapillarsäulen lokal herzustellen, die Möglichkeiten der Experimentanpassung, die mit den verfügbaren kommerziellen Produkten unmöglich sind.

Die moderne Proteomik basiert auf der flüssigkeitschromatographisch gekoppelten Massenspektrometrie mit der ultrahochleistungsstarken Nano-Flow-Chromatographie (50-150 μm Säuleninnendurchmesser (ID)) Trennung, die die beste Analysegeschwindigkeit und Sensitivität bietet1. Während zahlreiche kommerzielle UHPLC-Kapillarsäulen verfügbar sind, macht ihr Preis einen großen Teil der Verbrauchsmaterialkosten aus, insbesondere wenn mehrere verschiedene Projekte im Labor durchgeführt werden und projektspezifische Säulenkontaminationen ein häufiges Problem darstellen. Darüber hinaus ermöglicht die Verpackung von Säulen im eigenen Haus die Verwendung von kundenspezifischen experimentspezifischen Sorbentien (wie z.B. PolyCAT-A-Sorbens2) und Säuleneigenschaften, die nicht als fertige Säule zum Kauf angeboten werden.
Um das zu bewältigen, verpacken viele Labore Kapillarsäulen im eigenen Haus. Das übliche Packungsverfahren mit einer 100 bar Druckbombe (Druckinjektionszelle)3 ist jedoch aufgrund des hohen Gegendrucks von UHPLC-Sorbentien unter 2 μm, was zu einer dramatischen Verringerung der Packungsrate im Vergleich zu größeren HPLC-Sorbentien führt, für die UHPLC-Säulenpackung ungeeignet. Während kurze UHPLC-Säulen immer noch sehr langsam gepackt werden können, ist die Herstellung langer UHPLC-Säulen physikalisch unmöglich4.
Die Standard-Kapillarsäulenpackung erfolgt bei relativ niedrigen Drücken von bis zu 100 bar und mit einer sehr niedrigen Sorptionsschlammkonzentration. Daher stehen zwei mögliche Richtungen zur Beschleunigung des Prozesses zur Verfügung. Es ist möglich, den Packungsdruck5zu erhöhen. Dies erfordert jedoch eine spezielle Ausrüstung und praktisch die Installation einer neuen Methode im Labor. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Sorptionsschlammkonzentration zu erhöhen6. Die Packung mit hoher Sorptionsaufschlämmkonzentration wird in Einer früherenVeröffentlichung beschrieben 7in Kombination mit einem ultrahohen Packungsdruck. Bei einem Druck von 100 bar, der in den meisten der vorhandenen Packbomben verwendet wird, führt eine höhere Sorptionsmittelkonzentration jedoch entweder zu einer Verlangsamung der Packungsrate oder zur vollständigen Beendigung der Packung. Es wurde kürzlich gezeigt, dass der Effekt auf die Sorptionsmittelbündelung am Säuleneingang zurückzuführen ist, und ein einfacher Trick der sorptionsfähigen Kuppeldestabilisierung durch Hämmern des Säuleneingangs mit einer Magnetstange in einem Sorptionsmittelfläschchen wurde vorgeschlagen4. Die resultierende Methode mit dem Namen FlashPack verwendet das gleiche 100-bar-Druckbombenpackungs-Setup. Gleichzeitig ermöglichen geringfügige, aber kritische Änderungen im Verpackungsverfahren das Verpacken aus einer sehr hohen Sorptionsschlammkonzentration und die Herstellung sehr langer UHPLC-Säulen (50 bis 70 cm und länger) in weniger als einer Stunde, während eine kurze Säule in wenigen Minuten hergestellt werden kann, wobei die Trennqualität den handelsüblichen Säulen der gleichen Parameter entspricht4. Der FlashPack-Ansatz wurde bereits in mehreren Proteomik-Projekten zur Herstellung sowohl der Umkehrphase (RP)8,9,10,11,12,13,14 als auch der hydrophilen Wechselwirkung (HILIC)2 Kapillarsäulen erfolgreich eingesetzt.
Hier beschreiben wir im Detail die Modifikationen, die für die Anpassung des FlashPack-Ansatzes an das Standard-100-bar-Druckbombenpackverfahren erforderlich sind.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.59002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Scoring Wafer</td>
			<td>Restek</td>
			<td>20116</td>
			<td>any ceramic wafer is suitable for capillary polishing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-chip bladed scribe</td>
			<td>NewObjective</td>
			<td>Diamond-chip bladed scribe</td>
			<td>recommended for capillary cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fused silica capillary 100 mm ID 375 mm OD</td>
			<td>CM Scientific</td>
			<td>TSP100375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GELoader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30001222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Ultimate3000 RSLCnano</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P2000/F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnet bar 2x5 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z283819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microspatula</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z193216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK ferrule 360 mm</td>
			<td>VICI</td>
			<td>JR-C360NFPK</td>
			<td>use to connect the column to UPLC union</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tip, 1000 uL</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z740095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 1000 uL</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman L P1000L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure bomb</td>
			<td>NextAdvance</td>
			<td>PC-77 MAG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>regulator</td>
			<td>GCE</td>
			<td>Jetcontrol 600 200/103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 mm</td>
			<td>Dr. Maisch</td>
			<td>r13.aq.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 0.5 mL</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AXYST050SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 1.5 mL</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AXYST150SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw caps with O-rings</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AXYSCOC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonication bath</td>
			<td>Elma</td>
			<td>Elmasonic S30 H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>union HPLC</td>
			<td>VICI</td>
			<td>JR-C360RU1PK6</td>
			<td>HPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>union UPLC</td>
			<td>VICI</td>
			<td>JR-C360RU1FS6</td>
			<td>UPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vortex</td>
			<td>BioSan</td>
			<td>V-1plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% (v/v) Formic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.59013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple in-house ultra-high performance capillary column manufacturing with the flashpack approach

Die kapillare Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie (UHPLC) ist derzeit eine Methode der Wahl für den Probentrennschritt in der LC-MS-basierten Proteomik. Kapillarsäulen sind jedoch im Vergleich zu ihren Gegentypen mit höherem Durchfluss viel weniger robust. Aufgrund der leichten Kontamination und Blockierung müssen sie oft ersetzt werden. Das macht sie zu einem ausgesprochen teuren Teil der gesamten LC-MS-Analysekosten. Das Inhouse-Verpacken von UHPLC-Kapillarsäulen spart viel Geld und ermöglicht eine Anpassung. Das Standard-Packverfahren in der 100-bar-Druckbombe funktioniert jedoch nur für HPLC-Säulen gut, ist aber für UHPLC-Sorbentien zu langsam. Hier finden Sie eine Beschreibung eines optimierten FlashPack-Protokolls, das auf dasselbe 100-bar-Druckbomben-Setup angewendet wird. Das Verfahren basiert auf der Verpackung aus Aufschlämmung mit extrem hoher Sorptionskonzentration und wurde für die inhouse-Fertigung von UHPLC-Kapillarsäulen unbegrenzter Länge in angemessener Zeit entwickelt.

Der FlashPack-Ansatz basiert auf dem Standardverpackungsaufbau und folgt der gleichen Verpackungspipeline. Die Verpackung erfolgt in Standard-Fritt- oder Pulled-Emitter-Kapillaren. Die Hauptoptimierung liegt in der Sorptionsschlammkonzentration: Die Standardmethode ist mit einer hochkonzentrierten Sorptionsmittelsuspension, die in FlashPack verwendet wird, unvereinbar. Das Ergebnis ist ein schnelles Herstellungsverfahren für lange UHPLC-Säulen, beispielsweise eine Säule, die für 50 cm Länge mit 1,9 μm Sorptionsmittel in weniger als 1 h verpackt ist (Abbildung 2).
Um die Anwendung des FlashPack-Ansatzes zu demonstrieren, wurde eine 30 cm 100 μm ID-Kapillarsäule hergestellt (Tabelle 6). Die Verpackung des ReprosilPur C18 1,9 μm Sorptionsmittels erfolgte bei 60 bar in eine 50 cm lange 100 μm ID gezogene Emitterkapillar, die von einem P2000 Laserzieher hergestellt wurde. Die Kapillare wurde in 40 Minuten auf ~ 40 cm gepackt, wobei etwas mehr loses Sorptionsmittel in der Kapillare verbleibt. Die verpackte Kapillare wurde an ein HPLC-System angeschlossen und mit 300 nL/min mit Lösungsmittel B (80% Acetonitril, 0,1% FA) betrieben. Nach zwei Runden à 5 s Beschallung betrug die endgültige Packlänge 43 cm. Die Säule wurde abgeschaltet, auf 30 cm zugeschnitten und über einen UHPLC-Anschluss mit dem HPLC-System verbunden. Wir verwenden routinemäßig 360 μm ärmellose PEEK-Mutter-Ferrule und 360 μm Edelstahlunion. Diese Kombination hält bei starker Straffung mindestens bis zu 700 Stangen. Die hergestellte Säule hat einen Gegendruck von 520 bar bei 2% Lösungsmittel B bei 500 nL/min, was mit dem Erwartungswertbereich übereinstimmt (Tabelle 5).
Als Demonstration der Säuleneffizienz verwendeten wir die hergestellte 30 cm Säule, um 50 fmol eines tryptischen Digests von Cytochrom C-Protein in einem 15-minütigen Gradienten von 2% bis 50% B zu trennen. Die durchschnittliche FWHM lag bei etwa 3 s (Abbildung 3).
Tabelle 1: Fehlerbehebung bei hohem Arbeitsgegendruck der Spalte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table1_HighColPressurev2.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 2: P2000/F Laserabziehprogramm. P2000/F Laser-Puller-Programm zur Herstellung von gezogenen Emitterkapillaren aus 360 μm OD 100 μm ID Quarzglas-Polyimid-beschichtete Kapillaren ohne Innenbeschichtung bei Raumtemperaturen 23-25 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table2_P2000F%20laser%20puller%20program.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 3: FlashPack-spezifische Verpackungsprobleme und Kontrollpunkte, die während des Verpackungsprozesses zu kontrollieren sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table3_sorbentDeliveryIssuesss.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 4: Beispielhafte Packungs- und Arbeitsstromraten für verschiedene Spalten-IDs und Längen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table4%20Exemplary%20packing%20and%20working%20flow%20rates.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 5: Erwarteter Gegendruck für eine Säule, die mit 2 μm kugelförmigen Sorbentien gefüllt ist und mit der Arbeitsflussrate (gemäß der Spalten-ID) im RP-Lösungsmittelsystem bei RT betrieben wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table5_Expected%20backpressure.xlsx" target="_blank"></a>
Tabelle 6: Beispielhafte Verpackung der 30 cm UHPLC-Säule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table6_Exemplary%20packing%20of%2030%20cm%20UHPLC%20columnv2.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig01.jpg"> Abbildung 1: Packungsschema der Kapillarsäule. Die Stufen 1 bis 3 sind vorbereitend, gefolgt von der Druckbombenverpackung und der HPLC-Verpackung. Die Stufen 3 und 4 sind für das hocheffiziente FlashPack-Protokoll modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig02.jpg"> Abbildung 2: Packrate für eine gefrittene Kapillare 100 μm ID mit ReprosilPur C18 AQ 1,9 μm bei 100 bar Methanol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig03.jpg"> Abbildung 3: Extrahierte Ionenchromatogramme von tryptischen Peptiden von Cytochrom C. Extrahierte Ionenchromatogramme von tryptischen Peptiden von Cytochrom C nach Abtrennung von 50 fmol in 30 cm langen 100 mm ID zogen emitterkapillare Säule gepackt mit ReprosilPur C18 AQ 1,9 μm in einem Gradienten von Puffer B (80% Acetonitril, 0,1% FA) und in Puffer A (2% Acetonitril, 0,1% FA) von 2% auf 40% B in 15 min bei 500 nL/min bei RT. Der Nachweis erfolgte mit einem Massenspektrometer. Absolute Intensitäten und extrahierte m/z-Bereiche für jedes Peptid sind rechts neben den Spektren dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach

Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll für das optimierte FlashPack Kapillarsäulenpackungsverfahren vor. Die Anwendung eines optimierten Protokolls auf ein gängiges 100-bar-Druckbomben-Setup ermöglicht ein 10-mal schnelleres Verpacken und Herstellen von langen Ultra-Hochleistungs-Kapillarsäulen.

Einfache Inhouse-Herstellung von Ultra-Hochleistungs-Kapillarsäulen mit dem FlashPack-Ansatz

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. ...

Einfache Inhouse-Herstellung von Ultra-Hochleistungs-Kapillarsäulen mit dem FlashPack-Ansatz. Ziel dieses Verfahrens ist es, ein optimiertes Protokoll für die schnelle und einfache Hochleistungs-Kapillarsäulenpackung für die LC-MS-Proteomik-Analyse einzuführen. Die moderne Proteomik basiert auf Massenspektrometrie in Verbindung mit ultrahochleistungsfähiger Kapillarflüssigkeitschromatographie.Die Peptidtrennung erfolgt meist in Kapillarsäulen mit einem Innendurchmesser von 75 Mikrometern. Auf Augenhöhe mit kommerziellen Produkten ist es möglich, Kapillarsäulen im eigenen Haus vorzubereiten. Speziell vorbereitete Säulen weisen ähnliche Trenneigenschaften wie kommerzielle Analogien auf, sparen viel Geld und ermöglichen die Anpassung von Sorptionsmitteln und Säulengrößen.Hier demonstrieren wir ein optimiertes Packverfahren für die hauseigene Kapillarsäulenfertigung, das wir FlashPack nennen. Die Idee hinter der Optimierung besteht darin, von einer sehr hohen Sorptionsschlammkonzentration zu packen und gleichzeitig den gleichen üblichen 100 bar Druckbombenpackungsaufbau zu verwenden. Dies erfordert ein kontinuierliches Aufbrechen von Sorptionsmittelclustern, die sich bei hoher Sorptionsmittelkonzentration um den Säuleneingang bilden und verhindern, dass neues Sorptionsmaterial in die Kapillare gelangt.Technisch erreichen wir dies, indem wir eine Magnetstange als Hammer verwenden, die Kapillare im Inneren des Sorptionsdrahtes ständig erhitzt und bewegt. Richtig angewendetes FlashPack erhöht die Packrate um das bis zu 10-fache. Das macht es geeignet für das Verpacken von Ultrahochleistungssorbentien von weicherer Mikrometrikbeat-Größe und für die Herstellung sehr langer Säulen bis zu einem Meter Länge in angemessenen Zeiten.Das Verfahren zur Säulenvorbereitung besteht aus fünf Schritten. Drei vorbereitende Schritte, die die Montage der Packstation und die Vorbereitung von Kapillar- und Sorptionsschlämmen umfassen. Dann wird die Kapillare zunächst bei 60 bis 100 bar Druck in die Druckbombe gepackt.Es folgt der Anschluss der verpackten Kapillare an das HPLC-System, das Verpacken des Sorptionsmittels bei hohem Druck und das Schneiden der Säule auf die Größe. Das FlashPack-Verfahren erfordert Änderungen in den Schritten drei und vier des gemeinsamen Protokolls. Zuerst bereiten wir eine Packstation vor.Es besteht aus einem Stickstoffgastank mit mindestens 50 bar Ausgangsdruck. Der Tank ist mit dem Entlüftungsventil der Druckbombe verbunden, das sich im Magnetrührer befindet. Der Auslass des Entlüftungsventils wird durch eine schmale ID PEEK-Kapillare in eine Wasserflasche eingeführt, die eine Feinkontrolle der Druckentlastung ermöglicht.Als nächstes bereiten wir eine Kapillare vor. Die Verpackung kann entweder in eine gestreue Kapillare mit einer integrierten Glasfritte aus Kasil und Formamid erfolgen. Eine andere Möglichkeit besteht darin, in eine gezogene Kapillare zu packen, die mit einem Sutter-Laser-Puller hergestellt wird.Die Kapillare muss 10 bis 15 Zentimeter länger als die vorgesehene Säulenlänge sein. Das folgende Video wird am Beispiel einer gezogenen Emitterkapillarpackung erstellt. Schützen Sie ein gezogenes Emitterende mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze mit Gelbeladung.Weitere Informationen finden Sie in der Textversion des Manuskripts. Die nächste Stufe ist die Vorbereitung von Sorptionsschlämmen. Geben Sie zunächst etwa 50 Milligramm trockenes Sorptionsmittel in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Das wird ein Sorptionsfläschchen sein. Dieses Video wurde unter Verwendung des mikrometrischen Sorptionsmittels Reprosil Pur C18 AQ 1.9 von Dr.Maisch erstellt. Einen Milliliter Methanol in die Durchstechflasche mit Sorptionsmittel geben.Wirbel für 10 Sekunden. Und beschallen Sie in einem Ultraschallbad für weitere 10 Sekunden. Lassen Sie das Sorptionsmittel 20 bis 30 Minuten lang gründlich einweichen, dann wirbeln und beschallen Sie es erneut.Bereiten Sie eine funktionierende Durchstechflasche mit Sorptionsmittel vor. Es muss sich um ein konisches Fläschchen mit Boden handeln, das in die Bombe passt. Es kann sich entweder um ein weiteres 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr oder ein anderes Fläschchen handeln, abhängig von der jeweiligen Druckbombenkonstruktion.Wir verwenden ein konisches Schraubverschlussrohr mit Schraffur, das auf die Höhe der Druckbombe zugeschnitten ist. Suspendieren Sie das Sorptionsmittel in der Durchstechflasche mit Sorbens erneut und übertragen Sie 500 Mikroliter zusammen mit einer zwei mal drei Millimeter großen Magnetstange in das Arbeitssorbenstechflasche. Auf die Arbeitsflasche auf einen Milliliter mit Methanol aufschlagen.Lassen Sie die Arbeitsflasche 10 Minuten lang auf dem Tisch stehen, damit sich das Sorptionsmittel durch Schwerkraft absetzt. Das Ergebnis dieses Schritts muss eine konische untere Durchstechflasche sein, deren untere Schicht aus losem Sorptionsmittel etwa vier Millimeter hoch ist. Wenn die Schicht zu niedrig ist und etwas mehr Sorptionsmittel aus der Durchstechflasche.So ist die vorbereitete Arbeitsfläschchen für die Vorbereitung mehrerer Säulen über Monate bestimmt. Wenn die Arbeitsstechflasche mit Sorptionsmittel länger als zwei Stunden ohne Rühren bleibt, muss sie vor dem Verpacken durch Schwerkraft erneut vorgewirbelt, beschallt und abgesetzt werden. Wenn alles vorbereitet ist, fahren Sie mit Stufe vier fort und packen Sie die Druckbombe ein.Tragen Sie immer eine Schutzbrille, wenn Sie mit Quarzglaskapillaren und der Druckbombe arbeiten. Gleichzeitig werden Schutzhandschuhe nicht empfohlen. Sie reduzieren den Tastsinn, der für den richtigen Umgang mit Kapillaren mit kleinem Durchmesser erforderlich ist, erheblich und führen zu Fehlern.Legen Sie die Durchstechflasche in die Druckbombe und fixieren Sie alle Knoten fest. Beginnen Sie die Rotation mit 60 bis 100 Schuss pro Minute, setzen Sie die gefohlene oder gezogene Emitterkapillar in die Bombe ein. Schieben Sie es bis zum Boden der Durchstechflasche, heben Sie es dann zwei bis drei Millimeter an und fixieren Sie den Knoten.Wenden Sie die erforderliche Mindestkraft an, um die Kapillare zu fixieren. Überprüfen Sie, ob die Kapillare richtig fixiert ist. Es muss unmöglich sein, die Kapillare zu bewegen, indem man sie von Hand herauszieht.Öffnen Sie das Druckbombenventil sehr langsam, während Sie das offene Ende der Kapillare von Ihrem Gesicht weg zeigen. Beobachten Sie die ersten Schritte des Verpackungsprozesses. Unmittelbar nach der Druckbeaufschlagung füllt das Sorptionsmittel die Kapillare und wird für die gesamte Länge undurchsichtig.Sobald sich das Sorptionsmittel im distalen Ende einzupacken beginnt, steigt der Gegendruck, der Fluss verlangsamt sich und die gleichmäßige Sorptionsschlämme im Kapillar bildet sich in mehrere Sorptionsmittelpakete um, die durch sorptionsfreie Lücken getrennt sind. Bereits gepacktes Sorptionsmittel ist als dicht gefärbtes, kontinuierlich wachsendes Gebiet sichtbar. Halten Sie die mit Sorptionsmittel gefüllten Bereiche während der gesamten Dauer des Verpackungsprozesses auf mindestens 70% der Kapillarlänge mit kleinen sorptionsmittelfreien Lücken.Es gibt mehrere häufige Probleme, die während des Verpackungsprozesses zu beachten sind. Sie erfordern eine Anpassung des Aufbaus während des Fluges, um eine effiziente Sorptionsmittelabgabe in die Kapillare zu gewährleisten. Das häufigste Problem ist, wenn neues Sorptionsmittel aufhört, in die Kapillare einzudringen, während das Sorptionsmittel, das sich bereits im Inneren befindet, in Bewegung bleibt.In den meisten Fällen wird der Kapillareingang durch selbstaggregierende Sorptionscluster blockiert. Wenden Sie diese Schritte nacheinander an, bis der Sorptionsmittelfluss wiederhergestellt ist, und überspringen Sie dann die restlichen problembezogenen Schritte. Erhöhen Sie die Drehzahl auf 500 Schuss pro Minute und reduzieren Sie sie sofort wieder auf 60 U / min.Meistens stellt es den Sorptionsmittelfluss wieder her. Überprüfen Sie die Drehzahl für den Rest des Verpackungsprozesses auf mindestens 60 U / min. Wenn es nicht hilft, entlüften Sie die Packbombe kurz und setzen Sie sie sofort wieder unter Druck.Wenn es nicht hilft oder die Blockierung erneut auftritt, positionieren Sie die Kapillare in der Sorptionsschicht neu. Das Fehlen des Sorptionsmittels kann darauf zurückzuführen sein, dass das kapillare offene Ende entweder zu hoch über der Magnetstange liegt, so dass das Säulenende es nicht berührt. Oder die Kapillare ist zu niedrig positioniert und klebt in den Fläschchenboden.Entlüften Sie zuerst die Bombe vollständig, lösen Sie dann die Mutter, drücken Sie die Kapillare nach unten und ziehen Sie sie dann zwei Millimeter zurück. Befestigen Sie die Mutter. Öffnen Sie das Ventil, um die Bombe unter Druck zu setzen, und fahren Sie mit dem Packen fort.Weitere Details zu den Packproblemen sind in der Textversion der Methode beschrieben. Packen Sie die Säule weiter, bis die Zielsäulenlänge plus fünf bis sieben Zentimeter erreicht ist. Stoppen Sie die Rotation und verringern Sie die Bombe sehr langsam.Öffnen Sie das Bombenventil ein wenig und warten Sie, bis die Blase in der Wasserflasche platzt. Öffnen Sie dann das Ventil etwas weiter und warten Sie erneut, bis die Blase platzt. Lösen Sie also in inkrementellen Schritten den Druck, bis kein Gas mehr aus dem Ventil austritt.Öffnen Sie das Ventil nicht ganz auf einmal. Es führt zu einem Blubbern in der Kapillare und dem Sorptionsmittel, das in die Durchstechflasche zurückkehrt. Wenn das passiert, setzen Sie die Bombe unter Druck und warten Sie, bis die Säule wieder gepackt ist.Wenn das Gas nicht mehr aus dem Entlüftungsventil kommt, nehmen Sie die gepackte Kapillare aus der Druckbombe. Lassen Sie die Säule nicht austrocknen. Wenn sie nicht sofort zur weiteren Verpackung an das HPLC-System angeschlossen sind, lagern Sie die verpackte Kapillare ein, indem Sie sie als Ganzes in 10% ige Ethanollösung tauchen.Getrennte HPLC-Säulen werden auf die gleiche Weise gespeichert. Wenn für heute keine Verpackung mehr geplant ist, nehmen Sie das Sorptionsmittelfläschchen aus der Bombe heraus und schließen Sie es fest. Halten Sie es für die weitere Sammlung der Säule.Stufe fünf, HPLC packt zusammen. Verbinden Sie die gepackte Kapillare über eine HPLC-Verbindung mit dem HPLC-System. Starten Sie den Fluss von hohem organischem Lösungsmittel.Passen Sie den Durchfluss entsprechend der Packlänge an, die auf etwa 300 Balken abzielt. Für 40 Zentimeter verpackte Kapillare verwenden Sie die Durchflussrate von 200-300 normalen Litern pro Minute. Achten Sie auf loses Sorptionsmittel in der Kapillare, das verpackt wird, was die Gesamtpacklänge erhöht.Ohne den Fluss zu stoppen, tauchen Sie den Säulenkörper zweimal in das Beschallungsbad ein. Es ist wichtig, nur einen Teil des Säulenkörpers einzutauchen. Stützenenden und Kapillarverbindungen nicht eintauchen lassen.Wenn das Sorptionsbett aufhört zu schrumpfen, tauchen Sie den Säulenkörper noch zweimal in das Beschallungsbad ein, ohne den Fluss zu stoppen. Führen Sie die Spalte weitere 10 Minuten bei 300 Balken aus. Stoppen Sie den Durchfluss, warten Sie, bis der Druck unter drei Balken fällt, und trennen Sie die Säule.Überprüfen Sie die Säule visuell auf fehlende Lücken und Verfärbungen. Wenn welche gefunden werden, kann die Beschallung unter der Strömung wiederholt werden. Erwägen Sie für kritische Experimente, eine neue Spalte zu erstellen.Schneiden Sie die Spalte auf die gewünschte Länge aus. Richtig ausgeführtes Schneiden ist eine Voraussetzung für die Säuleneffizienz. Machen Sie eine Kerbe in Polyamidbeschichtung mit dem Schreiber.Spalten Sie die Kapillare teilweise und ziehen Sie zwei Stücke auseinander. Polieren Sie das Säulen-Frontend auf einem Keramikwafer oder mit Läppfolie. Schließen Sie die Säule über einen Ultrahochdruckanschluss wieder an das LC-System an.Beginnen Sie den Arbeitsdurchfluss bei 2% B. Der Arbeitsfluss wird entsprechend den Spaltenparametern angepasst. Zum Beispiel werden 100 Mikrometer-ID-Säulen mit 500 Nanolitern pro Minute betrieben.Warten Sie, bis sich der Druck ausgeglichen hat, und überprüfen Sie den Gegendruck der Säule. Eine richtig vorbereitete Säule gibt Einen Gegendruck, der proportional zu ihrer Länge und ihren Sorptionseigenschaften ist. Zum Beispiel hat eine 30-Zentimeter-Kapillarsäule, die mit zwei Mikrometern Sorptionsmittel gefüllt ist, einen Gegendruck von 450 bis 500 bar bei 2% Lösungsmittel B. Wenn die produzierte Säule einen Gegendruck innerhalb des erwarteten Bereichs ergibt, ist sie gebrauchsfertig.Wenn der Gegendruck weit außerhalb des erwarteten Bereichs liegt, stimmt etwas entweder mit der Säule oder mit dem LC-System nicht. Die Verpackung mit FlashPack erzeugt eine 50 Zentimeter lange Kapillare mit 1,9 Mikrometer Sorptionsmittel in weniger als einer Stunde bei 100 bar Packdruck. Als Beispiel produzieren wir eine 30 Zentimeter 100 Mikrometer ID Ultrahochdrucksäule, die in eine gezogene Emitterkapillare mit 1,9 Mikrometer ReprosilPur C18 AQ Sorptionsmittel verpackt ist.Die Verpackung erfolgte bei 60 bar in eine 50 Zentimeter lange gezogene Emitterkapillare. Die Kapillare wurde in 40 Minuten auf 40 Zentimeter gepackt, wobei etwas mehr Sorptionsmittel in der Kapillare nicht gepackt war. Die gepackte Kapillare wurde an das HPLC-System angeschlossen und mit 300 Nanolitern pro Minute mit dem Lösungsmittel B betrieben, das in unserem Fall 80% Acetonitril, 0,1% Ameisensäure war.Die endgültige Packlänge betrug 43 Zentimeter. Die Säule wurde um 30 Zentimeter geschnitten. Bei 500 Nanoliter pro Minute Arbeitsfluss mit 99% Lösungsmittel B ergab die Säule den Gegendruck von 275 bar, was nahe am erwarteten Wert liegt.Um die Säule zu testen, trennten wir 50 fmol eines tryptischen Digests von Cytochrom-C-Protein in einem 15-minütigen Gradienten von 2-50% B. Chromatographische Peaks waren hochsymmetrisch mit minimalem Tailing. Die durchschnittliche FWHM betrug etwa drei Sekunden.Das beschriebene Protokoll ist in der Lage, UHPLC-Säulen in einer gängigen 100-bar-Packung in angemessener Zeit herzustellen. Kurze HPLC- oder UPLC-Säulen können in wenigen Minuten verpackt werden, während lange 30-50-Zentimeter-Säulen in weniger als einer Stunde verpackt werden. Die Methode ist effizient zum Verpacken von Sorbentien mit RP und jeder anderen Chemie in beliebige Spalten-IDs.Produzierte Säulen sind reproduzierbar so effektiv wie jede andere kommerzielle Säule ähnlicher Größe und Sorptionsparameter.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Forschung

Biochemie

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