Name: simple in-house ultra-high performance capillary column manufacturing with the flashpack approach
Uploaded: 2021-12-04T14:00:00
Duration: 13 min 36 s
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इस काम को आरएसएफ ग्रांट 20-14-00121 से सपोर्ट मिला। लेखक उपयोगी चर्चाओं के लिए पी वी श्लियाहा (मेमोरियल स्लोन केटरिंग कैंसर सेंटर) का शुक्रिया अदा करते हैं ।

<ol>
	<li>Shishkova, E., Hebert, A. S., Now Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Now,+more+than+ever,+proteomics+needs+better+chromatography.">Now, more than ever, proteomics needs better chromatography.</a> Cell Systems. 3 (4), 321-324 (2016).</li><li>Shliaha, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle-down+proteomic+analyses+with+ion+mobility+separations+of+endogenous+isomeric+proteoforms.">Middle-down proteomic analyses with ion mobility separations of endogenous isomeric proteoforms.</a> Analytical Chemistry. 92 (3), 2364-2368 (2020).</li><li>. Pressure injection cells - next advance - laboratory instruments Available from: <a target="_blank" href="https://www.nextadvance.com/pressure-injection-cells-lc-ms-capillary-column-packing-loader/?target=Overview">https://www.nextadvance.com/pressure-injection-cells-lc-ms-capillary-column-packing-loader/?target=Overview</a> (2021)</li><li>Kovalchuk, S. I., Jensen, O. N., Rogowska-Wrzesinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlashPack:+Fast+and+simple+preparation+of+ultrahigh-performance+capillary+columns+for+LC-MS.">FlashPack: Fast and simple preparation of ultrahigh-performance capillary columns for LC-MS.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 18 (2), 383-390 (2019).</li><li>MacNair, J. E., Lewis, K. C., Jorgenson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh-pressure+reversed-phase+liquid+chromatography+in+packed+capillary+columns.">Ultrahigh-pressure reversed-phase liquid chromatography in packed capillary columns.</a> Analytical Chemistry. 69 (6), 983-989 (1997).</li><li>Bruns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slurry+concentration+effects+on+the+bed+morphology+and+separation+efficiency+of+capillaries+packed+with+sub-2+&#181;m+particles.">Slurry concentration effects on the bed morphology and separation efficiency of capillaries packed with sub-2 &#181;m particles.</a> Journal of Chromatography. A. 1318, 189-197 (2013).</li><li>Godinho, J. M., Reising, A. E., Tallarek, U., Jorgenson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+high+slurry+concentration+and+sonication+to+pack+high-efficiency,+meter-long+capillary+ultrahigh+pressure+liquid+chromatography+columns.">Implementation of high slurry concentration and sonication to pack high-efficiency, meter-long capillary ultrahigh pressure liquid chromatography columns.</a> Journal of Chromatography. A. 1462, 165-169 (2016).</li><li>Andrzejczak, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+phytoglobin+overexpression+on+the+plant+proteome+during+nonhost+response+of+barley+(Hordeum+vulgare)+to+wheat+powdery+mildew+(Blumeria+graminis+f.+sp.+tritici).">The effect of phytoglobin overexpression on the plant proteome during nonhost response of barley (Hordeum vulgare) to wheat powdery mildew (Blumeria graminis f. sp. tritici).</a> Scientific Reports. 10 (1), 9192 (2020).</li><li>Elchaninov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+transcriptome,+proteome,+and+miRNA+profile+of+kupffer+cells+and+monocytes.">Comparative analysis of the transcriptome, proteome, and miRNA profile of kupffer cells and monocytes.</a> Biomedicines. 8 (12), 627 (2020).</li><li>Babenko, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Draft+genome+sequences+of+Hirudo+medicinalis+and+salivary+transcriptome+of+three+closely+related+medicinal+leeches.">Draft genome sequences of Hirudo medicinalis and salivary transcriptome of three closely related medicinal leeches.</a> BMC Genomics. 21 (1), 331 (2020).</li><li>Babenko, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+unusual+peptides+with+new+Cys+frameworks+in+the+venom+of+the+cold-water+sea+anemone+Cnidopus+japonicus.">Identification of unusual peptides with new Cys frameworks in the venom of the cold-water sea anemone Cnidopus japonicus.</a> Scientific Reports. 7 (1), 14534 (2017).</li><li>Loughran, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusually+efficient+CUG+initiation+of+an+overlapping+reading+frame+in+POLG+mRNA+yields+novel+protein+POLGARF.">Unusually efficient CUG initiation of an overlapping reading frame in POLG mRNA yields novel protein POLGARF.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (40), 24936-24946 (2020).</li><li>Radzisheuskaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT5+methylome+profiling+uncovers+a+direct+link+to+splicing+regulation+in+acute+myeloid+leukemia.">PRMT5 methylome profiling uncovers a direct link to splicing regulation in acute myeloid leukemia.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (11), 999-1012 (2019).</li><li>Rubtsova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+encoded+in+human+telomerase+RNA+is+involved+in+cell+protective+pathways.">Protein encoded in human telomerase RNA is involved in cell protective pathways.</a> Nucleic Acids Research. 46 (17), 8966-8977 (2018).</li><li>Maiolica, A., Borsotti, D., Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-made+frits+for+nanoscale+columns+in+proteomics.">Self-made frits for nanoscale columns in proteomics.</a> PROTEOMICS. 5 (15), 3847-3850 (2005).</li><li>Ishihama, Y., Rappsilber, J., Andersen, J. S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcolumns+with+self-assembled+particle+frits+for+proteomics.">Microcolumns with self-assembled particle frits for proteomics.</a> Journal of Chromatography. A. 979 (1-2), 233-239 (2002).</li><li>Shishkova, E., Hebert, A. S., Westphall, M. S., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+pressure+(&gt;30,000+psi)+packing+of+capillary+columns+enhancing+depth+of+shotgun+proteomic+analyses.">Ultra-high pressure (&gt;30,000 psi) packing of capillary columns enhancing depth of shotgun proteomic analyses.</a> Analytical Chemistry. 90 (19), 11503-11508 (2018).</li></ol>

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

आधुनिक प्रोटेओमिक्स तरल क्रोमेटोग्राफी-युग्मित मास स्पेक्ट्रोमेट्री पर आधारित है जिसमें अल्ट्रा-हाई-हाई परफॉर्मेंस नैनो-फ्लो क्रोमेटोग्राफी (50-150 माइक्रोन कॉलम आंतरिक व्यास (आईडी)) जुदाई सबसे अच्छा विश्लेषण गति और संवेदनशीलता प्रदान करता है1। जबकि कई वाणिज्यिक UHPLC केशिका कॉलम उपलब्ध हैं, उनकी कीमत उपभोग्य लागत का एक प्रमुख हिस्सा बनाती है, खासकर जब प्रयोगशाला में कई विविध परियोजनाएं चलाई जाती हैं और परियोजना-विशिष्ट कॉलम संदूषण एक लगातार मुद्दा है। इसके अलावा, घर में कॉलम की पैकिंग कस्टम प्रयोग-विशिष्ट शर्बत (जैसे, पॉलीकैट-ए शर्बत2)और कॉलम विशेषताओं के उपयोग की अनुमति देता है जो तैयार कॉलम के रूप में खरीदने के लिए उपलब्ध नहीं है।
इससे निपटने के लिए, कई प्रयोगशालाएं घर में केशिका स्तंभों को पैक करती हैं। हालांकि, 100 बार प्रेशर बम (प्रेशर इंजेक्शन सेल) 3 के साथ सामान्य पैकिंग प्रक्रिया यूएचपीएलसी कॉलमपैकिंग के लिए उपयुक्त है, क्योंकि उप-2 माइक्रोन यूएचपीएलसी शर्बंट्स के उच्च बैकप्रेशर के कारण बड़े आकार के एचपीएलसी शर्बंट्स की तुलना में नाटकीय पैकिंग दर में कमी आती है। जबकि छोटे यूएचपीएलसी कॉलम अभी भी बहुत धीरे-धीरे पैक किए जा सकते हैं, लंबे यूएचपीएलसी कॉलम का निर्माण शारीरिक रूप से असंभव है4।
मानक केशिका स्तंभ पैकिंग अपेक्षाकृत कम दबाव-अप 100 बार, और बहुत कम शर्बत घोल एकाग्रता के साथ किया जाता है। इसलिए, प्रक्रिया को तेज करने के दो संभावित निर्देश उपलब्ध हैं। पैकिंग दबाव5को बढ़ाना संभव है। हालांकि, इसके लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है और व्यावहारिक रूप से प्रयोगशाला में एक नई विधि की स्थापना की आवश्यकता होती है। दूसरा तरीका यह है कि शर्बत घोल एकाग्रता6को बढ़ाया जाए । उच्च शर्बत घोल एकाग्रता पैकिंग पिछले प्रकाशन7में अल्ट्रा-हाई पैकिंग दबाव के साथ संयोजन में वर्णित है। हालांकि, १०० बार दबाव है, जो मौजूदा पैकिंग बम के अधिकांश में प्रयोग किया जाता है पर, उच्च शर्बत एकाग्रता या तो पैकिंग दर धीमी गति से नीचे या एकमुश्त पैकिंग समाप्ति में परिणाम । प्रभाव हाल ही में कॉलम प्रवेश द्वार पर शर्बत क्लस्टरिंग के कारण होने का प्रदर्शन किया गया था, और एक शर्बत शीशी के अंदर एक चुंबक पट्टी के साथ कॉलम प्रवेश द्वार अंकित द्वारा शर्बत कपोल अस्थिरता की एक सरल चाल4का सुझाव दिया गया था । फ्लैशपैक नाम की परिणामी विधि, एक ही 100-बार प्रेशर बम पैकिंग सेटअप का उपयोग करती है। इसके साथ ही, पैकिंग प्रक्रिया में मामूली लेकिन महत्वपूर्ण परिवर्तन बहुत अधिक शर्बत घोल एकाग्रता और बहुत लंबे यूएचपीएलसी कॉलम (50 से 70 सेमी, और लंबे समय तक) के उत्पादन से एक घंटे से भी कम समय में पैकिंग की अनुमति देते हैं, जबकि एक छोटे कॉलम को समान मापदंडों के वाणिज्यिक स्तंभों के बराबर पृथक्करण गुणवत्ता के साथ मिनटों में उत्पादित किया जा सकता है4। फ्लैशपैक दृष्टिकोण का पहले से ही रिवर्स चरण(आरपी)8, 9,10, 11, 12,13,14और हाइड्रोफिलिक इंटरैक्शन (एचआईएलआईसी)2केशिलरी कॉलम दोनों की तैयारी के लिए कई प्रोटेओमिक्स परियोजनाओं में सफलतापूर्वक उपयोग कियागया था।
यहां हम विस्तार से वर्णन करते हैं, मानक 100-बार दबाव बम पैकिंग प्रक्रिया के लिए फ्लैशपैक दृष्टिकोण के अनुकूलन के लिए आवश्यक संशोधन।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.59002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Scoring Wafer</td>
			<td>Restek</td>
			<td>20116</td>
			<td>any ceramic wafer is suitable for capillary polishing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-chip bladed scribe</td>
			<td>NewObjective</td>
			<td>Diamond-chip bladed scribe</td>
			<td>recommended for capillary cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fused silica capillary 100 mm ID 375 mm OD</td>
			<td>CM Scientific</td>
			<td>TSP100375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GELoader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30001222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Ultimate3000 RSLCnano</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P2000/F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnet bar 2x5 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z283819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microspatula</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z193216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK ferrule 360 mm</td>
			<td>VICI</td>
			<td>JR-C360NFPK</td>
			<td>use to connect the column to UPLC union</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tip, 1000 uL</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z740095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 1000 uL</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman L P1000L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure bomb</td>
			<td>NextAdvance</td>
			<td>PC-77 MAG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>regulator</td>
			<td>GCE</td>
			<td>Jetcontrol 600 200/103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 mm</td>
			<td>Dr. Maisch</td>
			<td>r13.aq.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 0.5 mL</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AXYST050SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 1.5 mL</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AXYST150SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw caps with O-rings</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AXYSCOC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonication bath</td>
			<td>Elma</td>
			<td>Elmasonic S30 H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>union HPLC</td>
			<td>VICI</td>
			<td>JR-C360RU1PK6</td>
			<td>HPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>union UPLC</td>
			<td>VICI</td>
			<td>JR-C360RU1FS6</td>
			<td>UPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vortex</td>
			<td>BioSan</td>
			<td>V-1plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% (v/v) Formic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.59013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple in-house ultra-high performance capillary column manufacturing with the flashpack approach

केशिलरी अल्ट्रा-हाई परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमेटोग्राफी (यूएचपीएलसी) वर्तमान में एलसी-एमएस-आधारित प्रोटेओमिक्स में नमूना पृथक्करण चरण के लिए पसंद की एक विधि है। हालांकि, उनके उच्च प्रवाह काउंटरटाइप की तुलना में केशिका कॉलम बहुत कम मजबूत होते हैं। आसान प्रदूषण और अवरुद्ध होने के कारण, उन्हें अक्सर प्रतिस्थापन की आवश्यकता होती है। कि उन्हें कुल एलसी एमएस विश्लेषण लागत का एक स्पष्ट रूप से महंगा हिस्सा बनाता है। यूएचपीएलसी केशिका स्तंभों की इन-हाउस पैकिंग बहुत पैसा बचाती है और अनुकूलन की अनुमति देती है। हालांकि, 100-बार प्रेशर बम में मानक पैकिंग प्रक्रिया केवल एचपीएलसी कॉलम के लिए अच्छी तरह से काम करती है लेकिन यूएचपीएलसी शर्बत के लिए बहुत धीमी है। यहां हम एक ही 100-बार प्रेशर बम सेटअप पर लागू एक अनुकूलित फ्लैशपैक प्रोटोकॉल का विवरण प्रदान करते हैं। विधि अल्ट्रा उच्च शर्बत एकाग्रता घोल से पैकिंग पर आधारित है और उचित समय में असीमित लंबाई के UHPLC केशिका स्तंभों के इन-हाउस विनिर्माण के लिए विकसित की गई है।

फ्लैशपैक दृष्टिकोण मानक पैकिंग सेटअप पर आधारित है और एक ही पैकिंग पाइपलाइन का पालन करता है। पैकिंग मानक फ्रिटेड या खींचे गए उत्सर्जक केशिकाओं में किया जाता है। प्रमुख अनुकूलन शर्बत घोल एकाग्रता में निहित है: मानक विधि फ्लैशपैक में उपयोग किए जाने वाले उच्च केंद्रित शर्बत निलंबन के साथ असंगत है। परिणाम लंबे यूएचपीएलसी कॉलम के लिए एक तेज़ उत्पादन विधि है, उदाहरण के लिए, 1 घंटे(चित्रा 2)से कम में 1.9 मीटर सोर्बेंट के साथ 50 सेमी लंबाई के लिए पैक किया गया एक कॉलम।
फ्लैशपैक दृष्टिकोण के आवेदन को प्रदर्शित करने के लिए, 30 सेमी 100 माइक्रोन आईडी केशिका कॉलम(तालिका 6)तैयार किया गया था। ReprosilPur C18 1.9 माइक्रोन शर्बंट की पैकिंग 60 सलाखों में 50 सेमी लंबी 100 माइक्रोन आईडी खींच ली गई उत्सर्जक केशिका में की गई थी, जिसे पी 2000 लेजर पुलर द्वारा तैयार किया गया था। केशिका को 40 मिनट में ~ 40 सेमी तक पैक किया गया था जिसमें केशिका के अंदर कुछ और ढीले शर्बत छोड़ दिए गए थे। पैक्ड केशिका को एचपीएलसी सिस्टम से जोड़ा गया था और सॉल्वेंट बी (80% एसीटोनिट्रिल, 0.1% एफए) के साथ 300 एनएल/मिन पर चलाया जाता था। 5 एस सोनीसिएशन के दो राउंड के बाद फाइनल पैक्ड लेंथ ४३ सेमी थी । कॉलम काट दिया गया था, 30 सेमी तक काट दिया और एक UHPLC कनेक्शन का उपयोग कर HPLC प्रणाली से जुड़ा हुआ है । हम नियमित रूप से 360 μm स्लीवलेस तिरछी नट-फेरुल और 360 माइक्रोन स्टेनलेस स्टील यूनियन का उपयोग करते हैं। इस संयोजन को कम से कम 700 सलाखों के लिए रखती है अगर दृढ़ता से कड़ा किया। निर्मित कॉलम में 500 एनएल/मिनट पर 2% सॉल्वेंट बी पर 520 बार का बैकप्रेशर है, जो अपेक्षित मूल्य सीमा(तालिका 5)के अनुरूप है।
कॉलम दक्षता के प्रदर्शन के रूप में, हमने निर्मित 30 सेमी कॉलम का उपयोग 15 मिनट ग्रेडिएंट में साइटोक्रोम सी प्रोटीन के ट्राइप्टिक डाइजेस्ट के 50 एफएमओएल को अलग करने के लिए किया। औसत FWHM 3 एस(चित्रा 3)के आसपास था ।
तालिका 1: कॉलम के उच्च कार्य बैकप्रेशर के लिए समस्या निवारण। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table1_HighColPressurev2.xlsx" target="_blank">कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
तालिका 2: P2000/F लेजर पुलर कार्यक्रम। P2000/F लेजर पुलर कार्यक्रम 360 माइक्रोन ओडी 100 माइक्रोन आईडी से खींचा उत्सर्जक केशिकाओं की तैयारी के लिए कमरे के तापमान 23-25 डिग्री सेल्सियस पर आंतरिक कोटिंग के बिना केशिकाएं । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table2_P2000F%20laser%20puller%20program.xlsx" target="_blank">कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
तालिका 3: पैकिंग प्रक्रिया के दौरान नियंत्रित करने के लिए फ्लैशपैक-विशिष्ट पैकिंग मुद्दे और चौकियां। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table3_sorbentDeliveryIssuesss.xlsx" target="_blank">कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
तालिका 4: विभिन्न कॉलम टीडीएस और लंबाई के लिए अनुकरणीय पैकिंग और काम करने वाली प्रवाह दरें। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table4%20Exemplary%20packing%20and%20working%20flow%20rates.xlsx" target="_blank">कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
तालिका 5: 2 μमीटर गोलाकार शर्बत के साथ पैक कॉलम के लिए अपेक्षित बैकप्रेशरऔर आरटी में आरपी सॉल्वेंट सिस्टम में वर्किंग फ्लो रेट (कॉलम आईडी के अनुसार) पर चलाएं । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table5_Expected%20backpressure.xlsx" target="_blank">कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
तालिका 6: 30 सेमी यूएचपीएलसी कॉलम की अनुकरणीय पैकिंग। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table6_Exemplary%20packing%20of%2030%20cm%20UHPLC%20columnv2.xlsx" target="_blank">कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig01.jpg"> चित्रा 1:केशिका स्तंभ पैकिंग योजना। चरण 1 से 3 तैयारी कर रहे हैं, दबाव बम पैकिंग के बाद और HPLC पैकिंग द्वारा समाप्त अप । चरण 3 और 4 अल्ट्रा-कुशल फ्लैशपैक प्रोटोकॉल के लिए संशोधित किए गए हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig02.jpg"> चित्रा 2:मेथनॉल में 100 बार में रिप्रोसिलपुर सी18 एक्यू 1.9 माइक्रोन के साथ फ्रिटेड केशिका 100 माइक्रोन आईडी के लिए पैकिंग दर। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig02large.jpg" target="_blank">यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig03.jpg"> चित्र 3:साइटोक्रोम सी के ट्राइप्टिक पेप्टाइड्स के निकाले गए आयन क्रोमोग्राम। 30 सेमी लंबी 100 मिमी आईडी में 50 एफएमोल के अलग होने के बाद साइटोक्रोम सी के ट्राइप्टिक पेप्टाइड्स के आयन क्रोमेटोग्राम ने बफर बी (80% एसीटोनिट्रिल,) के एक ढाल में रिप्रसिलपुर सी18 एक्यू 1.9 माइक्रोन के साथ पैक उत्सर्जक केशिक कॉलम खींचा 0.1% एफए) और बफर ए (2% एसीटोनिट्रिल, 0.1% एफए) में 2% से 40% बी में 15 मिनट में 500 nL/min पर आरटी. डिटेक्शन एक मास-स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके किया गया था। प्रत्येक पेप्टाइड के लिए पूर्ण तीव्रता और निकाले गए मीटर/जेड पर्वतमाला को स्पेक्ट्रा के दाईं ओर दिखाया गया है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

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Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach

यहां हम अनुकूलित फ्लैशपैक केशिका कॉलम पैकिंग प्रक्रिया के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। एक आम 100-बार दबाव बम सेटअप के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का आवेदन 10 गुना तेजी से पैकिंग और लंबे अल्ट्रा-उच्च प्रदर्शन केशिका स्तंभों के निर्माण की अनुमति देता है।

फ्लैशपैक दृष्टिकोण के साथ सरल इन-हाउस अल्ट्रा-हाई परफॉर्मेंस कैपिलरी कॉलम विनिर्माण

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मोनोक्लोनल एंटीबॉडी isoforms की केशिका वैद्युतकणसंचलन पृथक्करण एक तटस्थ केशिका का उपयोग

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

बढ़ी नमूना संयुक्त पूर्वगामी समस्थानिक लेबलिंग और समदाब रेखीय टैगिंग का उपयोग ऊतकों की Multiplexing (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis एलिगेंस में उच्च प्रवाह रासायनिक स्क्रीनिंग के लिए एक सरल तरीका

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

AtHIRD11 आंतरिक विकार का विश्लेषण और धातु आयनों की ओर बाध्यकारी केशिका जेल ट्रो और अपनत्व केशिका ट्रो

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

एंजाइमी उत्पादन और Diterpenoid प्राकृतिक उत्पादों के शोधन के लिए एक अनुकूलन दृष्टिकोण

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

इम्यूनोरेक्शन बढ़ाने वाली तकनीक का उपयोग करके अल्ट्रा-हाई-स्पीड वेस्टर्न ब्लॉट

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

मल्टी-कॉलम प्लेट एडाप्टर का उपयोग करके एक किफायती और बहुमुखी उच्च-थ्रूपुट प्रोटीन शुद्धिकरण प्रणाली

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

लिगांड परख (DRaCALA) के अंतर रेडियल केशिलरी एक्शन के साथ छोटे लिगांड के बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान करना

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry

केशिका वैद्युतकणसंचलन इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट्स की पूर्ण मात्रा

Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) are an important group of intracellular signaling molecules. Derived from inositol phosphates (InsPs), these molecules ...