Name: simple in-house ultra-high performance capillary column manufacturing with the flashpack approach
Uploaded: 2021-12-04T14:00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach at JoVE.com

Работа была поддержана грантом РНФ 20-14-00121. Авторы благодарят. В. Шляху (Мемориальный онкологический центр Слоуна Кеттеринга) за плодотворные дискуссии.

<ol>
	<li>Shishkova, E., Hebert, A. S., Now Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Now,+more+than+ever,+proteomics+needs+better+chromatography.">Now, more than ever, proteomics needs better chromatography.</a> Cell Systems. 3 (4), 321-324 (2016).</li><li>Shliaha, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle-down+proteomic+analyses+with+ion+mobility+separations+of+endogenous+isomeric+proteoforms.">Middle-down proteomic analyses with ion mobility separations of endogenous isomeric proteoforms.</a> Analytical Chemistry. 92 (3), 2364-2368 (2020).</li><li>. Pressure injection cells - next advance - laboratory instruments Available from: <a target="_blank" href="https://www.nextadvance.com/pressure-injection-cells-lc-ms-capillary-column-packing-loader/?target=Overview">https://www.nextadvance.com/pressure-injection-cells-lc-ms-capillary-column-packing-loader/?target=Overview</a> (2021)</li><li>Kovalchuk, S. I., Jensen, O. N., Rogowska-Wrzesinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlashPack:+Fast+and+simple+preparation+of+ultrahigh-performance+capillary+columns+for+LC-MS.">FlashPack: Fast and simple preparation of ultrahigh-performance capillary columns for LC-MS.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 18 (2), 383-390 (2019).</li><li>MacNair, J. E., Lewis, K. C., Jorgenson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh-pressure+reversed-phase+liquid+chromatography+in+packed+capillary+columns.">Ultrahigh-pressure reversed-phase liquid chromatography in packed capillary columns.</a> Analytical Chemistry. 69 (6), 983-989 (1997).</li><li>Bruns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slurry+concentration+effects+on+the+bed+morphology+and+separation+efficiency+of+capillaries+packed+with+sub-2+&#181;m+particles.">Slurry concentration effects on the bed morphology and separation efficiency of capillaries packed with sub-2 &#181;m particles.</a> Journal of Chromatography. A. 1318, 189-197 (2013).</li><li>Godinho, J. M., Reising, A. E., Tallarek, U., Jorgenson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+high+slurry+concentration+and+sonication+to+pack+high-efficiency,+meter-long+capillary+ultrahigh+pressure+liquid+chromatography+columns.">Implementation of high slurry concentration and sonication to pack high-efficiency, meter-long capillary ultrahigh pressure liquid chromatography columns.</a> Journal of Chromatography. A. 1462, 165-169 (2016).</li><li>Andrzejczak, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+phytoglobin+overexpression+on+the+plant+proteome+during+nonhost+response+of+barley+(Hordeum+vulgare)+to+wheat+powdery+mildew+(Blumeria+graminis+f.+sp.+tritici).">The effect of phytoglobin overexpression on the plant proteome during nonhost response of barley (Hordeum vulgare) to wheat powdery mildew (Blumeria graminis f. sp. tritici).</a> Scientific Reports. 10 (1), 9192 (2020).</li><li>Elchaninov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+transcriptome,+proteome,+and+miRNA+profile+of+kupffer+cells+and+monocytes.">Comparative analysis of the transcriptome, proteome, and miRNA profile of kupffer cells and monocytes.</a> Biomedicines. 8 (12), 627 (2020).</li><li>Babenko, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Draft+genome+sequences+of+Hirudo+medicinalis+and+salivary+transcriptome+of+three+closely+related+medicinal+leeches.">Draft genome sequences of Hirudo medicinalis and salivary transcriptome of three closely related medicinal leeches.</a> BMC Genomics. 21 (1), 331 (2020).</li><li>Babenko, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+unusual+peptides+with+new+Cys+frameworks+in+the+venom+of+the+cold-water+sea+anemone+Cnidopus+japonicus.">Identification of unusual peptides with new Cys frameworks in the venom of the cold-water sea anemone Cnidopus japonicus.</a> Scientific Reports. 7 (1), 14534 (2017).</li><li>Loughran, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusually+efficient+CUG+initiation+of+an+overlapping+reading+frame+in+POLG+mRNA+yields+novel+protein+POLGARF.">Unusually efficient CUG initiation of an overlapping reading frame in POLG mRNA yields novel protein POLGARF.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (40), 24936-24946 (2020).</li><li>Radzisheuskaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT5+methylome+profiling+uncovers+a+direct+link+to+splicing+regulation+in+acute+myeloid+leukemia.">PRMT5 methylome profiling uncovers a direct link to splicing regulation in acute myeloid leukemia.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (11), 999-1012 (2019).</li><li>Rubtsova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+encoded+in+human+telomerase+RNA+is+involved+in+cell+protective+pathways.">Protein encoded in human telomerase RNA is involved in cell protective pathways.</a> Nucleic Acids Research. 46 (17), 8966-8977 (2018).</li><li>Maiolica, A., Borsotti, D., Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-made+frits+for+nanoscale+columns+in+proteomics.">Self-made frits for nanoscale columns in proteomics.</a> PROTEOMICS. 5 (15), 3847-3850 (2005).</li><li>Ishihama, Y., Rappsilber, J., Andersen, J. S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcolumns+with+self-assembled+particle+frits+for+proteomics.">Microcolumns with self-assembled particle frits for proteomics.</a> Journal of Chromatography. A. 979 (1-2), 233-239 (2002).</li><li>Shishkova, E., Hebert, A. S., Westphall, M. S., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+pressure+(&gt;30,000+psi)+packing+of+capillary+columns+enhancing+depth+of+shotgun+proteomic+analyses.">Ultra-high pressure (&gt;30,000 psi) packing of capillary columns enhancing depth of shotgun proteomic analyses.</a> Analytical Chemistry. 90 (19), 11503-11508 (2018).</li></ol>

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Упаковка капиллярных колонн на дому очень популярна в крупных лабораториях, работающих над несколькими независимыми проектами. Однако распространенный метод упаковки из суспензии сорбента низкой концентрации имеет серьезные ограничения в скорости и не может производить длинные колонны UHPLC.
FlashPack является модификацией стандартной процедуры упаковки, которая делает возможной упаковку с очень высокой концентрацией сорбента. Теоретическая основа метода заключается в непрерывной дестабилизации купола сорбента на входе в колонну на протяжении всего срока упаковки. Последнее технически достигается за счет непрерывного удара по входу в колонну магнитным стержнем. Метод дестабилизации купола намеренно разработан, чтобы иметь настройку упаковки, полностью похожую на обычный процесс упаковки, но хитрость FlashPack заключается в деталях приготовления сорбентной суспензии, капиллярного позиционирования и использования магнитного стержня в процессе упаковки.
Сорбентная суспензия получают в виде слоя сорбента осадка в большом объеме растворителя. Интересно, что упаковка на основе бомбы под давлением не требует одинаковых условий упаковки для колонки к колонке. В FlashPack мы никогда не знаем точную концентрацию сорбентной суспензии вокруг входа в колонну. Его невозможно точно измерить и контролировать, так как он также изменяется в процессе упаковки. Тем не менее, конечные колонки по-прежнему очень воспроизводимы4 независимо от того, как была достигнута упаковка.
Основа быстрой упаковки лежит в эффективной дестабилизации купола сорбента. По этой причине важно контролировать поступление сорбента в капилляр и поддерживать оптимальные условия дестабилизации купола на протяжении всего срока упаковки. Существует несколько возможных проблем, которые могут помешать эффективной доставке сорбента. Некоторыми примерами этого являются успендирование слоя сорбента быстрым вращением магнитного стержня, неэффективная дестабилизация купола из-за неправильного относительного капилляра к позиционированию магнитного стержня или слишком медленного вращения магнитного стержня. Сами вопросы и способы их решения подробно обсуждаются в разделе протокола.
После упаковки столбца основным параметром столбца, который необходимо проверить, является обратное давление столбца. Значения давления, перечисленные в таблице 5, обеспечивают ориентир на то, что ожидается для одного из популярных сорбентов размером шарика 2 мкм - ReproSil PUR C18 AQ (1,9 мкм). В то же время дополнительное обратное давление может быть добавлено фритом или слишком узкотянутым излучателем, и за этим следует постоянно следить. Если упаковка производится в вытащенный излучатель, мы все равно предлагаем измерить ожидаемое давление в колонке для конкретного сорбента, сначала упаковав фритированные капилляры, а затем посмотреть, добавляет ли самособирающийся фрит слишком много. Для любых проблем с высоким давлением используйте руководящие принципы, приведенные в таблице 1, чтобы точно определить проблему.
По нашему опыту, упакованная колонна без обесцвечивания, зазоров и с надлежащим обратным давлением работает в 100% случаев и дает качество разделения, близкое к тому, что можно ожидать от длины колонны и характеристик сорбента. Колонка с обесцвечиванием не гарантирует правильной работы, но все же может дать удовлетворительные результаты.
В большинстве случаев, если есть какие-либо проблемы с качеством сепарации, они исходят не из самой колонны, а скорее из других частей системы разделения, а именно насосов, растворителей или соединений. Особенно потенциально вредны любые соединения после столбца. Плохая связь с мертвым объемом между излучателем и фритированной колонной приводит к значительному пиковой расширяющейся и хвостохранилищу из-за очень низких скоростей потока в капиллярной хроматографии.
Еще одна важная проблема, характерная для подхода FlashPack, заключается в том, что он использует много дорогих сорбентов в рабочем флаконе сорбента. Пожалуйста, помните, что сорбентная суспензия в FlashPack предназначена для многократного использования. Позаботьтесь о сорбенте. Избегайте ненужного перемешивания магнитного стержня, чтобы уменьшить измельчение сорбента - не забудьте остановить вращение, как только упаковка будет закончена. И не оставляйте открытый флакон сорбента в бомбе давления, чтобы избежать высыхания сорбента. Хотя сорбент все еще можно использовать после этого, требуется время, чтобы переделать сорбентную суспензию.
Метод одинаково хорошо работает как для фритированных капилляров, так и для капилляров с вытягиваемым излучителем. Принцип FlashPack увеличивает скорость упаковки капиллярных идентификаторов с 20 до 250 мкм (все меньше и больше не тестировались). Он также применим ко всем сорбентам, как полностью, так и поверхностно пористым, которые мы могли бы проверить (отражая, что образование купола сорбента в высокой концентрации сорбентной суспензии не ограничивается конкретно сорбентами RP). Кроме того, параметры растворителей явно влияют на упаковку в соответствии с их физико-химическими характеристиками. Например, менее вязкий ацетон дает еще более высокую скорость упаковки, чем метанол при том же давлении упаковки. Однако он также менее полярный, чем метанол, и уменьшает частицы сорбента, прилипающие друг к другу. Эффект сам по себе предотвращает образование купола сорбента в начале упаковки, когда расход еще высок. Однако снижение взаимодействия частиц сорбента также приводит к менее надежному самособирательной образованию фрита и более частой блокировке вытягиваемого конца во время упаковки. Таким образом, в то время как ацетон лучше подходит для упаковки фритированных капилляров, он менее подходит для капилляров с вытягиваемым излучателем, причем метанол в качестве растворителя суспензии медленнее, но подходит для обоих типов окончаний. Упаковка из гексана или дихлорметана (DCM) является крайним случаем перехода на ацетон из метанола: они еще менее полярны, поэтому полностью предотвращают образование купола сорбента, однако они вообще не пригодны для упаковки вытягивающим излучателем. Кроме того, было отмечено, что крайне низкая полярность DCM приводит к тому, что частицы сорбента прилипают к внутренней стенке капилляра и делают на ней толстый слой. Толщина слоя постепенно увеличивается и образуются случайные локальные блоки, в результате чего колонна упаковывается в несколько частей, разделенных областями без сорбента. Такой эффект наблюдался для сорбента C18 Peptide Aeris.
Еще одна наблюдаемая проблема заключалась в том, что сорбент YMC Triart C18 не суспендировался в метаноле должным образом, а образовывал какие-то хлопья. Тем не менее, это не мешает ему быть упакованным с FlashPack и давать очень приличную эффективность разделения (неопубликованные данные). Таким образом, не будучи оптимальным для некоторых случаев, метанол был наиболее универсальным растворителем для работы для всех испытанных сорбентов и колонок. Необходимо отметить, что мы еще не анализировали, как различные растворители суспензии влияют на эффективность разделения колонн. При этом эффективность колонок, упакованных из метанола, уже полностью равна коммерческим колонкам для тех же сорбентов4.
FlashPack - не единственный существующий подход к улучшению скорости упаковки колонок UHPLC. Быстрая упаковка из высокой концентрации сорбента также возможна при использовании упаковки сверхвысокого давления7. Преимущество FlashPack в том, что он намного проще, так как не требует специальных насосов сверхвысокого давления и бомб давления для подачи сорбента и капиллярных соединений. В то же время было продемонстрировано, что колонны, упакованные при экстремальных давлениях, могут иметь эффективность разделения выше, чем более низкие давления упакованные колонны17. И хотя FlashPack производит колонки, идентичные коммерческим, используемым в сравнении4,для которых мы не знаем метод упаковки, он еще не был протестирован, как колонки FlashPack противостоят упаковочным колоннам сверхвысокого давления.
Таким образом, описанный метод FlashPack может быть легко адаптирован к существующему протоколу упаковки в лаборатории с некоторыми изменениями, внесенными в протокол, в то время как настройка остается полностью прежней. Это ускоряет упаковку капиллярной колонны ВЭЖХ до нескольких минут и позволяет производить длинные капиллярные колонны UHP, что явно невозможно при стандартной процедуре упаковки. Общая экономия времени и денег для лаборатории за счет применения подхода FlashPack может исчисляться десятками тысяч евро в год. Кроме того, возможность локального производства капиллярных колонн UHP открывает возможности для экспериментальной настройки, невозможной с доступными коммерческими продуктами.

Современная протеомика основана на жидкостной масс-спектрометрии с жидкостной хроматографией со сверхвысокой производительностью нанопоточной хроматографии (внутренний диаметр колонки 50-150 мкм (ID)), обеспечивающей наилучшую скорость анализа ичувствительность 1. В то время как многочисленные коммерческие капиллярные колонны UHPLC доступны, их цена составляет основную часть стоимости расходных материалов, особенно когда в лаборатории выполняется несколько разнообразных проектов, и загрязнение колонн для конкретных проектов является частой проблемой. Кроме того, упаковка колонн на месте позволяет использовать пользовательские экспериментальные сорбенты (такие как, например, сорбент polyCAT-A2)и характеристики колонн, недоступные для покупки в качестве готовой колонны.
Чтобы справиться с этим, многие лаборатории упаковывают капиллярные колонны в свои дома. Однако обычная процедура упаковки с бомбой давления 100 бар (инжекционная ячейка давления)3 плохо подходит для упаковки колонны UHPLC из-за высокого обратного давления сорбентов UHPLC менее 2 мкм, что приводит к резкому снижению скорости упаковки по сравнению с сорбентами ВЭЖХ большего размера. В то время как короткие колонны UHPLC все еще могут быть очень медленно упакованы, производство длинных колонн UHPLC физически невозможно4.
Стандартная капиллярная колонковая упаковка производится при относительно низких давлениях – до 100 бар, и с очень низкой концентрацией сорбента в суспензии. Таким образом, можно найти два возможных направления ускорения процесса. Возможно увеличение давления упаковки на5. Однако для этого требуется специальное оборудование и, практически, установка нового метода в лаборатории. Другим способом является повышение концентрации сорбента в суспензии6. Упаковка с высокой концентрацией сорбента в суспензии описана в сочетании со сверхвысоким давлением упаковки в предыдущей публикации7. Однако при давлении 100 бар, которое используется в большинстве существующих упаковочных бомб, более высокая концентрация сорбента приводит либо к замедлению скорости упаковки, либо к полному прекращению упаковки. Недавно было продемонстрировано, что эффект обусловлен кластеризацией сорбентов на входе в колонну, и был предложен простой трюк дестабилизации купола сорбента путем забивания входа в колонну магнитным стержнем внутри флакона сорбента4. Полученный метод, названный FlashPack, использует ту же установку упаковки бомбы давления 100 бар. В то же время незначительные, но критические изменения в процедуре упаковки позволяют упаковывать из очень высокой концентрации сорбентного шлама и производить очень длинные колонны UHPLC (от 50 до 70 см и длиннее) менее чем за час, в то время как короткая колонна может быть изготовлена за минуты с качеством разделения, равным коммерческим колонкам с теми же параметрами4. Подход FlashPack уже успешно использовался в нескольких проектах протеомики для получения как обратных фаз (RP)8,9,10,11,12,13,14, так и гидрофильного взаимодействия (HILIC)2 капиллярных колонн.
Здесь мы подробно опишем модификации, необходимые для адаптации подхода FlashPack к стандартной процедуре упаковки бомбы под давлением 100 бар.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.59002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Scoring Wafer</td>
			<td>Restek</td>
			<td>20116</td>
			<td>any ceramic wafer is suitable for capillary polishing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-chip bladed scribe</td>
			<td>NewObjective</td>
			<td>Diamond-chip bladed scribe</td>
			<td>recommended for capillary cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fused silica capillary 100 mm ID 375 mm OD</td>
			<td>CM Scientific</td>
			<td>TSP100375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GELoader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30001222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Ultimate3000 RSLCnano</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P2000/F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnet bar 2x5 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z283819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microspatula</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z193216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK ferrule 360 mm</td>
			<td>VICI</td>
			<td>JR-C360NFPK</td>
			<td>use to connect the column to UPLC union</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tip, 1000 uL</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z740095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 1000 uL</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman L P1000L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure bomb</td>
			<td>NextAdvance</td>
			<td>PC-77 MAG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>regulator</td>
			<td>GCE</td>
			<td>Jetcontrol 600 200/103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 mm</td>
			<td>Dr. Maisch</td>
			<td>r13.aq.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 0.5 mL</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AXYST050SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 1.5 mL</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AXYST150SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw caps with O-rings</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AXYSCOC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonication bath</td>
			<td>Elma</td>
			<td>Elmasonic S30 H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>union HPLC</td>
			<td>VICI</td>
			<td>JR-C360RU1PK6</td>
			<td>HPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>union UPLC</td>
			<td>VICI</td>
			<td>JR-C360RU1FS6</td>
			<td>UPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vortex</td>
			<td>BioSan</td>
			<td>V-1plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% (v/v) Formic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.59013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple in-house ultra-high performance capillary column manufacturing with the flashpack approach

Капиллярная сверхвысокопроизводительная жидкостная хроматография (UHPLC) в настоящее время является очным методом для стадии разделения образцов в протеомике на основе LC-MS. Однако капиллярные колонны гораздо менее надежны по сравнению с их более высокими контртипами потока. Из-за легкого загрязнения и блокировки они часто нуждаются в замене. Это делает их заметно дорогостоящей частью общей стоимости анализа LC-MS. Фирменные упаковки капиллярных колонн UHPLC экономят много денег и позволяют настраивать их. Однако стандартная процедура упаковки в бомбе под давлением 100 бар хорошо работает только для колонок ВЭЖХ, но слишком медленна для сорбентов UHPLC. Здесь мы предоставляем описание оптимизированного протокола FlashPack, применяемого к той же установке бомбы давления 100 бар. Метод основан на упаковке из суспензии сверхвысокой концентрации сорбента и разработан для самостоятельного изготовления капиллярных колонн UHPLC неограниченной длины в разумные сроки.

Подход FlashPack основан на стандартной настройке упаковки и следует тому же конвейеру упаковки. Упаковка производится в стандартные фритированные или вытянутые излучающие капилляры. Принципиальная оптимизация заключается в концентрации сорбентной суспензии: стандартный метод несовместим с высококонцентрированной суспензией сорбента, используемой во FlashPack. Результатом является быстрый метод производства длинных колонн UHPLC, например, колонны, упакованной на длину 50 см с сорбентом 1,9 мкм менее чем за 1 ч(рисунок 2).
Для демонстрации применения подхода FlashPack была подготовлена капиллярная колонка ID 30 см 100 мкм(таблица 6). Упаковка сорбента ReprosilPur C18 1,9 мкм была выполнена при 60 барах в капилляр излучателя длиной 50 см длиной 100 мкм ID, подготовленный лазерным съемщиком P2000. Капилляр упаковывали до ~40 см за 40 мин с еще одним рыхлым сорбентом, оставленным внутри капилляра. Упакованный капилляр был подключен к системе ВЭЖХ и работал со скоростью 300 нл/мин с растворителем B (80% ацетонитрила, 0,1% FA). После двух раундов по 5 с ультразвуком окончательная упакованная длина составила 43 см. Колонна была отсоединена, разрезана до 30 см и подключена к системе ВЭЖХ с помощью соединения UHPLC. Мы регулярно используем 360 мкм без рукавов с ореховым наконечником PEEK и 360 мкм из нержавеющей стали. Эта комбинация вмещает не менее 700 стержней, если сильно затянута. Изготовленная колонна имеет обратное давление 520 бар при 2% растворителе В при 500 нЛ/мин, что соответствует ожидаемому диапазону значений(таблица 5).
В качестве демонстрации эффективности колонны мы использовали изготовленную колонку 30 см для отделения 50 фмоль триптического дайджеста белка цитохрома С в 15-минутном градиенте от 2% до 50% В. Извлеченные ионные хроматограммы показали, что пики очень симметричны с минимальным хвостом. Средний FWHM составлял около 3 с(рисунок 3).
Таблица 1: Устранение неполадок при высоком рабочем обратном надавлии колонны. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table1_HighColPressurev2.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Таблица 2: Программа лазерного съемника P2000/F. Программа лазерного съемника P2000/F для получения капилляров вытягиваемого излучателя от 360 мкм OD 100 мкм ID расплавленных капилляров с полиимидным покрытием кремнезема без внутреннего покрытия при комнатной температуре 23-25 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table2_P2000F%20laser%20puller%20program.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Таблица 3: Специфические для FlashPack вопросы упаковки и контрольные точки для контроля в процессе упаковки. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table3_sorbentDeliveryIssuesss.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Таблица 4: Примерные скорости упаковки и рабочего потока для различных идентификаторов колонок и длины. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table4%20Exemplary%20packing%20and%20working%20flow%20rates.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Таблица 5: Ожидаемое обратное давление для колонки, заполненной сферическими сорбентами 2 μм и работающей со скоростью рабочего потока (согласно идентификатору столбца) в системе растворителей RP на RT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table5_Expected%20backpressure.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Таблица 6: Примерная упаковка 30 см колонки UHPLC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table6_Exemplary%20packing%20of%2030%20cm%20UHPLC%20columnv2.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig01.jpg"> Рисунок 1:Схема упаковки капиллярной колонны. Этапы с 1 по 3 являются подготовительными, за которыми следует упаковка бомбы под давлением и завершается упаковкой ВЭЖХ. Этапы 3 и 4 модифицированы для сверхэффективного протокола FlashPack. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig02.jpg"> Рисунок 2:Скорость упаковки для фритированного капилляра 100 мкм ID с ReprosilPur C18 AQ 1,9 мкм при 100 барах метанола. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig03.jpg"> Рисунок 3:Экстрагированные ионные хроматограммы триптических пептидов цитохрома С. Экстрагированные ионные хроматограммы триптических пептидов цитохрома С после разделения 50 фмоль в 30 см длиной 100 мм ID вытягиваемой излучательной капиллярной колонкой, упакованной ReprosilPur C18 AQ 1,9 мкм в градиенте буфера B (80% ацетонитрила, 0,1% FA) и в буфере A (2% ацетонитрила, 0,1% FA) от 2% до 40% B через 15 мин при 500 нл/мин при RT. Обнаружение проводили с помощью масс-спектрометра. Абсолютные интенсивности и извлеченные диапазоны m/z для каждого пептида показаны справа от спектров. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach at JoVE.com

Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach

Здесь мы представляем протокол для оптимизированной процедуры упаковки капиллярных столбцов FlashPack. Применение оптимизированного протокола к общей установке бомбы давления 100 бар позволяет в 10 раз ускорить упаковку и изготовление длинных сверхвысокопроизводительных капиллярных колонн.

Простое производство капиллярных колонн на месте с помощью FlashPack

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Изучение протеасоме Ассамблею с рекомбинантным архейных Протеасомы и нативных ПААГ: Случай для комбинированного подхода

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Капиллярный электрофорез Разделение моноклональных антител изоформ с нейтральным капилляра

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Enhanced Sample мультиплексирование тканей с использованием комбинированного прекурсорами изотопной метки и изобарической Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Простой метод для высокой пропускной способности химического скрининга в Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Анализ AtHIRD11 внутренние беспорядки и привязки к ионов металлов Капиллярный электрофорез и близость капиллярного электрофореза

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Настраиваемый подход к ферментативным производством и очистке терепенидов натуральных продуктов

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Ультра-высокоскоростной западный пятно с использованием иммунореакции Повышение технологии

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Экономичная и универсальная высокопроизводительная система очистки белка с использованием многоколоночного пластинчатого адаптера

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Идентификация связывающих белков малых лигандов с дифференциальным радиальным капиллярным действием лигандного анализа (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Абсолютное количественное определение пирофосфатов инозитола методом масс-спектрометрии капиллярного электрофореза Электрораспылительная ионизация масс-спектрометрии

Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) are an important group of intracellular signaling molecules. Derived from inositol phosphates (InsPs), these molecules ...