Name: simple in-house ultra-high performance capillary column manufacturing with the flashpack approach
Uploaded: 2021-12-04T14:00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach at JoVE.com

Arbetet stöddes av RSF-anslag 20-14-00121. Författarna tackar P. V. Shliaha (Memorial Sloan Kettering Cancer Center) för givande diskussioner.

Förpackningsprotokollet består av fem steg(figur 1): 1) Beredning av förpackningsstationer, 2) kapillärberedning, 3) sorbentslamberedning, 4) kapillärförpackning i tryckbomben och 5) kolonnförpackning i HPLC-systemet, uppskärning upp till storlek och UHPLC-anslutningsinstallation. FlashPack-optimeringen kräver justeringar i avsnitten 3 och 4 jämfört med det gemensamma protokollet.
1. Montering av packningsstationer
<ol><li>Förbered en gastank fylld med antingen kväve, helium eller argon som är utrustad med en gasregulator i ett steg med utloppstrycket > 50 bar. Maximalt tryck begränsas av tryckbombskompatibiliteten.</li>
	<li>Anslut regulatorn till tryckbombens ventilationsventil.</li>
	<li>Om tryckbomben inte är utrustad med en integrerad magnetomrörare, placera bomben på en magnetomrörare.</li>
	<li>Anslut ett smalt ID-plaströr (t.ex. 0,13 mm) till tryckbombens ventilationsutlopp och lägg det i ett kärl med vatten.</li>
</ol>2. Kapillärpreparat
<ol><li>Förbered en fritted kapillär med en integrerad glasfrit bildad av Kasil och formamid15 eller en pulled emitter kapillär beredd av en laserdragare16. Kapillären är gjord 10-15 cm längre än den avsedda kolonnlängden. OBS: Se tabell 1 för diskussion om möjliga problem i samband med olika kapillärstorlekar och frittyper. Tabell 2 innehåller ett exempel på ett P2000 laserdragarprogram för att göra kapillärer med pulled-emitter.</li>
	<li>Skydda en utdragen emitterände med en skuren gellastande pipettspets.<ol>
<li>Skär spetsen så att den passar tätt runt 360 μm OD-kapillären (den kan flyttas längs kapillären men kräver viss ansträngning för att göra det).</li>
		<li>Skjut den skurna pipettens spets på kapillären från kapillärens framände och flytta den upp till emitteränden.</li>
		<li>Skjut tillbaka skyddsspetsen när kolonnen sprutar. Skjut spetsen framåt för att få sändarens ände inuti spetsen när kolonnen inte sprutar (även när kolonnen är under flödet, men fortfarande inte sprutar).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Sorbent slurry förberedelse
<ol><li>Förbered en stock sorbentflaska: Placera ~50 mg torr sorbent i ett 1,5 ml centrifugrör. Här används Reprosil Pur C18 som ett exempel.</li>
	<li>Tillsätt 1 ml metanol till sorbentröret.</li>
	<li>För att blanda det helt, virvla röret i 10 s med en virvelblandare.</li>
	<li>Sonicate i ett ultraljudsbehandling bad för 10 s.</li>
	<li>Låt sorbenten blötläggas ordentligt i 20-30 min. Sedan, virvel och sonikera det en gång till.</li>
	<li>Förbered en fungerande sorbentflaska. Använd en konisk bottenflaska som passar in i bomben. OBS: Det kan vara antingen ytterligare ett 1,5 mL centrifugrör eller någon annan flaska beroende på den specifika tryckbombsdesignen. För detta experiment används koniskt bottenskruvlockrör som skärs till tryckbombens höjd.</li>
	<li>Återanvänd sorbenten i stocksorbentflaskan och överför 500 μL till den arbetande sorbentflaskan med en magnetstång av 2 x 3 mm storlek.</li>
	<li>Lägg till metanol upp till ~ 1 ml till arbetsflaskan.</li>
	<li>Låt arbetsflaskan stå på bordet i 10 min för att sorbenten ska sätta sig genom gravitationen.</li>
	<li>Om sorbentskiktet efter sedimentering är under 4 mm, tillsätt mer av stockslamslam och vänta på att sorbenten ska nöja sig med ytterligare 10 min. OBS: Den förberedda arbetsflaskan är avsedd för beredning av flera kolumner under månader. Om den arbetande sorbentflaskan stannar utan omrörning i mer än 2 h, måste den virveleras i 10 s, sonicated i 10 s och lösas genom gravitation. Rutinmässigt återanvänds sorbenten på morgonen innan den packas. Då är det bra för packning för hela dagen om det inte finns några långa pauser mellan sekventiell kolonnförpackning. Om sorbenten i arbetsflaskan torkar ut, tillsätt metanol och kör hela sorbentberedningsförfarandet som för beståndet sorbentflaska (steg 3.2-3.5).</li>
</ol>4. Kapillärförpackning i en tryckbomb
VARNING: Använd alltid skyddsglasögon när du arbetar med tryckbomben. Använd inte handskar. Dessa minskar allvarligt känslan av beröring som krävs för korrekt hantering av kapillärer med liten diameter och leder till misstag.
<ol><li>Placera sorbentflaskan i tryckbomben och fixera alla muttrar ordentligt.</li>
	<li>Starta rotationen vid 60-100 varv/min.</li>
	<li>Sätt in den fritted eller pulled emitter kapillären i bomben: tryck den till botten av injektionsflaskan och lyft sedan upp den 2-3 mm och fixa muttern. OBS: Använd en minsta kraft för att fixera kapillären för att undvika kapillär- och ferruleskador. Det bästa är handdragning. Om en hex-skiftnyckel används, applicera minsta möjliga ansträngning för åtdragning.</li>
	<li>Kontrollera om kapillären är ordentligt fast - det måste vara omöjligt att flytta kapillären genom att dra ut den för hand.</li>
	<li>Öppna tryckbombsventilen mycket långsamt samtidigt som kapillärens öppna ände hålls riktad bort från ansiktet.</li>
	<li>Titta på de första stegen i förpackningsprocessen. OBS: Omedelbart efter trycksättning fyller sorbenten kapillären och den blir icke-transparent för hela längden. Så snart sorbenten börjar packa inuti den distala änden ökar mottrycket, flödet saktar ner och den jämna sorbentslammet inuti kapillärreformerna i flera sorbentpaket åtskilda av sorbentfria luckor. Redan packad sorbent är synlig som en tätt färgad kontinuerligt växande region.</li>
	<li>Håll de sorbentfyllda regionerna minst 70% av kapillärlängden med små sorbentfria luckor under hela förpackningsprocessen.</li>
	<li>Det finns flera vanliga problem att titta på under förpackningsprocessen, som kräver justering av installationen på flyget för att hålla effektiv sorbentleverans till kapillären. OBS: Mer information om justeringen av sorbentleveransens effektivitet beskrivs i tabell 3.<ol>
<li>Nummer 1: När ny sorbent slutar komma in i kapillären medan sorbenten redan inuti fortsätter att röra sig, följ stegen nedan. OBS: Detta är det vanligaste problemet. I de flesta fall blockeras kapilläringen av självaggregering av sorbentkluster. Använd följande steg en efter en tills sorbentflödet återställs och hoppa sedan över resten av de problemrelaterade stegen.<ol>
<li>Öka rotationshastigheten till 500 varv/min och minska den omedelbart till 60-100 varv/min. Vanligtvis återställer det sorbentflödet. Kontrollera att rotationshastigheten är minst 60 varv/min under resten av förpackningsprocessen.</li>
			<li>Om det inte hjälper, ventilera kort förpackningsbomben och tryck omedelbart tillbaka den.</li>
			<li>Om det inte hjälper eller blockeringen händer igen, flytta kapillären inuti sorbentskiktet. Frånvaron av sorbenten kan bero på att kapillärens öppna ände antingen är för hög ovanför magnetstången, så kolonnänden rör inte den eller kapillären som fastnar i injektionsflaskans botten. Ventilera först bomben helt, lossa muttern, tryck kapillären till botten och dra den sedan 2 mm tillbaka. Fixa muttern.</li>
			<li>Om blockeringen kvarstår, ventilera systemet, ta ut sorbentflaskan och virveln och sonikera den en gång till. Kontrollera kapillärens främre ände för skador under mikroskopet och skär ~ 5 mm av frontänden om det behövs.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Nummer 2: När sorbenten bara fyller en liten del av kapillären med långa tomma områden, följ stegen nedan.<ol>
<li>Kontrollera rotationshastigheten. Om rotationen är för långsam är kupolbrottet inte tillräckligt effektivt. Öka rotationshastigheten till ~150 varv/min.</li>
			<li>Om rotationen är för snabb, blir sorbenten återsuspenderad i den större injektionsflaskans volym och den lokala sorbentkoncentrationen runt kolonningången är låg. Sänk rotationshastigheten till 60-100 VARV/min.</li>
			<li>Kontrollera sorbentnivån. Samma problem med lite sorbent inuti kapillären observeras när det inte finns tillräckligt med sorbent i injektionsflaskan. När sorbenten blir uttrigerad, fyll injektionsflaskan med den nya sorbenten för att hålla sorbentskiktet inte mindre än 4 mm högt efter gravitationsinducerad sedimentering.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Fortsätt att packa kolonnen tills målkolonnens längd plus 5-7 cm uppnås.</li>
	<li>Stoppa rotationen och tryck mycket långsamt ner bomben.<ol>
<li>Öppna bombventilen lite och vänta tills bubblan spricker inuti vattenflaskan för att avta. Öppna sedan ventilen lite bredare och vänta igen på att bubblan spricker för att sakta ner.</li>
		<li>Släpp ut trycket i steg tills ingen gas kommer ut ur ventilen. OBS: Öppna inte ventilen hela vägen på en gång - det kommer att leda till bubblande inuti kapillären och sorbenten som går tillbaka in i injektionsflaskan. Om det händer, tryck tillbaka bomben och vänta på att kolonnen ska packas igen.</li>
	</ol></li>
	<li>När gasen slutar komma ut ur ventilationsventilen, ta ut den packade kapillären ur tryckbomben. OBS: Låt inte kolonnen torka ut. Om den inte är ansluten till HPLC-systemet omedelbart för vidare förpackning, lägg den packade kapillären i förvaring genom att sänka den hel i 10% EtOH-lösning. En vätsketät behållare för förvaring av polypropylen kan användas för kapillärförvaring. Frånkopplade HPLC-kolumner lagras på samma sätt.</li>
	<li>Om ingen ytterligare förpackning planeras, ta ut sorbentflaskan från bomben och stäng den tätt. Behåll den för ytterligare kolonnpackning.</li>
</ol>5. Förpackning i HPLC-kolumnen
<ol><li>Anslut den packade kapillären till HPLC-systemet via en HPLC-anslutning.</li>
	<li>Starta flödet vid 95% lösningsmedel B (80 eller 100% acetonitril, 0,1% myrsyra (FA)) med inriktning på 250-300 bar tryck. För 40 cm förpackad kapillär, använd flödeshastigheten 200-300 nL/min. OBS: Förpackningsflödet är 200 nL/min för 40-50 cm kolonn med 100 μm ID förpackat med 2 μm sorbent. Vissa andra kolumnstorlekar visas i tabell 4. Flödeshastigheter för andra kolumnlängder och ID:t beräknas utifrån den direkta proportionaliteten mellan mottrycket och kolonnlängden och tvärsnittet. Den exakta flödeshastigheten justeras till den faktiska packlängden, som som standard är längre än den riktade kolumnlängden. Observera också att 300 bar-trycket riktar sig mot den fysiska tryckgränsen för HPLC-anslutningen. För anslutningar med högre tryck ska högre flödeshastigheter upp till anslutningstryckgränsen användas för snabbare packning.</li>
	<li>Titta efter den lösa sorbenten inuti kapillären som packas och läggs till den totala packade längden.</li>
	<li>Utan att stoppa flödet, doppa kolonnkroppen två gånger i ultraljudsbehandlingsbadet. OBS: Sänk inte ned kolonnändarna och kapilläranslutningarna - endast en del av kolonnkroppen. Ultraljudsbehandling steg hjälper till att förbättra kolonn reproducerbarhet, särskilt för extremt långa kolumner >50 cm lång (opublicerade data); Det ger dock en slumpmässig chans att bryta den självmonterande sorbentfritten inuti emitteränden av den utdragna emitterkapillären och blockera kolonnen helt. Medan ultraljudsbehandling kan tillämpas universellt på alla glas-fritted kolumner, föreslår vi ultraljudsbehandling dragna emitter kolumner endast för kolonn längd > 50 cm.</li>
	<li>När sorbentbädden slutar krympa, doppa kolonnkroppen i ultraljudsbehandlingsbadet två gånger mer utan att stoppa flödet.</li>
	<li>Kör kolumnen i ytterligare 10 minuter vid 300 staplar.</li>
	<li>Stoppa flödet, vänta tills trycket sjunker till under tre staplar och koppla bort kolonnen.</li>
	<li>Inspektera kolumnen visuellt för bristen på luckor och missfärgningar. Om någon hittas kan ultraljudsbehandling under flödet upprepas. För kritiska experiment bör du överväga att skapa en ny kolumn.</li>
	<li>Klipp kolonnen till önskad längd. OBS: Korrekt skärning är en förutsättning för kolonneffektivitet. Gör ett hack i polyimidbeläggning med skribenten, knäck delvis kapillären och dra isär två stycken.</li>
	<li>Polera kolonnens framände på en keramisk skiva eller med lappfilm.</li>
	<li>Anslut kolumnen till LC-systemet igen med en UHPLC-anslutning.</li>
	<li>Starta arbetsflödet på 2 % B beroende på kolumn-ID enligt tabell 4. Vänta tills trycket ska balanseras och kontrollera kolonnens baktryck. ARBETSFLÖDESHASTIGHETEN justeras enligt kolumnparametrar. Till exempel körs en 30 cm lång 100 μm ID-kolumn vid 500 nL/min.</li>
	<li>Kontrollera att mottrycket ligger inom 5 % av det förväntade värdet (se tabell 5), Detta bekräftar att kolumnen är korrekt packad och klar att användas. OBS: Kolonnbaktrycket är det totala trycket i HPLC-systemets gradientkanal med kolonnen ansluten minus kapillärernas baktryck före kolonnen. Samtidigt är värdena i tabell 5 godtyckliga (de ger en godtycklig skala av vad man kan förvänta sig). Bakpressurens likhet inom laboratoriet från kolumn till kolumn är en viktigare indikator på att allt fungerar korrekt. Det faktiska absoluta mottrycket beror på många parametrar, såsom sorbentstorlek och egenskaper, kapillär-ID, tillverkare och sats, formen på den utdragna emitteränden eller glasfrittens densitet och längd, lösningsmedelsegenskaperna och omgivningstemperaturen i rummet etc. Om mottrycket är för högt, se tabell 1 för eventuella problem.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shishkova, E., Hebert, A. S., Now Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Now,+more+than+ever,+proteomics+needs+better+chromatography.">Now, more than ever, proteomics needs better chromatography.</a> Cell Systems. 3 (4), 321-324 (2016).</li><li>Shliaha, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle-down+proteomic+analyses+with+ion+mobility+separations+of+endogenous+isomeric+proteoforms.">Middle-down proteomic analyses with ion mobility separations of endogenous isomeric proteoforms.</a> Analytical Chemistry. 92 (3), 2364-2368 (2020).</li><li>. Pressure injection cells - next advance - laboratory instruments Available from: <a target="_blank" href="https://www.nextadvance.com/pressure-injection-cells-lc-ms-capillary-column-packing-loader/?target=Overview">https://www.nextadvance.com/pressure-injection-cells-lc-ms-capillary-column-packing-loader/?target=Overview</a> (2021)</li><li>Kovalchuk, S. I., Jensen, O. N., Rogowska-Wrzesinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlashPack:+Fast+and+simple+preparation+of+ultrahigh-performance+capillary+columns+for+LC-MS.">FlashPack: Fast and simple preparation of ultrahigh-performance capillary columns for LC-MS.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 18 (2), 383-390 (2019).</li><li>MacNair, J. E., Lewis, K. C., Jorgenson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh-pressure+reversed-phase+liquid+chromatography+in+packed+capillary+columns.">Ultrahigh-pressure reversed-phase liquid chromatography in packed capillary columns.</a> Analytical Chemistry. 69 (6), 983-989 (1997).</li><li>Bruns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slurry+concentration+effects+on+the+bed+morphology+and+separation+efficiency+of+capillaries+packed+with+sub-2+&#181;m+particles.">Slurry concentration effects on the bed morphology and separation efficiency of capillaries packed with sub-2 &#181;m particles.</a> Journal of Chromatography. A. 1318, 189-197 (2013).</li><li>Godinho, J. M., Reising, A. E., Tallarek, U., Jorgenson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+high+slurry+concentration+and+sonication+to+pack+high-efficiency,+meter-long+capillary+ultrahigh+pressure+liquid+chromatography+columns.">Implementation of high slurry concentration and sonication to pack high-efficiency, meter-long capillary ultrahigh pressure liquid chromatography columns.</a> Journal of Chromatography. A. 1462, 165-169 (2016).</li><li>Andrzejczak, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+phytoglobin+overexpression+on+the+plant+proteome+during+nonhost+response+of+barley+(Hordeum+vulgare)+to+wheat+powdery+mildew+(Blumeria+graminis+f.+sp.+tritici).">The effect of phytoglobin overexpression on the plant proteome during nonhost response of barley (Hordeum vulgare) to wheat powdery mildew (Blumeria graminis f. sp. tritici).</a> Scientific Reports. 10 (1), 9192 (2020).</li><li>Elchaninov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+transcriptome,+proteome,+and+miRNA+profile+of+kupffer+cells+and+monocytes.">Comparative analysis of the transcriptome, proteome, and miRNA profile of kupffer cells and monocytes.</a> Biomedicines. 8 (12), 627 (2020).</li><li>Babenko, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Draft+genome+sequences+of+Hirudo+medicinalis+and+salivary+transcriptome+of+three+closely+related+medicinal+leeches.">Draft genome sequences of Hirudo medicinalis and salivary transcriptome of three closely related medicinal leeches.</a> BMC Genomics. 21 (1), 331 (2020).</li><li>Babenko, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+unusual+peptides+with+new+Cys+frameworks+in+the+venom+of+the+cold-water+sea+anemone+Cnidopus+japonicus.">Identification of unusual peptides with new Cys frameworks in the venom of the cold-water sea anemone Cnidopus japonicus.</a> Scientific Reports. 7 (1), 14534 (2017).</li><li>Loughran, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusually+efficient+CUG+initiation+of+an+overlapping+reading+frame+in+POLG+mRNA+yields+novel+protein+POLGARF.">Unusually efficient CUG initiation of an overlapping reading frame in POLG mRNA yields novel protein POLGARF.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (40), 24936-24946 (2020).</li><li>Radzisheuskaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT5+methylome+profiling+uncovers+a+direct+link+to+splicing+regulation+in+acute+myeloid+leukemia.">PRMT5 methylome profiling uncovers a direct link to splicing regulation in acute myeloid leukemia.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (11), 999-1012 (2019).</li><li>Rubtsova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+encoded+in+human+telomerase+RNA+is+involved+in+cell+protective+pathways.">Protein encoded in human telomerase RNA is involved in cell protective pathways.</a> Nucleic Acids Research. 46 (17), 8966-8977 (2018).</li><li>Maiolica, A., Borsotti, D., Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-made+frits+for+nanoscale+columns+in+proteomics.">Self-made frits for nanoscale columns in proteomics.</a> PROTEOMICS. 5 (15), 3847-3850 (2005).</li><li>Ishihama, Y., Rappsilber, J., Andersen, J. S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcolumns+with+self-assembled+particle+frits+for+proteomics.">Microcolumns with self-assembled particle frits for proteomics.</a> Journal of Chromatography. A. 979 (1-2), 233-239 (2002).</li><li>Shishkova, E., Hebert, A. S., Westphall, M. S., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+pressure+(&gt;30,000+psi)+packing+of+capillary+columns+enhancing+depth+of+shotgun+proteomic+analyses.">Ultra-high pressure (&gt;30,000 psi) packing of capillary columns enhancing depth of shotgun proteomic analyses.</a> Analytical Chemistry. 90 (19), 11503-11508 (2018).</li></ol>

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Intern kapillär kolonnförpackning är mycket populär i stora laboratorier som arbetar med flera oberoende projekt. En vanlig förpackningsmetod från en låg koncentration sorbent suspension har dock stora begränsningar i hastigheten och kan inte producera långa UHPLC kolonner.
FlashPack är en ändring av standardförpackningen som gör det möjligt att packa från en mycket hög sorbentkoncentration. Den teoretiska grunden för metoden ligger i den kontinuerliga sorbent cupola destabiliseringen vid kolonningången under hela packningstiden. Det senare uppnås tekniskt genom att kolonningången kontinuerligt träffas med en magnetstång. Metoden för cupola destabilisering är avsiktligt utvecklad för att ha förpackningsinställningen helt lik den gemensamma förpackningsprocessen, men tricket med FlashPack ligger i detaljerna i sorbentslamberedningen, kapillärpositionering och magnetstånganvändning under förpackningsprocessen.
Sorbentslammet framställs som sedimentsorbentskikt i en stor lösningsmedelsvolym. Det är intressant att den tryckbombsbaserade packningen inte kräver samma förpackningsvillkor för kolonn till kolumn. I FlashPack vet vi aldrig den exakta sorbentslamkoncentrationen runt kolonningången. Det är omöjligt att mäta och kontrollera exakt, eftersom det också ändras under förpackningsprocessen. De slutliga kolumnerna är dock fortfarande mycket reproducerbara4 oavsett hur förpackningen uppnåddes.
Grunden för den snabba packningen ligger i den effektiva sorbent cupola destabiliseringen. Av denna anledning är det viktigt att kontrollera sorbent som kommer in i kapillären och att upprätthålla de optimala kupolstabiliseringsförhållandena under hela förpackningstiden. Det finns flera möjliga problem som kan förhindra effektiv sorbentleverans. Några exempel på dessa är sorbent lager resuspension genom snabb magnetisk stång rotation, ineffektiva kupol destabilisering på grund av antingen fel relativ kapillär till magnetstång positionering eller för långsam magnet bar rotation. Själva frågorna och hur de ska hanteras diskuteras i detalj i protokollavsnittet.
När kolumnen har packats är huvudkolumnparametern som ska kontrolleras kolumnbaktrycket. De tryckvärden som anges i tabell 5 ger en referenspunkt till vad som förväntas för en av de populära sub 2 μm pärla storlek sorbent-ReproSil PUR C18 AQ (1,9 μm). Samtidigt kan ytterligare baktryck tillsättas av friten eller en för smalt dragen emitter och man bör ständigt övervaka för det. Om packning görs i en pulled emitter, föreslår vi fortfarande att mäta det förväntade kolonnbaktrycket för den specifika sorbent som används genom att packa fritted kapillärer först, och sedan för att se om den självmonterande friten lägger till för mycket. För eventuella högtrycksproblem bör du använda riktlinjerna i tabell 1 för att identifiera problemet.
Enligt vår erfarenhet fungerar en packad kolumn utan missfärgningar, luckor och med rätt baktryck i 100% av fallen och ger separationskvaliteten nära vad som kan förväntas från kolonnlängden och sorbentegenskaperna. En kolumn med missfärgningar är inte garanterad att fungera korrekt men kan fortfarande ge tillfredsställande resultat.
För det mesta, om det finns några problem med separationskvaliteten, kommer de inte från kolonnen själv, utan snarare från andra delar av separationssystemet, nämligen pumpar, lösningsmedel eller anslutningar. Särskilt potentiellt skadliga är alla anslutningar efter kolumnen. Dålig anslutning med en död volym mellan emittern och den fritted kolonnen leder till stor toppbreddning och svansning på grund av mycket låga flödeshastigheter i kapillärkromatografi.
En annan viktig fråga som är specifik för FlashPack-metoden är att den använder många dyra sorbenter i en fungerande sorbent slurryflaska. Kom ihåg att sorbentslammet i FlashPack är avsett för flera användningsområden. Ta hand om sorbenten. Undvik onödig magnetstångsrörning för att minska sorbentslipning-kom ihåg att stoppa rotationen så snart förpackningen är klar. Och lämna inte den öppna sorbentflaskan i tryckbomben för att undvika sorbenttorkning. Även om sorbenten fortfarande kan användas efter det, tar det tid att göra om sorbentslammet.
Metoden fungerar lika bra för både fritted kapillärer och pulled-emitter kapillärer. FlashPack-principen ökar förpackningshastigheten för kapillär-ID från 20 till 250 μm (mindre och större testades inte). Det är också tillämpligt på alla sorbenter, både helt och ytligt porösa, vi kunde testa (vilket återspeglar att sorbent cupola-formationen i hög sorbentslamkoncentration inte är begränsad specifikt till RP-sorbenter). Dessutom påverkar lösningsmedelsparametrar tydligt förpackningen enligt deras fysiska och kemiska egenskaper. Till exempel ger mindre trögflytande aceton ännu högre förpackningshastighet än metanol vid samma förpackningstryck. Men det är också mindre polart än metanol och minskar sorbentpartiklar som fastnar på varandra. Effekten i sig förhindrar sorbent kupolbildning i början av förpackningen när flödet fortfarande är högt. Men minskning av sorbent partikelinteraktion leder också till mindre tillförlitlig självmonterande fritbildning och mer frekvent pulled-end blockering under förpackningen. Så även om aceton är bättre för förpackning av fritted kapillärer, är den mindre lämplig för pulled-emitter kapillärer, med metanol som ett slamlösningsmedel som är långsammare men lämpligt för båda typerna av ändelse. Förpackning från hexan eller diklormetan (DCM) är extrema fall av byte till aceton från metanol: de är ännu mindre polära, så de förhindrar sorbent kupolbildning helt, men de är inte lämpliga för pulled-emitter packning alls. Dessutom noterades det att extremt låg DCM polaritet leder till sorbentpartiklar som fastnar på den inre kapillärväggen och gör ett tjockt lager på den. Skikttjockleken växer gradvis och slumpmässiga lokala block bildas vilket resulterar i att kolonnen packas i flera delar åtskilda av regioner utan sorbent. Sådan effekt observerades för C18 Peptide Aeris sorbent.
Ett annat observerat problem var YMC Triart C18 sorbent inte suspenderas i metanol ordentligt, men att bilda någon form av flingor. Det hindrar dock inte att det packas med FlashPack och ger mycket anständig separationseffektivitet (opublicerade data). Således, även om det inte var optimalt för vissa fall, var metanol det mest universella lösningsmedlet att fungera för alla testade sorbenter och kolonner. Det är nödvändigt att nämna att vi ännu inte analyserade hur olika slamlösningsmedel påverkar kolonnseparationseffektiviteten. Samtidigt är effektiviteten hos kolumner packade från metanol redan helt lika med kommersiella kolumner för samma sorbenter4.
FlashPack är inte den enda befintliga metoden för att förbättra förpackningshastigheten för UHPLC-kolumner. Snabb packning från hög sorbentslamkoncentration är också möjlig med användning av ultrahögtrycksförpackning7. Fördelen med FlashPack är att det är mycket enklare eftersom det inte kräver speciella ultrahögtryckspumpar och tryckbomber för sorbentleverans och kapilläranslutningar. Samtidigt visade det sig att kolonnerna som är packade vid extrema tryck kan ha separationseffektivitet högre än lägre tryckpackade kolumner17. Och medan FlashPack producerar kolumner som är identiska med kommersiella som används ijämförelsen 4, för vilka vi inte känner till förpackningsmetoden, testades det ännu inte hur FlashPack-kolumner står mot ultrahögtryckspackade kolumner.
Sammanfattningsvis kan den beskrivna FlashPack-metoden enkelt anpassas till det befintliga förpackningsprotokollet i laboratoriet med vissa justeringar gjorda i protokollet, medan installationen förblir helt densamma. Det påskyndar HPLC-kapillärkolonnen packning till minuter och möjliggör produktion av långa UHP-kapillärkolonner, vilket helt enkelt är omöjligt med standardförpackningsproceduren. Den totala ekonomin i tid och pengar för laboratoriet genom tillämpning av FlashPack-metoden kan räknas i tiotusentals euro per år. Dessutom öppnar möjligheten att producera UHP-kapillärkolumner lokalt möjligheterna till experimentanpassning som är omöjliga med tillgängliga kommersiella produkter.

Modern proteomik är baserad på vätskekromatografikopplad masspektrometri med den ultrahögprestanda nanoflödeskromatografi (50-150 μm kolumn interndiameter (ID)) separation som ger bästa analyshastighet och känslighet1. Medan många kommersiella UHPLC-kapillärkolumner finns tillgängliga, utgör deras pris en stor del av förbrukningskostnaden, särskilt när flera olika projekt drivs i laboratoriet och projektspecifik kolumnförorening är en vanlig fråga. Dessutom tillåter förpackning av kolumner internt användning av anpassade experimentspecifika sorbenter (t.ex. polyCAT-A sorbent2) och kolumnegenskaper som inte är tillgängliga för köp som en färdig kolumn.
För att klara av det packar många laboratorier kapillärkolonner internt. Det gemensamma förpackningsförfarandet med en 100 bar tryckbomb (tryckinsprutningscell)3 är dock dåligt lämpat för UHPLC-kolonnförpackningen på grund av högt baktryck av sub-2 μm UHPLC-sorbenter vilket resulterar i en dramatisk förpackningshastighetsminskning jämfört med större HPLC-sorbenter. Medan korta UHPLC-kolumner fortfarande kan vara mycket långsamt packade, är tillverkning av långa UHPLC-kolumner fysiskt omöjligt4.
Standard kapillär kolonn packning görs vid relativt låga tryck-upp till 100 barer, och med en mycket låg sorbent slurry koncentration. Därför finns det två möjliga riktningar för att påskynda processen. Det är möjligt att öka förpackningstrycket5. Detta kräver dock speciell utrustning och praktiskt taget installation av en ny metod i laboratoriet. Ett annat sätt är att öka sorbentslamkoncentrationen6. Hög sorbentslamhaltsförpackning beskrivs i kombination med ultrahögt förpackningstryck i en tidigare publikation7. Men vid 100 bar tryck, som används i de flesta av de befintliga förpackningsbomberna, resulterar högre sorbentkoncentration i antingen förpackningshastighet sakta ner eller direkt förpacknings upphörande. Effekten visade sig nyligen bero på sorbentkluster vid kolonningången, och ett enkelt trick av sorbent cupola destabilisering genom att hamra kolonningången med en magnetstång inuti en sorbentflaska föreslogs4. Den resulterande metoden, som heter FlashPack, använder samma 100-bar tryckbomb packning. Samtidigt tillåter mindre men kritiska förändringar i förpackningsförfarandet förpackning från mycket hög sorbent slamkoncentration och produktion av mycket långa UHPLC-kolonner (50 till 70 cm och längre) på mindre än en timme, medan en kort kolumn kan produceras på några minuter med separationskvaliteten lika med kommersiella kolumner med samma parametrar4. FlashPack-metoden användes redan framgångsrikt i flera proteomikprojekt för beredning av både omvänd fas (RP)8,9,10,11,12,13,14 och hydrofil interaktion (HILIC)2 kapillärkolumner.
Här beskriver vi i detalj de ändringar som behövs för anpassning av FlashPack-metoden till standard 100-bar tryckbombpackning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.59002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Scoring Wafer</td>
			<td>Restek</td>
			<td>20116</td>
			<td>any ceramic wafer is suitable for capillary polishing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-chip bladed scribe</td>
			<td>NewObjective</td>
			<td>Diamond-chip bladed scribe</td>
			<td>recommended for capillary cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fused silica capillary 100 mm ID 375 mm OD</td>
			<td>CM Scientific</td>
			<td>TSP100375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GELoader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30001222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Ultimate3000 RSLCnano</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P2000/F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnet bar 2x5 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z283819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microspatula</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z193216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK ferrule 360 mm</td>
			<td>VICI</td>
			<td>JR-C360NFPK</td>
			<td>use to connect the column to UPLC union</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tip, 1000 uL</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z740095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 1000 uL</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Pipetman L P1000L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure bomb</td>
			<td>NextAdvance</td>
			<td>PC-77 MAG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>regulator</td>
			<td>GCE</td>
			<td>Jetcontrol 600 200/103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 mm</td>
			<td>Dr. Maisch</td>
			<td>r13.aq.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 0.5 mL</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AXYST050SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 1.5 mL</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AXYST150SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw caps with O-rings</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AXYSCOC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonication bath</td>
			<td>Elma</td>
			<td>Elmasonic S30 H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>union HPLC</td>
			<td>VICI</td>
			<td>JR-C360RU1PK6</td>
			<td>HPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>union UPLC</td>
			<td>VICI</td>
			<td>JR-C360RU1FS6</td>
			<td>UPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vortex</td>
			<td>BioSan</td>
			<td>V-1plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% (v/v) Formic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.59013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple in-house ultra-high performance capillary column manufacturing with the flashpack approach

Kapillär ultrahög prestanda flytande kromatografi (UHPLC) är för närvarande en metod att välja för provseparationssteget i LC-MS-baserad proteomik. Kapillärkolumner är dock mycket mindre robusta i jämförelse med deras högre flödesräknare. På grund av enkel förorening och blockering behöver de ofta bytas ut. Det gör dem till en markant dyr del av den totala LC-MS-analyskostnaden. Intern packning av UHPLC kapillärkolumner sparar mycket pengar och möjliggör anpassning. Standardförpackningen i tryckbomben på 100 bar fungerar dock bra endast för HPLC-kolonner men är för långsam för UHPLC-sorbenter. Här ger vi en beskrivning av ett optimerat FlashPack-protokoll som tillämpas på samma 100-bar tryckbombsinställning. Metoden är baserad på förpackning från ultrahög sorbentkoncentrationsslam och är utvecklad för egen tillverkning av UHPLC kapillärkolonner med obegränsad längd inom rimlig tid.

FlashPack-metoden är baserad på standardförpackningsinställningen och följer samma förpackningspipeline. Förpackning görs i vanliga fritted eller pulled emitter kapillärer. Den huvudsakliga optimeringen ligger i sorbentslamkoncentrationen: standardmetoden är inkompatibel med en högkoncentrerad sorbentfjädring som används i FlashPack. Resultatet är en snabb produktionsmetod för långa UHPLC-kolonner, till exempel en kolumn packad för 50 cm längd med 1,9 μm sorbent på mindre än 1 h (figur 2).
För att demonstrera tillämpningen av FlashPack-metoden utarbetades en kapillärkolonn på 30 cm 100 μm(tabell 6). Förpackning av ReprosilPur C18 1,9 μm sorbent gjordes vid 60 bar i en 50 cm lång 100 μm ID pulled emitter kapillär, beredd av en P2000 laserdragare. Kapillären var packad till ~40 cm på 40 minuter med lite mer lös sorbent kvar inuti kapillären. Den packade kapillären var ansluten till ett HPLC-system och kördes vid 300 nL/min med lösningsmedel B (80% acetonitril, 0,1% FA). Efter två rundor av 5 s ultraljudsbehandling var den slutliga packade längden 43 cm. Kolonnen kopplades bort, klipptes till 30 cm och anslöts till HPLC-systemet med hjälp av en UHPLC-anslutning. Vi använder rutinmässigt 360 μm ärmlös PEEK mutter-ferrule och 360 μm rostfritt stål union. Denna kombination rymmer minst upp till 700 bar om den dras åt kraftigt. Den tillverkade kolonnen har ett mottryck på 520 bar vid 2 % lösningsmedel B vid 500 nL/min, vilket överensstämmer med det förväntade värdeintervallet(tabell 5).
Som en demonstration av kolonnen effektivitet, vi använde den tillverkade 30 cm kolonnen för att separera 50 fmol av en tryptic sammandrag av cytokrom C protein i en 15 min gradient från 2% till 50% B. Extraherade jon kromatogram visade topparna vara mycket symmetriska med minsta tailing. Genomsnittlig FWHM var cirka 3 s (figur 3).
Tabell 1: Felsökning för hög fungerande mottryck i kolumnen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table1_HighColPressurev2.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>
Tabell 2: P2000/F laserdragarprogram. P2000/F laserdragarprogram för beredning av pulled emitter kapillärer från 360 μm OD 100 μm ID smält-kiseldioxid polyimidbelagd kapillärer utan intern beläggning vid rumstemperatur 23-25 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table2_P2000F%20laser%20puller%20program.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner denna tabell.</a>
Tabell 3: FlashPack-specifika förpackningsproblem och kontrollpunkter att kontrollera under förpackningsprocessen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table3_sorbentDeliveryIssuesss.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>
Tabell 4: Föredömliga förpacknings- och arbetsflöden för olika kolumn-ID och längd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table4%20Exemplary%20packing%20and%20working%20flow%20rates.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>
Tabell 5: Förväntat baktryck för en kolumn packad med 2 μm sfäriska sorbenter och kör med arbetsflödeshastighet (enligt kolumn-ID) i RP lösningsmedelssystem på RT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table5_Expected%20backpressure.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner denna tabell.</a>
Tabell 6: Exemplarisk förpackning av 30 cm UHPLC-kolonn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table6_Exemplary%20packing%20of%2030%20cm%20UHPLC%20columnv2.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig01.jpg"> Bild 1: Förpackningssystem för kapillärkolonn. Steg 1 till 3 är förberedande, följt av tryckbombspackning och avslutas med HPLC-packning. Steg 3 och 4 ändras för det ultraeffektiva FlashPack-protokollet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig02.jpg"> Bild 2: Förpackningshastighet för en fritted kapillär 100 μm ID med ReprosilPur C18 AQ 1,9 μm vid 100 barer i metanol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig03.jpg"> Figur 3: Extraherade jonkromatogram av tryptiska peptider av cytokrom C. Extraherade jonkromatogram av tryptiska peptider av cytokrom C efter separation av 50 fmol i 30 cm långa 100 mm ID pulled emitter kapillär kolonn packad med ReprosilPur C18 AQ 1,9 μm i en gradient av buffert B (80% acetonitril, 0,1% FA) och i buffert A (2% acetonitril, 0,1% FA) från 2% till 40% B i 15 min vid 500 nL/min vid RT. Detektion utfördes med hjälp av en masspektrometer. Absoluta intensiteter och extraherade m/z intervall för varje peptid visas till höger om spektrat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach at JoVE.com

Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach

Här presenterar vi ett protokoll för den optimerade FlashPack kapillärkolonnförpackningsproceduren. Tillämpning av ett optimerat protokoll på en gemensam 100-bar tryckbombsinställning möjliggör 10 gånger snabbare packning och tillverkning av långa kapillärkolonner med ultrahög prestanda.

Enkel egen kapillärkolonntillverkning med FlashPack-metoden

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. ...

Enkel egen kapillärkolonntillverkning med ultrahög prestanda med FlashPack-metoden. Målet med denna procedur är att införa ett optimerat protokoll för snabb och enkel ultra högpresterande kapillär kolonnpackning för LC-MS proteomik analys. Modern proteomik är baserad på masspektrometri i kombination med högpresterande kapillär flytande kromatografi.Peptidseparation görs mestadels i kapillärkolonner med en inre diameter på 75 mikrometer. I nivå med kommersiella produkter är det möjligt att förbereda kapillärkolonner internt. Specialtillverkade kolumner visar separationskvaliteter som liknar kommersiella analogier, samtidigt som de sparar mycket pengar och tillåter anpassning av sorbent- och kolumnstorlek.Här demonstrerar vi en optimerad förpackningsprocedur för egen kapillärkolonntillverkning, som vi kallar FlashPack. Tanken bakom optimeringen är att packa från mycket hög sorbent slamkoncentration, samtidigt som man använder samma vanliga 100 bar tryckbombpackning. Detta kräver kontinuerlig nedbrytning av sorbentkluster, som bildas runt kolonningången vid hög sorbentkoncentration och förhindrar att nytt sorbentmaterial kommer in i kapillären.Tekniskt sett uppnår vi det genom att använda en magnetstång som hammare, ständigt värma och röra oss runt kapillären inuti sorbenttråden. Korrekt applicerad FlashPack ökar förpackningshastigheten upp till 10 gånger. Det gör den lämplig för att packa upp ultrahögprestanda sorbenter av mjukare mikromåttstorlek och för tillverkning av mycket långa kolonner upp till en meterlängd under rimliga tider.Kolumnförberedelseproceduren består av fem steg. Tre förberedande steg, som inkluderar packning station montering och kapillär och sorbent slurry förberedelse. Sedan packas kapillären först i tryckbomben vid 60 till 100 bar tryck.Det följs av anslutning av den packade kapillären till HPLC-systemet, packning upp sorbent vid högt tryck och kolonnskärning till storleken. FlashPack-proceduren kräver att ändringar görs i steg tre och fyra i det gemensamma protokollet. Först och främst förbereder vi en packstation.Den består av en kvävegastank med minst 50 bar utloppstryck. Tanken är ansluten till tryckbombens ventilationsventil, som placeras i magnetomröraren. Utloppet på ventilationsventilen sätts in i en vattenflaska genom smal ID PEEK-kapillär, vilket möjliggör fin kontroll vid trycksänkning.Därefter förbereder vi en kapillär. Förpackning kan göras antingen i en fritted kapillär med en integrerad glasfrit bildad av Kasil och formamid. Ett annat alternativ är att packa i en pulled kapillär förberedd av sutter laser puller.Kapillären måste göras 10 till 15 centimeter längre än den avsedda kolonnlängden. Följande video är förberedd på exemplet med en pulled emitter kapillärförpackning. Skydda en utdragen emitterände med en skuren gellastande pipettspets.Mer information finns i textversionen av manuskriptet. Nästa steg är sorbent slurry förberedelse. Lägg först cirka 50 milligram torr sorbent i 1,5 milliliter centrifugrör.Det blir en stocksorbentflaska. Denna video utarbetades med hjälp av Reprosil Pur C18 AQ 1.9 mikrometrisk sorbent från Dr.Maisch. Tillsätt en milliliter metanol i stocksorbentflaskan.Virvel i 10 sekunder. Och sonikerar i ett ultraljudsbad i ytterligare 10 sekunder. Låt sorbenten suga noggrant i 20 till 30 minuter, virvel och sonikera den en gång till.Förbered en fungerande sorbentflaska. Det måste vara en konisk bottenflaska som passar in i bomben. Det kan vara antingen ytterligare 1,5 milliliter centrifugrör eller någon annan flaska beroende på den specifika tryckbombsdesignen.Vi använder en kjol konisk botten skruv lock rör skuren till höjden av tryckbomben. Suspendera sorbenten i stocksorbentflaskan och överför 500 mikroliter till den arbetande sorbentflaskan tillsammans med en magnetstång som är två och tre millimeter stor. Toppa till arbetsflaskan till en milliliter med metanol.Låt arbetsflaskan stå på bordet i 10 minuter för att sorbenten ska sätta sig genom gravitationen. Resultatet av detta steg måste vara en konisk bottenflaska med bottenskiktet av lös sorbent cirka fyra millimeter hög. Om skiktet är för lågt, och lite mer sorbent från stockflaskan.Således är förberedd arbetsflaska avsedd för flera kolumners förberedelse över månader. Om den arbetande sorbentflaskan stannar utan omrörning i mer än två timmar måste den virveleras, sonicated och sedimenteras genom gravitation igen innan den packas. När allt är förberett, fortsätt till steg fyra, packa in tryckbomben.Använd alltid skyddsglasögon när du arbetar med smälta kapillärer med kiseldioxid och tryckbomben. Samtidigt rekommenderas inte skyddshandskar. De minskar allvarligt känslan av beröring som krävs för korrekt hantering av kapillärer med liten diameter och leder till misstag.Placera sorbentflaskan i tryckbomben och fixera alla knutar tätt. Starta rotationen vid 60 till 100 skott per minut, Sätt in den fritted eller pulled emitter kapillären i bomben. Tryck den till botten av injektionsflaskan, lyft den sedan upp två till tre millimeter och fixa knuten.Applicera minsta erforderliga kraft för att fixa kapillären. Kontrollera att kapillären är korrekt fastsatt. Det måste vara omöjligt att flytta kapillären genom att dra ut den för hand.Mycket långsamt, öppna tryckbombventilen samtidigt som kapillärens öppna ände hålls riktad bort från ansiktet. Titta på de första stegen i förpackningsprocessen. Omedelbart efter trycksättning fyller sorbenten kapillären och den blir icke-transparent för hela längden.Så snart sorbenten börjar packa inuti den distala änden ökar baktrycket, flödet saktar ner och den jämna sorbentslammet inuti kapillärreformerna i flera sorbentpaket, åtskilda av sorbentfria luckor. Redan packad sorbent är synlig som en tätt färgad kontinuerligt växande region. Håll de sorbentfyllda regionerna minst 70% av kapillärlängden med små sorbentfria luckor under hela förpackningsprocessen.Det finns flera vanliga problem att titta på under förpackningsprocessen. De kräver justering av inställningen på flyget för att hålla effektiv sorbentleverans till kapillären. Det vanligaste problemet är när ny sorbent slutar komma in i kapillären medan sorbenten redan inuti fortsätter att röra sig.I de flesta fall blockeras kapilläringen av självaggregering av sorbentkluster. Använd dessa steg en efter en tills sorbentflödet återställs och hoppa sedan över resten av de problemrelaterade stegen. Öka rotationshastigheten till 500 rundor per minut och minska den omedelbart till 60 RPM.För det mesta återställer det sorbentflödet. Kontrollera att rotationshastigheten är minst 60 varv/min under resten av förpackningsprocessen. Om det inte hjälper, ventilera kort förpackningsbomben och tryck omedelbart tillbaka den.Om det inte hjälper, eller blockeringen händer igen, flytta kapillären inuti sorbentskiktet. Frånvaron av sorbenten kan bero på att kapillärens öppna ände antingen är för hög ovanför magnetstången, så kolonnänden rör den inte. Eller kapillären är placerad för lågt och fastnar i injektionsflaskan botten.Ventilera först bomben helt, lossa sedan muttern, tryck kapillären till botten och dra den sedan två millimeter tillbaka. Fixa muttern. Öppna ventilen för att trycksätta bomben och fortsätt packa.Mer information om förpackningsproblemen beskrivs i textversionen av metoden. Fortsätt att packa kolonnen tills målkolonnens längd plus fem till sju centimeter uppnås. Stoppa rotationen och tryck mycket långsamt ner bomben.Öppna bombventilen lite och vänta tills bubblan spricker inuti vattenflaskan för att avta. Öppna sedan ventilen lite bredare och vänta igen på att bubblan spricker för att sakta ner. Släpp således ut trycket i stegvisa steg tills ingen gas kommer ut ur ventilen.Öppna inte ventilen hela vägen på en gång. Det kommer att leda till bubblande inuti kapillären och sorbenten som går tillbaka in i injektionsflaskan. Om det händer, tryck tillbaka bomben och vänta på att kolonnen ska packas igen.När gasen slutar komma ut ur ventilationsventilen, ta ut den packade kapillären ur tryckbomben. Låt inte kolonnen torka ut. Om det inte ansluts till HPLC-systemet omedelbart för vidare förpackning, lägg det förpackade kapillären i förvaring genom att sänka det helt i 10% etanollösning.Frånkopplade HPLC-kolumner lagras på samma sätt. Om ingen mer packning är planerad för idag, ta ut sorbentflaskan från bomben och stäng den tätt. Håll den för vidare kolonnförpackningen.Steg fem, HPLC packar ihop. Anslut den packade kapillären till HPLC-systemet via HPLC-anslutning. Starta flödet av högt organiskt lösningsmedel.Justera flödet enligt den packade längden som riktar sig till cirka 300 staplar. För 40 centimeter packad kapillär använd flödeshastigheten på 200-300 normala liter per minut. Se upp för lös sorbent inuti kapillären som packas, vilket ökar den totala packade längden.Utan att stoppa flödet, doppa kolonnkroppen två gånger i ultraljudsbehandlingsbadet. Det är viktigt att bara fördjupa en del av kolonnkroppen. Sänk inte ned kolonnändarna och kapilläranslutningarna.När sorbentbädden slutar krympa, doppa kolonnkroppen i ultraljudsbehandlingsbadet två gånger mer utan att stoppa flödet. Kör kolumnen i ytterligare 10 minuter med 300 staplar. Stoppa flödet, vänta tills trycket sjunker till under tre staplar och koppla bort kolonnen.Inspektera kolumnen visuellt för bristen på luckor och missfärgningar. Om någon hittas kan ultraljudsbehandling under flödet upprepas. För kritiska experiment bör du överväga att skapa en ny kolumn.Klipp kolonnen till önskad längd. Korrekt utförd skärning är en förutsättning för kolonneffektivitet. Gör ett hack i polyamidbeläggning med skribenten.Spricka delvis kapillären och dra isär två stycken. Polera kolonnens framände på en keramisk skiva eller med lappfilm. Anslut kolonnen till LC-systemet med hjälp av ultrahögtrycksanslutning.Starta arbetsflödet vid 2 %B. Arbetsflödeshastigheten justeras enligt kolumnparametrarna. Till exempel körs 100 mikrometer-ID-kolumner med 500 nanoliter per minut.Vänta tills trycket ska balanseras och kontrollera kolonnens mottryck. En korrekt förberedd kolumn ger baktryck proportionellt mot dess längd och sorbentegenskaper. Till exempel har 30 centimeter kapillärkolonn packad med två mikrometer sorbent mottryck på 450 till 500 bar vid 2%lösningsmedel B.Om den producerade kolonnen ger ett baktryck inom det förväntade intervallet är den klar att användas.Om baktrycket ligger långt utanför det förväntade intervallet är något fel antingen med kolumnen eller med LC-systemet. Packning med FlashPack producerar en kapillär förpackad i 50 centimeter med 1,9 mikrometer sorbent på mindre än en timme vid 100 bar förpackningstryck. Som ett exempel producerar vi 30 centimeter 100 mikrometer ID ultra högtryckskolonn packad i en pulled emitter kapillär med 1,9 mikrometer ReprosilPur C18 AQ sorbent.Packning gjordes på 60 barer i 50 centimeter lång pulled emitter kapillär. Kapillären var packad till 40 centimeter på 40 minuter med lite mer sorbent inuti kapillären inte packad. Den packade kapillären var ansluten till HPLC-systemet och kördes med 300 nanoliter per minut med lösningsmedel B, som i vårt fall var 80% acetonitril, 0,1% myrsyra.Den slutliga packade längden var 43 centimeter. Kolonnen skars 30 centimeter. Vid 500 nanoliter per minut arbetsflöde med 99% lösningsmedel B gav kolonnen mottrycket på 275 bar, vilket ligger nära det förväntade värdet.För att testa kolonnen separerade vi 50 fmol av en tryptic smälta cytokrom C protein i en 15 minuters gradient från 2-50%B. Kromatografiska toppar var mycket symmetriska med minsta tailing. Genomsnittlig FWHM var cirka tre sekunder.Det beskrivna protokollet kan producera UHPLC-kolumner i en gemensam 100 bar förpackning som ställts in inom rimlig tid. Korta HPLC- eller UPLC-kolumner kan packas på några minuter, medan långa 30-50 centimeter kolonner packas på mindre än en timme. Metoden är effektiv för att packa upp sorbenter med RP och all annan kemi i alla kolumn-ID: er.Producerade kolumner är reproducerbart lika effektiva som alla andra kommersiella kolonner av liknande storlek och sorbentparametrar.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Undersöka Proteasome Montering med rekombinant archaeal proteasomerna och Nondenaturing SIDA: Fallet för ett kombinerat tillvägagångssätt

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Kapillärelektrofores Separation av monoklonal antikropp isoformer med hjälp av en neutral kapillär

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Förbättrad Prov Multiplexing av vävnader med användning Kombinerade Prekursor isotopmärkning och Isobaric Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metod för hög genomströmning kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Analys av AtHIRD11 inneboende sjukdom och bindande mot metalljoner genom kapillär gelelektrofores och affinitet kapillärelektrofores

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

En anpassningsbar metod för enzymatisk produktion och rening av Diterpenoid naturliga produkter

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Ultrahög hastighet Western Blot med hjälp av immunoreaction förbättra teknik

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Ett ekonomiskt och mångsidigt proteinreningssystem med hög genomströmning med en plattadapter med flera kolumner

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Identifiera de bindande proteinerna i små ligands med ligands differentialradiella kapillärverkan (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Absolut kvantifiering av Inositol pyrofosfater av kapillärelektrofores Elektrospray jonisering masspektrometri

Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) are an important group of intracellular signaling molecules. Derived from inositol phosphates (InsPs), these molecules ...