Name: analysis of lymph node volume by ultra-high-frequency ultrasound imaging in the braf/pten genetically engineered mouse model of melanoma
Uploaded: 2021-09-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lymph Node Volume by Ultra-High-Frequency Ultrasound Imaging in the Braf/Pten Genetically Engineered Mouse Model of Melanoma at JoVE.com

De auteurs willen S. Burchielli (FTGM, Pisa) bedanken voor haar hulp bij dierprocedures. Dit werk werd ondersteund door ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica institutionele financiering van LP; MFAG #17095 toegekend door AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro aan LP.

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid (dierprotocollen #754/2015-PR en #684/2018-PR).
1. Melanoom inductie
OPMERKING: Zes weken oude Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox muizen [B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)] werden gebruikt in deze studie (zie de Tabel met Materialen).
<ol><li>Behandel de muiz...

<ol>
	<li>Schvartsman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+metastatic+cutaneous+melanoma:+updates+in+clinical+practice.">Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice.</a> Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663 (2019).</li><li>Blum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+examination+of+regional+lymph+nodes+significantly+improves+early+detection+of+locoregional+metastases+during+the+follow-up+of+patients+with+cutaneous+melanoma+-+Results+of+a+prospective+study+of+1288+patients.">Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma - Results of a prospective study of 1288 patients.</a> Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).</li><li>Olmedo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+lymph+node+ultrasound+prior+to+sentinel+lymph+node+biopsy+in+384+patients+with+melanoma:+a+cost-effectiveness+analysis.">Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis.</a> Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).</li><li>Voit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+morphology+criteria+predict+metastatic+disease+of+the+sentinel+nodes+in+patients+with+melanoma.">Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).</li><li>Hayes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+cohort+study+of+ultrasound+surveillance+of+regional+lymph+nodes+in+patients+with+intermediate-risk+cutaneous+melanoma.">Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma.</a> British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).</li><li>Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ultrasound+surveillance+of+lymph+nodes+following+lymphoscintigraphy+without+sentinel+node+biopsy:+a+useful+and+safe+strategy+in+elderly+or+frail+melanoma+patients.">Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients.</a> Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).</li><li>Jayapal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+between+benign+and+metastatic+cervical+lymph+nodes+using+ultrasound.">Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, 338-346 (2019).</li><li>Dankort, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Braf(V600E)+cooperates+with+Pten+loss+to+induce+metastatic+melanoma.">Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma.</a> Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).</li><li>Damsky, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-catenin+signaling+controls+metastasis+in+Braf-activated+Pten-deficient+melanomas.">&#946;-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas.</a> Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).</li><li>Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg7+overcomes+senescence+and+promotes+growth+of+BrafV600E-driven+melanoma.">Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma.</a> Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).</li><li>Kohler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cutaneous+melanoma+induced+by+mutant+BRaf+arises+from+expansion+and+dedifferentiation+of+mature+pigmented+melanocytes.">Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).</li><li>Yuan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenformin+enhances+the+therapeutic+benefit+of+BRAF(V600E)+inhibition+in+melanoma.">Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).</li><li>Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+AKT+dependency+displayed+by+mouse+models+of+BRAFV600E-initiated+melanoma.">Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).</li><li>Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+BRAFV600E+in+an+inducible+murine+model+of+melanoma.">Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma.</a> American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).</li><li>Steinberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+inhibition+alleviates+immune+suppression+in+murine+autochthonous+melanoma.">BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma.</a> Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).</li><li>Vitiello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumoral+effects+of+attenuated+Listeria+monocytogenes+in+a+genetically+engineered+mouse+model+of+melanoma.">Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma.</a> Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).</li><li>Moon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocyte+stem+cell+activation+and+translocation+initiate+cutaneous+melanoma+in+response+to+UV+exposure.">Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).</li><li>Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+2-and+3-dimensional+assessment+of+tumor+volume+and+vascular+density+by+ultrasonography+in+a+transgenic+mouse+model+of+mammary+carcinoma.">Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma.</a> Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).</li></ol>

De gegevens verkregen in deze studie bevestigen het vermogen van echografie om de metastatische betrokkenheid van inguinale lymfeklieren van het Braf / Pten-muismodel van gemetastaseerd melanoom te controleren. Zoals eerder aangetoond16, is deze techniek vooral nuttig om de werkzaamheid van medicamenteuze behandeling te beoordelen. Dit komt omdat het de monitoring van de verandering in lymfekliervolume in hetzelfde dier in de loop van de tijd mogelijk maakt, door de metingen verzameld bij t1 ...

Melanoom is een agressieve vorm van huidkanker die zich vaak verspreidt naar andere huidplaatsen (subcutane metastasen), evenals naar lymfeklieren, longen, lever, hersenen en botten1. In het afgelopen decennium zijn nieuwe geneesmiddelen geïntroduceerd in de klinische praktijk en hebben ze bijgedragen aan het verbeteren van de levensverwachting van patiënten met gemetastaseerd melanoom. Er blijven echter beperkingen bestaan, waaronder variabele tijd tot en mate van respons, ernstige bijwerkingen en de toename van verworven resistentie1. Daarom is het cruciaal om gemetastaseerde verspreiding in een vroeg stadium te detecteren, d.w.z. wanneer het de lokale lymfeklieren bereikt.
Een biopsie van de lokale lymfeklieren (schildwachtklieren) wordt meestal uitgevoerd om te controleren op de aanwezigheid van melanoomcellen. Echografie grijpt echter aan als een niet-invasieve methode om metastatische betrokkenheid te detecteren, omdat het beter presteert dan klinische evaluatie en een onnodige biopsie kan helpen voorkomen2,3,4. Bovendien lijkt echografie geschikt voor lymfekliersurveillance, vooral in het geval van gevorderde leeftijd en/of comorbiditeiten5,6. De kenmerken die worden gedetecteerd door ultrasone analyse en die het onderscheid tussen normale en gemetastaseerde lymfeklieren mogelijk maken, omvatten verhoogde grootte (volume), verandering van vorm van ovaal naar rond, onregelmatige marge, veranderd echogeen patroon en veranderde (verhoogde) vascularisatie7.
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox genetisch gemanipuleerde muizen (Braf/Pten muizen) zijn onlangs beschikbaar gesteld aan de wetenschappelijke gemeenschap als een weefselspecifiek en induceerbaar model voor gemetastaseerd melanoom8. In dit diermodel ontwikkelen primaire tumoren zich zeer snel: ze worden zichtbaar binnen 2-3 weken na de inductie van de overgang van wild-type (wt) Braf naar BrafV600E en van het verlies van Pten, terwijl ze binnen 4 weken een volume van 50-100 mm3 bereiken. In de volgende 2 weken gaat de groei van de primaire tumor gepaard met een progressieve toename van de metastatische belasting op andere huidplaatsen, lymfeklieren en longen.
Braf/Pten-muizen zijn op grote schaal gebruikt voor meerdere doeleinden, waaronder de dissectie van signaalroutes die betrokken zijn bij melanoomgenese9,10, de identificatie van melanoomcellen van oorsprong11,12,13, en het testen van nieuwe therapeutische opties in termen van zowel gerichte therapie als immunotherapie8,14,15,16 . Specifiek gebruikten we Braf / Pten-muizen om aan te tonen dat verzwakte Listeria monocytogenes (Lmat) werkt als een anti-melanoomvaccin. Wanneer systemisch toegediend in de therapeutische setting, is Lmat niet geassocieerd met algehele toxiciteit omdat het zich selectief ophoopt op tumorplaatsen. Bovendien veroorzaakt het een opmerkelijke afname van de primaire melanoommassa en een vermindering van de metastatische belasting in de lymfeklieren en longen. Op moleculair niveau veroorzaakt Lmat apoptotische doding van melanoomcellen, wat ten minste gedeeltelijk te wijten is aan niet-celauto autonome activiteiten (rekrutering ter plaatse van CD4+ en CD8+ T-lymfocyten)16.
Wanneer Braf /Pten-muizen worden gebruikt voor melanoommodellering, kan de groei van primaire tumoren en subcutane metastasen worden gevolgd door remklauwmetingen. De betrokkenheid van lymfeklieren en longen moet echter worden onderzocht met behulp van een alternatieve techniek, mogelijk een niet-invasieve techniek waarmee onderzoekers hetzelfde dier in de loop van de tijd kunnen volgen. Dit artikel beschrijft het gebruik van echografie (figuur 1), gekoppeld aan een daaropvolgende 3D-volumetrische analyse van de verkregen gegevens, voor de longitudinale monitoring van de toename in grootte (volume) van inguinale lymfeklieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-hydroxytamoxifen</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H6278</td>
			<td>drug used for tumor induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>013590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blu gel</td>
			<td>Sooft Ialia</td>
			<td></td>
			<td>ophthalmic solution gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAFV600E antibody</td>
			<td>Spring Bioscience Corporation</td>
			<td>E19290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo (isoflorane)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>liquid for gaseous anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLANA antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M2-7C10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma gel</td>
			<td>Parker</td>
			<td></td>
			<td>electrode gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transonic gel clear</td>
			<td>Telic SAU</td>
			<td></td>
			<td>ultrasound gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veet</td>
			<td>Reckitt Benckiser IT</td>
			<td></td>
			<td>depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Dual Anesthesia System</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MX550S</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td>
			<td></td>
			<td>UHFUS linear probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 3100</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td>
			<td></td>
			<td>UHFUS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Imaging Station</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td>
			<td></td>
			<td>UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Lab</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td>
			<td></td>
			<td>software platform for ultrasound image post-processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of lymph node volume by ultra-high-frequency ultrasound imaging in the braf/pten genetically engineered mouse model of melanoma

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox genetisch gemanipuleerde muizen (Braf/Pten muizen) worden veel gebruikt als in vivo model van gemetastaseerd melanoom. Zodra een primaire tumor is geïnduceerd door tamoxifenbehandeling, wordt een toename van de metastatische belasting waargenomen binnen 4-6 weken na inductie. Dit artikel laat zien hoe Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) beeldvorming kan worden gebruikt om de toename van gemetastaseerde betrokkenheid van de inguinale lymfeklieren te volgen door de toename van hun volume te meten.
Het UHFUS-systeem wordt gebruikt om verdoofde muizen te scannen met een lineaire UHFUS-sonde (22-55 MHz, axiale resolutie 40 μm). B-modus beelden van de inguinale lymfeklieren (zowel links als rechts) worden verkregen in een korte-asweergave, waarbij de dieren in dorsale lighouding worden geplaatst. Echografierecords worden verkregen met behulp van een stapgrootte van 44 μm op een gemotoriseerde mechanische arm. Daarna worden tweedimensionale (2D) B-modus acquisities geïmporteerd in het softwareplatform voor ultrasone beeldnabewerking en worden inguinale lymfeklieren semi-automatisch geïdentificeerd en gesegmenteerd in de verkregen cross-sectionele 2D-beelden. Ten slotte wordt automatisch een totale reconstructie van het driedimensionale (3D) volume verkregen, samen met de weergave van het lymfekliervolume, dat ook wordt uitgedrukt als een absolute meting.
Deze niet-invasieve in vivo techniek wordt zeer goed verdragen en maakt het mogelijk om meerdere beeldvormingssessies op hetzelfde proefdier gedurende 2 weken te plannen. Het is daarom ideaal om de impact van farmacologische behandeling op gemetastaseerde ziekte te beoordelen.

Na het schilderen van de huid van Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox muizen met 4-HT, wordt Cre activiteit geïnduceerd, waardoor er een schakelaar is op het genomische niveau van wt Braf naar BrafV600E, terwijl Pten verloren gaat (Figuur 3A). In 2-3 weken ontwikkelen muizen ter plaatse primaire tumoren met 100% penetrantie. Na vier weken na 4-HT-behandeling (t0) bereiken primaire tumoren een volume van 50-100 mm3 en kan hun groei n...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lymph Node Volume by Ultra-High-Frequency Ultrasound Imaging in the Braf/Pten Genetically Engineered Mouse Model of Melanoma at JoVE.com

Analysis of Lymph Node Volume by Ultra-High-Frequency Ultrasound Imaging in the Braf/Pten Genetically Engineered Mouse Model of Melanoma

Melanoom is een zeer agressieve ziekte die zich snel verspreidt naar andere organen. Dit protocol beschrijft de toepassing van ultra-hoogfrequente echografie, gekoppeld aan 3D-rendering, om het volume van de inguinale lymfeklieren in het Braf / Pten-muismodel van gemetastaseerd melanoom te bewaken.

Analyse van het lymfekliervolume door ultra-hoogfrequente echografie in het Braf / Pten genetisch gemanipuleerde muismodel van melanoom

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;genetically engineered mice (Braf/Pten mice) are widely used as an in vivo model of metastatic melanoma. Once a ...

Onze methode maakt het mogelijk om de toename van gemetastaseerde betrokkenheid van inguinale lymfeklieren te monitoren door de toename van hun volume te meten. Deze niet-invasieve methode wordt zeer goed verdragen, daarom kunnen meerdere beeldvormingssessies in de loop van twee weken op hetzelfde proefdier worden gepland. Deze methode is ideaal voor het beoordelen van de impact van farmacologische behandeling op gemetastaseerde ziekte.We hebben deze methode toegepast op het Braf/Pten melanoommodel, maar in principe kan het worden aangepast om de werkzaamheid van verschillende geneesmiddelen te beoordelen in verschillende preklinische muismodellen van gemetastaseerde kanker. De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Marianna Vitiello, een postdoc uit mijn laboratorium, en Dr. Claudia Kusmic, collega-onderzoeker bij IFC-CNR. Breng voor melanoominductie drie microliter vijf millimolair 4-hydroxytamoxifen aan op ongeveer één vierkante centimeter geschoren huid van de bovenrug gedurende drie dagen op rij.Gebruik zes weken na het schilderen van de huid remklauwen om het volume van de primaire tumor en uiteindelijk van subcutane metastasen te meten. Gebruik vervolgens echografie om het volume van de inguinale lymfeklieren te meten. Na het analyseren van de primaire tumor en lymfeklieren door visuele inspectie, snijdt u ze weg voor histologische studies.Na bevestiging van de anesthesie, breng het dier over naar een verwarmde plank van het ultra-hoogfrequente echografiestation en houdt het dier in rugligging. Pas de boardtemperatuur aan met behulp van een rectale sonde gesmeerd met vaseline om de lichaamstemperatuur van de muis in het fysiologische bereik te houden. Bekleed de voor- en achterpoten met geleidende pasta en plak ze op de ECG-plaatelektroden die in het bord zijn ingebed.Controleer of de fysiologische parameters correct zijn verkregen en weergegeven. Verwijder het haar van beide inguinale gebieden door een ontharingsmiddel aan te brengen en bedek ze met een akoestisch koppelingsmedium. Klem vervolgens de ultra-hoogfrequente ultrasone lineaire sonde in een gespecialiseerde 3D-motor die is ingebed in het beeldvormingsstation, waardoor geautomatiseerde en stapsgewijze beweging van de sonde mogelijk is.Oriënteer en pas de positie van de ultrasone sonde goed aan om kort toegankelijke beelden van de inguinale lymfeklier te verkrijgen en plaats het interessegebied de focuszone. Stel de scanafstand in tussen twee en vijf millimeter, stapgrootte op 44 micrometer met een resultaat van 46 tot 114 scanstappen per lymfeklierschijf en een acquisitietijd van één tot drie minuten per dier. Scan het volledige volume van de inguinale lymfeklier als een reeks 2D B-modusbeelden en verkrijg beelden op meerdere niveaus door lineaire beweging van de transducer met stapgroottes op micrometerschaal om 3D-gegevens te genereren in termen van ademhaling en cardiale cinelussen.Sla na beeldvorming de verkregen beelden digitaal op in raw-formaat voor verdere offline analyses. Voor nabewerking van echografiebeelden opent u de dataset van de 3D-inguinale lymfeklierafbeeldingen, selecteert u de multi-slice-methode en drukt u op de startknop om zowel de huidige frames als de miniaturen van alle frames te visualiseren die overeenkomen met elk beeld dat tijdens de 3D-acquisitie is vastgelegd. Selecteer de miniatuur van het eerste frame waar de lymfeklier zichtbaar is om deze in de contourweergave te laden.Klik in de contourweergave met de linkermuisknop om punten langs de rand van de lymfeklier te laten vallen. Zodra het gewenste aantal punten is ingesteld, lik je naar rechts om de contour te voltooien. Nadat de eerste contour is voltooid, gebruikt u de miniatuurweergave om de volgende afbeelding voor contouren te selecteren.Sla indien nodig meerdere afbeeldingen over tussen contouren om het aantal handmatige sporen dat nodig is voor elk 3D-volume te verminderen. Herhaal dit proces totdat het volledige volume is geschetst en klik vervolgens op Voltooien. Klik in de werkruimte van het 3D-modusvenster op het pictogram voor volumemeting onder het afbeeldingsweergavegebied om de numerieke waarde van het lymfekliervolume te visualiseren en activeer de oppervlakteweergave met de 3D-weergave van het lymfekliervolume.Het behandelen van muizen met 4-hydroxytamoxifen induceert CreER-enzymactiviteit, waardoor op genomisch niveau een omschakeling plaatsvindt van wild-type Braf naar gemuteerde Braf V600E, terwijl Pten verloren gaat. Vier weken na 4-hydroxytamoxifenbehandeling bereiken primaire tumoren een volume van 50 tot 100 kubieke millimeter en hun groei kan nog eens twee weken door remklauwen worden gemeten, waardoor een geleidelijke toename van pigmentatie wordt waargenomen in de inguinale lymfeklieren. De melanineafzettingen zijn steevast te wijten aan de aanwezigheid van uitgezaaide melanoomcellen, zoals bevestigd door immunohistochemische kleuring van het melanoomantigeen MelanA en Braf V600E.Aan het einde van de segmentatiefase vertoonden alle secties de overlay van de externe contour van de lymfeklier. De 3D-weergaven van een rechter inguinale lymfeklier, geanalyseerd op vier, vijf en zes weken na 4-HT-behandeling, worden hier getoond. De toename in volume van de linker en rechter inguinale lymfeklieren van hetzelfde dier in de loop van de tijd werd ook gekwantificeerd.Het wordt aanbevolen om echografie te koppelen aan geschikte immunohistochemische kleuring, zodat de aanwezigheid van kankercellen op moleculair niveau wordt bevestigd. Naast lymfeklieren kan ook het volume van subcutane metastase in de loop van de tijd worden gecontroleerd met behulp van echografie. Als het tijdsbestek van twee weken te kort is om de effecten van het onderzochte geneesmiddel te waarderen, selecteert u een meer perifere inductieplaats of een minder tumorgevoelig genotype.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Een genetisch ontwikkeld muis model van sporadische colorectale kanker

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Utilizing High Resolution Ultrasound to Monitor Tumor Onset and Growth in Genetically Engineered Pancreatic Cancer Models

Met behulp van hoge resolutie echografie naar Monitor Tumor ontstaan en groei in genetisch gemanipuleerde alvleesklierkanker modellen

The LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx-1-Cre (KPC) mouse model represents an established and frequently used transgenic model to evaluate novel ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

In vitro oprichting van een genetisch gemanipuleerde Muriene hoofd en nekkanker cellijn met behulp van een adeno-geassocieerde virus-Cas9 systeem

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Echografie-geleide Orthotopic implantatie van Murine pancreatic Ductal adenocarcinoom

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Quantification of Tumor Cell Adhesion in Lymph Node Cryosections

Kwantificering van tumorcelhechting in cryosecties lymfeklieren

Tumor-draining lymph nodes (LNs) are not merely filters of tumor-produced waste. They are one of the most common regional sites of provisional residence ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Detectie van longtumorprogressie bij muizen door echografie

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

Sentinel Lymph Node Mapping and Biopsy for Endometrial Cancer at Early Stage with Laparoscopy

Sentinel Lymph Node Mapping en Biopsie voor endometriumkanker in een vroeg stadium met laparoscopie

Sentinel lymph node (SLN) mapping and biopsy is a promising technique for visualizing and evaluating lymph node status in cancer. This approach has been ...

A Robust Discovery Platform for the Identification of Novel Mediators of Melanoma Metastasis

Een robuust ontdekkingsplatform voor de identificatie van nieuwe mediatoren van melanoommetastase

Metastasis is a complex process, requiring cells to overcome barriers that are only incompletely modeled by in vitro assays. A systematic workflow was ...

Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

Moleculaire en immunologische technieken in een genetisch gemanipuleerd muismodel van gastro-intestinale stromale tumor

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...

Non-Invasive PET/MR Imaging in an Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma

Niet-invasieve PET/MR-beeldvorming in een orthotopisch muismodel van hepatocellulair carcinoom

Preclinical experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate human disease represent an important tool to study tumorigenesis and ...