Name: analysis of lymph node volume by ultra-high-frequency ultrasound imaging in the braf/pten genetically engineered mouse model of melanoma
Uploaded: 2021-09-08T14:00:00
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Die Autoren danken S. Burchielli (FTGM, Pisa) für ihre Unterstützung bei Tierverfahren. Diese Arbeit wurde von ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica institutionelle Finanzierung von LP unterstützt; MFAG #17095 verliehen von AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro an LP.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom italienischen Gesundheitsministerium genehmigt (Tierprotokolle #754/2015-PR und #684/2018-PR).
1. Melanom-Induktion
HINWEIS: Sechs Wochen alte Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox Mäuse [B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)] wurden in dieser Studie verwendet (siehe Materialtabelle).
<ol><li>Behandeln Sie die Mäuse ...

<ol>
	<li>Schvartsman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+metastatic+cutaneous+melanoma:+updates+in+clinical+practice.">Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice.</a> Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663 (2019).</li><li>Blum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+examination+of+regional+lymph+nodes+significantly+improves+early+detection+of+locoregional+metastases+during+the+follow-up+of+patients+with+cutaneous+melanoma+-+Results+of+a+prospective+study+of+1288+patients.">Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma - Results of a prospective study of 1288 patients.</a> Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).</li><li>Olmedo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+lymph+node+ultrasound+prior+to+sentinel+lymph+node+biopsy+in+384+patients+with+melanoma:+a+cost-effectiveness+analysis.">Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis.</a> Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).</li><li>Voit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+morphology+criteria+predict+metastatic+disease+of+the+sentinel+nodes+in+patients+with+melanoma.">Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).</li><li>Hayes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+cohort+study+of+ultrasound+surveillance+of+regional+lymph+nodes+in+patients+with+intermediate-risk+cutaneous+melanoma.">Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma.</a> British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).</li><li>Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ultrasound+surveillance+of+lymph+nodes+following+lymphoscintigraphy+without+sentinel+node+biopsy:+a+useful+and+safe+strategy+in+elderly+or+frail+melanoma+patients.">Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients.</a> Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).</li><li>Jayapal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+between+benign+and+metastatic+cervical+lymph+nodes+using+ultrasound.">Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, 338-346 (2019).</li><li>Dankort, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Braf(V600E)+cooperates+with+Pten+loss+to+induce+metastatic+melanoma.">Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma.</a> Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).</li><li>Damsky, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-catenin+signaling+controls+metastasis+in+Braf-activated+Pten-deficient+melanomas.">&#946;-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas.</a> Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).</li><li>Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg7+overcomes+senescence+and+promotes+growth+of+BrafV600E-driven+melanoma.">Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma.</a> Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).</li><li>Kohler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cutaneous+melanoma+induced+by+mutant+BRaf+arises+from+expansion+and+dedifferentiation+of+mature+pigmented+melanocytes.">Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).</li><li>Yuan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenformin+enhances+the+therapeutic+benefit+of+BRAF(V600E)+inhibition+in+melanoma.">Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).</li><li>Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+AKT+dependency+displayed+by+mouse+models+of+BRAFV600E-initiated+melanoma.">Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).</li><li>Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+BRAFV600E+in+an+inducible+murine+model+of+melanoma.">Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma.</a> American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).</li><li>Steinberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+inhibition+alleviates+immune+suppression+in+murine+autochthonous+melanoma.">BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma.</a> Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).</li><li>Vitiello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumoral+effects+of+attenuated+Listeria+monocytogenes+in+a+genetically+engineered+mouse+model+of+melanoma.">Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma.</a> Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).</li><li>Moon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocyte+stem+cell+activation+and+translocation+initiate+cutaneous+melanoma+in+response+to+UV+exposure.">Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).</li><li>Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+2-and+3-dimensional+assessment+of+tumor+volume+and+vascular+density+by+ultrasonography+in+a+transgenic+mouse+model+of+mammary+carcinoma.">Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma.</a> Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).</li></ol>

Die in dieser Studie erhaltenen Daten belegen die Fähigkeit der Ultraschallbildgebung, die metastatische Beteiligung der Leistenlymphknoten des Braf/Pten-Mausmodells des metastasierenden Melanoms zu überwachen. Wie bereits gezeigt16, ist diese Technik besonders nützlich, um die Wirksamkeit der medikamentösen Behandlung zu beurteilen. Dies liegt daran, dass es die Überwachung der Veränderung des Lymphknotenvolumens bei demselben Tier im Laufe der Zeit ermöglicht, indem die bei t1 ...

Melanom ist eine aggressive Form von Hautkrebs, die sich oft auf andere Hautstellen (subkutane Metastasen) sowie auf Lymphknoten, Lunge, Leber, Gehirn und Knochen ausbreitet1. In den letzten zehn Jahren wurden neue Medikamente in die klinische Praxis eingeführt und haben dazu beigetragen, die Lebenserwartung von Patienten mit metastasierendem Melanom zu verbessern. Es bleiben jedoch Einschränkungen bestehen, einschließlich der variablen Reaktionszeit und des Grades des Ansprechens, schwerer Nebenwirkungen und des Aufruhrs erworbener Resistenzen1. Daher ist es wichtig, die metastatische Ausbreitung in ihren frühen Stadien zu erkennen, d.h. wenn sie zu den lokalen Lymphknoten gelangt.
Eine Biopsie der lokalen Lymphknoten (Sentinellymphknoten) wird normalerweise durchgeführt, um das Vorhandensein von Melanomzellen zu überprüfen. Die Ultraschallbildgebung setzt sich jedoch als nicht-invasive Methode zur Erkennung metastasierender Beteiligung durch, da sie die klinische Bewertung übertrifft und dazu beitragen kann, eine unnötige Biopsie zu vermeiden2,3,4. Darüber hinaus scheint die Ultraschallbildgebung für die Lymphknotenüberwachung geeignet zu sein, insbesondere bei fortgeschrittenem Alter und/oder Komorbiditäten5,6. Zu den Merkmalen, die durch Ultraschallanalyse erkannt werden und die Unterscheidung zwischen normalen und metastasierenden Lymphknoten ermöglichen, gehören eine erhöhte Größe (Volumen), eine Formänderung von oval zu rund, ein unregelmäßiger Rand, ein verändertes echogenes Muster und eine veränderte (erhöhte) Vaskularisation7.
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox gentechnisch veränderte Mäuse (Braf/Pten-Mäuse) wurden kürzlich der wissenschaftlichen Gemeinschaft als gewebespezifisches und induzierbares Modell für metastasierendes Melanom zur Verfügung gestellt8. In diesem Tiermodell entwickeln sich Primärtumoren sehr schnell: Sie werden innerhalb von 2-3 Wochen nach der Induktion des Wechsels von Wildtyp (wt) Braf zu BrafV600E und des Verlustes von Pten sichtbar, während sie innerhalb von 4 Wochen ein Volumen von 50-100 mm3 erreichen. In den folgenden 2 Wochen wird das Wachstum des Primärtumors von einer fortschreitenden Zunahme der metastatischen Belastung an anderen Hautstellen, Lymphknoten und Lungen begleitet.
Braf/Pten-Mäuse wurden in großem Umfang für verschiedene Zwecke verwendet, einschließlich der Sezierung von Signalwegen, die an der Melanomagese beteiligt sind9,10, der Identifizierung von Melanomzellen der Herkunft11,12,13 und der Erprobung neuer therapeutischer Optionen sowohl in Bezug auf die zielgerichtete Therapie als auch auf die Immuntherapie8,14,15,16 . Insbesondere verwendeten wir Braf / Pten-Mäuse, um zu zeigen, dass abgeschwächte Listeria monocytogenes (Lmat) als Anti-Melanom-Impfstoff wirken. Bei systemischer Verabreichung im therapeutischen Umfeld ist Lmat nicht mit der Gesamttoxizität assoziiert, da es sich selektiv an Tumorstellen ansammelt. Darüber hinaus verursacht es eine bemerkenswerte Abnahme der primären Melanommasse und eine Verringerung der metastatischen Belastung in den Lymphknoten und Lungen. Auf molekularer Ebene verursacht Lmat eine apoptotische Abtötung von Melanomzellen, die zumindest teilweise auf nicht-zellautonome Aktivitäten zurückzuführen ist (Rekrutierung von CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten vor Ort)16.
Wenn Braf/Pten-Mäuse für die Melanommodellierung verwendet werden, kann das Wachstum von Primärtumoren und subkutanen Metastasen durch Messschiebermessungen überwacht werden. Die Beteiligung von Lymphknoten und Lungen muss jedoch mit einer alternativen Technik untersucht werden, möglicherweise einer nicht-invasiven, die es Forschern ermöglicht, dasselbe Tier im Laufe der Zeit zu verfolgen. Dieses Papier beschreibt die Verwendung der Ultraschallbildgebung (Abbildung 1), gekoppelt mit einer anschließenden volumetrischen 3D-Analyse der erhaltenen Daten, für die longitudinale Überwachung der Zunahme der Größe (des Volumens) von Leistenlymphknoten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-hydroxytamoxifen</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H6278</td>
			<td>drug used for tumor induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>013590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blu gel</td>
			<td>Sooft Ialia</td>
			<td></td>
			<td>ophthalmic solution gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAFV600E antibody</td>
			<td>Spring Bioscience Corporation</td>
			<td>E19290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo (isoflorane)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>liquid for gaseous anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLANA antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M2-7C10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma gel</td>
			<td>Parker</td>
			<td></td>
			<td>electrode gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transonic gel clear</td>
			<td>Telic SAU</td>
			<td></td>
			<td>ultrasound gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veet</td>
			<td>Reckitt Benckiser IT</td>
			<td></td>
			<td>depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Dual Anesthesia System</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MX550S</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td>
			<td></td>
			<td>UHFUS linear probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 3100</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td>
			<td></td>
			<td>UHFUS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Imaging Station</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td>
			<td></td>
			<td>UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Lab</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td>
			<td></td>
			<td>software platform for ultrasound image post-processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of lymph node volume by ultra-high-frequency ultrasound imaging in the braf/pten genetically engineered mouse model of melanoma

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox gentechnisch veränderte Mäuse (Braf/Pten-Mäuse) werden häufig als In-vivo-Modell für metastasierendes Melanom verwendet. Sobald ein Primärtumor durch die Behandlung mit Tamoxifen induziert wurde, wird innerhalb von 4-6 Wochen nach der Induktion ein Anstieg der metastatischen Belastung beobachtet. Dieses Papier zeigt, wie die Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) -Bildgebung genutzt werden kann, um die Zunahme der metastatischen Beteiligung der Leistenlymphknoten zu überwachen, indem die Zunahme ihres Volumens gemessen wird.
Das UHFUS-System dient zum Scannen von betäubten Mäusen mit einer UHFUS-Linearsonde (22-55 MHz, axiale Auflösung 40 μm). B-Mode-Bilder von den Leistenlymphknoten (sowohl linke als auch rechte Seite) werden in einer Kurzachsenansicht aufgenommen, in der die Tiere im dorsalen Liegebereich positioniert werden. Ultraschallaufzeichnungen werden mit einer Schrittgröße von 44 μm an einem motorisierten mechanischen Arm erfasst. Anschließend werden zweidimensionale (2D) B-Mode-Aufnahmen in die Softwareplattform für die Nachbearbeitung von Ultraschallbildern importiert und Leistenlymphknoten in den erfassten Querschnitts-2D-Bildern halbautomatisch identifiziert und segmentiert. Schließlich wird automatisch eine vollständige Rekonstruktion des dreidimensionalen (3D) Volumens zusammen mit der Darstellung des Lymphknotenvolumens erhalten, die auch als absolute Messung ausgedrückt wird.
Diese nicht-invasive In-vivo-Technik ist sehr gut verträglich und ermöglicht die Planung mehrerer Bildgebungssitzungen am selben Versuchstier über 2 Wochen. Es ist daher ideal, um die Auswirkungen der pharmakologischen Behandlung auf metastasierende Erkrankungen zu bewerten.

Nach der Hautmalerei von Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox-Mäusen mit 4-HT wird eine Cre-Aktivität induziert, wodurch es auf genomischer Ebene einen Wechsel von wt Braf zu BrafV600E gibt, während Pten verloren geht (Abbildung 3A). In 2-3 Wochen entwickeln Mäuse vor Ort Primärtumoren mit 100% Penetranz. Nach vier Wochen nach der 4-HT-Behandlung (t0) erreichen Primärtumoren ein Volumen von 50-100 mm3, und ihr Wachstum kann mit ...

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Analysis of Lymph Node Volume by Ultra-High-Frequency Ultrasound Imaging in the Braf/Pten Genetically Engineered Mouse Model of Melanoma

Melanom ist eine sehr aggressive Krankheit, die sich schnell auf andere Organe ausbreitet. Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung der Ultrahochfrequenz-Ultraschallbildgebung in Verbindung mit 3D-Rendering zur Überwachung des Volumens der Leistenlymphknoten im Braf/Pten-Mausmodell des metastasierenden Melanoms.

Analyse des Lymphknotenvolumens mittels Ultrahochfrequenz-Ultraschallbildgebung im gentechnisch veränderten Mausmodell des Melanoms von Braf/Pten

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;genetically engineered mice (Braf/Pten mice) are widely used as an in vivo model of metastatic melanoma. Once a ...

Unsere Methode ermöglicht es, die Zunahme der metastatischen Beteiligung von Leistenlymphknoten zu überwachen, indem die Zunahme ihres Volumens gemessen wird. Diese uninvasive Methode ist sehr gut verträglich, daher können mehrere bildgebende Sitzungen am selben Versuchstier über einen Zeitraum von zwei Wochen geplant werden. Diese Methode ist ideal, um die Auswirkungen der pharmakologischen Behandlung auf metastasierende Erkrankungen zu beurteilen.Wir haben diese Methode auf das Braf/Pten-Melanommodell angewendet, aber im Prinzip kann sie angepasst werden, um die Wirksamkeit verschiedener Medikamente in einer Vielzahl von präklinischen Mausmodellen für metastasierenden Krebs zu bewerten. Das Verfahren wird von Dr. Marianna Vitiello, einer Postdoktorandin aus meinem Labor, und Dr. Claudia Kusmic, Forscherin am IFC-CNR, demonstriert. Für die Melanominduktion drei Mikroliter fünf-millimolar 4-Hydroxytamoxifen drei Tage hintereinander auf etwa einen Quadratzentimeter rasierte Haut des oberen Rückens auftragen.Verwenden Sie sechs Wochen nach der Hautmalerei Bremssättel, um das Volumen des Primärtumors und schließlich der subkutanen Metastasen zu messen. Verwenden Sie dann die Ultraschallbildgebung, um das Volumen der Leistenlymphknoten zu messen. Nachdem Sie den Primärtumor und die Lymphknoten durch visuelle Inspektion analysiert haben, schneiden Sie sie für histologische Studien aus.Nachdem Sie die Anästhesie bestätigt haben, bringen Sie das Tier auf eine beheizte Platte der Ultrahochfrequenz-Ultraschallbildgebungsstation und halten Sie das Tier in Rückenlage. Stellen Sie die Platinentemperatur mit einer mit Vaseline geschmierten Rektalsonde ein, um die Körpertemperatur der Maus im physiologischen Bereich zu halten. Beschichten Sie die Vorder- und Hinterpfoten mit leitfähiger Paste und kleben Sie sie auf die in die Platine eingebetteten EKG-Plattenelektroden.Überprüfen Sie, ob die physiologischen Parameter korrekt erfasst und angezeigt werden. Entfernen Sie Haare aus beiden Leistenbereichen, indem Sie ein Enthaarungsmittel auftragen und mit einem akustischen Kopplungsmedium beschichten. Klemmen Sie dann die ultrahochfrequente Ultraschall-Linearsonde in einen speziellen 3D-Motor, der in die Bildgebungsstation eingebettet ist, um eine automatisierte und schrittweise Bewegung der Sonde zu ermöglichen.Richten Sie die Position der Ultraschallsonde richtig aus und stellen Sie sie ein, um Bilder des Leistenlymphknotens mit kurzem Zugang zu erhalten, und platzieren Sie die interessierende Region in der Fokuszone. Stellen Sie den Scanabstand zwischen zwei und fünf Millimetern, die Schrittgröße auf 44 Mikrometer mit einem Ergebnis von 46 bis 114 Scanschritten pro Lymphknotenschnitt und eine Aufnahmezeit von ein bis drei Minuten pro Tier ein. Scannen Sie das gesamte Volumen des Leistenlymphknotens als Sequenz von 2D-B-Modus-Bildern und erfassen Sie Bilder auf mehreren Ebenen durch lineare Bewegung des Wandlers mit Schrittweiten auf einer Mikrometerskala, um 3D-Daten in Bezug auf Atmung und kardiale Cine-Schleifen zu erzeugen.Speichern Sie die aufgenommenen Bilder nach der Bildgebung digital im Rohformat für weitere Offline-Analysen. Für die Nachbearbeitung von Ultraschallbildern öffnen Sie den Datensatz der 3D-Leistenlymphknotenbilder, wählen Sie die Multi-Slice-Methode und drücken Sie die Schaltfläche Start, um sowohl die aktuellen Frames als auch die Miniaturansichten aller Frames zu visualisieren, die jedem während der 3D-Aufnahme aufgenommenen Bild entsprechen. Wählen Sie die Miniaturansicht des ersten Frames aus, in dem der Lymphknoten sichtbar ist, um ihn in die Konturansicht zu laden.Klicken Sie in der Konturansicht mit der linken Maustaste auf die Maus, um Punkte entlang des Randes des Lymphknotens abzulegen. Sobald die gewünschte Anzahl von Punkten festgelegt wurde, lecken Sie rechts, um die Kontur zu vervollständigen. Nachdem die erste Kontur abgeschlossen ist, verwenden Sie die Miniaturansicht, um das nächste Bild für die Konturierung auszuwählen.Überspringen Sie bei Bedarf mehrere Bilder zwischen den Konturen, um die Anzahl der manuellen Spuren zu reduzieren, die für jedes 3D-Volumen erforderlich sind. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das gesamte Volume skizziert wurde, und klicken Sie dann auf Fertig stellen. Klicken Sie im Arbeitsbereich des 3D-Modusfensters auf das Symbol für die Volumenmessung unter dem Bildanzeigebereich, um den numerischen Wert des Lymphknotenvolumens zu visualisieren, und aktivieren Sie die Oberflächenansicht mit dem 3D-Rendering des Lymphknotenvolumens.Die Behandlung von Mäusen mit 4-Hydroxytamoxifen induziert CreER-Enzymaktivität und verursacht einen Wechsel auf genomischer Ebene von Wildtyp-Braf zu mutiertem Braf V600E, während Pten verloren geht. Vier Wochen nach der 4-Hydroxytamoxifen-Behandlung erreichen Primärtumoren ein Volumen von 50 bis 100 Kubikmillimetern und ihr Wachstum kann mit Bremssätteln für weitere zwei Wochen gemessen werden, wodurch eine allmähliche Zunahme der Pigmentierung in den Leistenlymphknoten beobachtet wird. Die Melaninablagerungen sind ausnahmslos auf das Vorhandensein von metastasierten Melanomzellen zurückzuführen, wie durch immunhistochemische Färbung des Melanomantigens MelanA und Braf V600E bestätigt wird.Am Ende der Segmentierungsphase zeigten alle Abschnitte die Überlagerung der äußeren Kontur des Lymphknotens. Hier werden die 3D-Renderings eines rechten Leistenlymphknotens gezeigt, die nach vier, fünf und sechs Wochen nach der 4-HT-Behandlung analysiert wurden. Die Zunahme des Volumens der linken und rechten Leistenlymphknoten desselben Tieres im Laufe der Zeit wurde ebenfalls quantifiziert.Es wird empfohlen, die Ultraschallbildgebung mit einer geeigneten immunhistochemischen Färbung zu koppeln, damit das Vorhandensein von Krebszellen auf molekularer Ebene bestätigt wird. Neben den Lymphknoten kann auch das Volumen der subkutanen Metastasierung im Laufe der Zeit mittels Ultraschallbildgebung überwacht werden. Wenn der Zeitrahmen von zwei Wochen zu kurz ist, um die Auswirkungen des untersuchten Arzneimittels zu beurteilen, wählen Sie eine peripherere Induktionsstelle oder einen weniger tumoranfälligen Genotyp.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Forschung

Krebsforschung

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