Name: analysis of lymph node volume by ultra-high-frequency ultrasound imaging in the braf/pten genetically engineered mouse model of melanoma
Uploaded: 2021-09-08T14:00:00
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Gli autori ringraziano S. Burchielli (FTGM, Pisa) per la sua assistenza nelle procedure animali. Questo lavoro è stato sostenuto da ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica finanziamento istituzionale a LP; MFAG #17095 assegnato da AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro a LP.

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Ministero della Salute italiano (protocolli animali #754/2015-PR e #684/2018-PR).
1. Induzione del melanoma
NOTA: In questo studio sono stati utilizzati topi Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox di sei settimane [B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)] (vedere la Tabella dei materiali).
<ol><li>Trattare i top...

<ol>
	<li>Schvartsman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+metastatic+cutaneous+melanoma:+updates+in+clinical+practice.">Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice.</a> Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663 (2019).</li><li>Blum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+examination+of+regional+lymph+nodes+significantly+improves+early+detection+of+locoregional+metastases+during+the+follow-up+of+patients+with+cutaneous+melanoma+-+Results+of+a+prospective+study+of+1288+patients.">Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma - Results of a prospective study of 1288 patients.</a> Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).</li><li>Olmedo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+lymph+node+ultrasound+prior+to+sentinel+lymph+node+biopsy+in+384+patients+with+melanoma:+a+cost-effectiveness+analysis.">Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis.</a> Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).</li><li>Voit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+morphology+criteria+predict+metastatic+disease+of+the+sentinel+nodes+in+patients+with+melanoma.">Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).</li><li>Hayes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+cohort+study+of+ultrasound+surveillance+of+regional+lymph+nodes+in+patients+with+intermediate-risk+cutaneous+melanoma.">Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma.</a> British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).</li><li>Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ultrasound+surveillance+of+lymph+nodes+following+lymphoscintigraphy+without+sentinel+node+biopsy:+a+useful+and+safe+strategy+in+elderly+or+frail+melanoma+patients.">Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients.</a> Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).</li><li>Jayapal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+between+benign+and+metastatic+cervical+lymph+nodes+using+ultrasound.">Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, 338-346 (2019).</li><li>Dankort, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Braf(V600E)+cooperates+with+Pten+loss+to+induce+metastatic+melanoma.">Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma.</a> Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).</li><li>Damsky, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-catenin+signaling+controls+metastasis+in+Braf-activated+Pten-deficient+melanomas.">&#946;-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas.</a> Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).</li><li>Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg7+overcomes+senescence+and+promotes+growth+of+BrafV600E-driven+melanoma.">Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma.</a> Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).</li><li>Kohler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cutaneous+melanoma+induced+by+mutant+BRaf+arises+from+expansion+and+dedifferentiation+of+mature+pigmented+melanocytes.">Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).</li><li>Yuan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenformin+enhances+the+therapeutic+benefit+of+BRAF(V600E)+inhibition+in+melanoma.">Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).</li><li>Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+AKT+dependency+displayed+by+mouse+models+of+BRAFV600E-initiated+melanoma.">Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).</li><li>Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+BRAFV600E+in+an+inducible+murine+model+of+melanoma.">Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma.</a> American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).</li><li>Steinberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+inhibition+alleviates+immune+suppression+in+murine+autochthonous+melanoma.">BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma.</a> Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).</li><li>Vitiello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumoral+effects+of+attenuated+Listeria+monocytogenes+in+a+genetically+engineered+mouse+model+of+melanoma.">Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma.</a> Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).</li><li>Moon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocyte+stem+cell+activation+and+translocation+initiate+cutaneous+melanoma+in+response+to+UV+exposure.">Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).</li><li>Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+2-and+3-dimensional+assessment+of+tumor+volume+and+vascular+density+by+ultrasonography+in+a+transgenic+mouse+model+of+mammary+carcinoma.">Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma.</a> Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).</li></ol>

I dati ottenuti in questo studio attestano la capacità dell'ecografia di monitorare il coinvolgimento metastatico dei linfonodi inguinali del modello murino Braf/Pten di melanoma metastatico. Come mostrato in precedenza16, questa tecnica è particolarmente utile per valutare l'efficacia del trattamento farmacologico. Questo perché permette il monitoraggio della variazione del volume linfonodale nello stesso animale nel tempo, confrontando le misurazioni raccolte a t1 et2<su...

Il melanoma è una forma aggressiva di cancro della pelle che spesso si diffonde ad altri siti cutanei (metastasi sottocutanee), nonché a linfonodi, polmoni, fegato, cervello e ossa1. Nell'ultimo decennio, nuovi farmaci sono stati introdotti nella pratica clinica e hanno contribuito a migliorare l'aspettativa di vita dei pazienti con melanoma metastatico. Tuttavia, permangono limitazioni, tra cui il tempo e il grado di risposta variabili, gravi effetti collaterali e l'insorgenza di resistenza acquisita1. Pertanto, è fondamentale rilevare la diffusione metastatica nelle sue fasi iniziali, cioè quando arriva ai linfonodi locali.
Una biopsia dei linfonodi locali (linfonodi sentinella) viene solitamente eseguita per verificare la presenza di cellule di melanoma. Tuttavia, l'imaging ecografico sta prendendo piede come metodo non invasivo per rilevare il coinvolgimento metastatico, in quanto supera la valutazione clinica e può aiutare a evitare una biopsia non necessaria2,3,4. Inoltre, l'imaging ecografico sembra appropriato per la sorveglianza dei linfonodi, specialmente in caso di età avanzata e/o comorbidità5,6. Le caratteristiche che vengono rilevate dall'analisi ecografica e consentono la differenziazione tra linfonodi normali e metastatici comprendono l'aumento delle dimensioni (volume), il cambiamento di forma da ovale a rotondo, il margine irregolare, il modello ecogenico alterato e la vascolarizzazione alterata (aumentata)7.
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox topi geneticamente modificati (topi Braf/Pten) sono stati recentemente messi a disposizione della comunità scientifica come modello tessuto-specifico e inducibile per il melanoma metastatico8. In questo modello animale, i tumori primari si sviluppano molto rapidamente: diventano visibili entro 2-3 settimane dall'induzione del passaggio da Braf wild-type (wt) a BrafV600E e della perdita di Pten, mentre raggiungono un volume di 50-100 mm3 entro 4 settimane. Nelle successive 2 settimane, la crescita del tumore primario è accompagnata da un progressivo aumento del carico metastatico in altri siti cutanei, linfonodi e polmoni.
I topi Braf/Pten sono stati ampiamente utilizzati per molteplici scopi, tra cui la dissezione delle vie di segnalazione coinvolte nella melanomagenesi9,10, l'identificazione delle cellule di melanoma di origine11,12,13 e la sperimentazione di nuove opzioni terapeutiche in termini sia di terapia mirata che di immunoterapia8,14,15,16 . In particolare, abbiamo usato topi Braf / Pten per dimostrare che Listeria monocytogenes attenuata (Lmat) funziona come vaccino anti-melanoma. Quando somministrato per via sistemica in ambito terapeutico, Lmat non è associato a tossicità complessiva in quanto si accumula selettivamente nei siti tumorali. Inoltre, provoca una notevole diminuzione della massa del melanoma primario e una riduzione del carico metastatico nei linfonodi e nei polmoni. A livello molecolare, Lmat provoca l'uccisione apoptotica delle cellule di melanoma, che è dovuta, almeno in parte, ad attività non autonome delle cellule (reclutamento in loco di linfociti T CD4+ e CD8+)16.
Quando i topi Braf / Pten vengono utilizzati per la modellazione del melanoma, la crescita dei tumori primari e delle metastasi sottocutanee può essere monitorata mediante misurazioni del calibro. Tuttavia, il coinvolgimento di linfonodi e polmoni deve essere studiato utilizzando una tecnica alternativa, possibilmente non invasiva che consenta ai ricercatori di seguire lo stesso animale nel tempo. Questo articolo descrive l'uso dell'imaging ecografico (Figura 1), abbinato ad una successiva analisi volumetrica 3D dei dati ottenuti, per il monitoraggio longitudinale dell'aumento delle dimensioni (volume) dei linfonodi inguinali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-hydroxytamoxifen</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H6278</td>
			<td>drug used for tumor induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>013590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blu gel</td>
			<td>Sooft Ialia</td>
			<td></td>
			<td>ophthalmic solution gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAFV600E antibody</td>
			<td>Spring Bioscience Corporation</td>
			<td>E19290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo (isoflorane)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>liquid for gaseous anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLANA antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M2-7C10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma gel</td>
			<td>Parker</td>
			<td></td>
			<td>electrode gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transonic gel clear</td>
			<td>Telic SAU</td>
			<td></td>
			<td>ultrasound gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veet</td>
			<td>Reckitt Benckiser IT</td>
			<td></td>
			<td>depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Dual Anesthesia System</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MX550S</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td>
			<td></td>
			<td>UHFUS linear probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 3100</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td>
			<td></td>
			<td>UHFUS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Imaging Station</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td>
			<td></td>
			<td>UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Lab</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td>
			<td></td>
			<td>software platform for ultrasound image post-processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of lymph node volume by ultra-high-frequency ultrasound imaging in the braf/pten genetically engineered mouse model of melanoma

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox topi geneticamente modificati (topi Braf/Pten) sono ampiamente usati come modello in vivo di melanoma metastatico. Una volta che un tumore primario è stato indotto dal trattamento con tamoxifene, si osserva un aumento del carico metastatico entro 4-6 settimane dall'induzione. Questo documento mostra come l'imaging Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) può essere sfruttato per monitorare l'aumento del coinvolgimento metastatico dei linfonodi inguinali misurando l'aumento del loro volume.
Il sistema UHFUS viene utilizzato per scansionare topi anestetizzati con una sonda lineare UHFUS (22-55 MHz, risoluzione assiale 40 μm). Le immagini in modalità B dei linfonodi inguinali (sia a sinistra che a destra) vengono acquisite in una vista ad asse corto, posizionando gli animali in reclinazione dorsale. I record di ultrasuoni vengono acquisiti utilizzando una dimensione del gradino di 44 μm su un braccio meccanico motorizzato. Successivamente, le acquisizioni bidimensionali (2D) in modalità B vengono importate nella piattaforma software per la post-elaborazione delle immagini a ultrasuoni e i linfonodi inguinali vengono identificati e segmentati semi-automaticamente nelle immagini 2D trasversali acquisite. Infine, si ottiene automaticamente una ricostruzione totale del volume tridimensionale (3D) insieme alla resa del volume linfonodale, che viene anche espresso come misura assoluta.
Questa tecnica in vivo non invasiva è molto ben tollerata e consente la programmazione di più sessioni di imaging sullo stesso animale sperimentale nell'arco di 2 settimane. È, quindi, ideale per valutare l'impatto del trattamento farmacologico sulla malattia metastatica.

Dopo la verniciatura cutanea di topi Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox con 4-HT, viene indotta l'attività cre, grazie alla quale c'è un passaggio a livello genomico da wt Braf a BrafV600E, mentre Pten viene perso (Figura 3A). In 2-3 settimane, i topi sviluppano tumori primari in loco con penetranza al 100%. Dopo quattro settimane dal trattamento 4-HT (t0), i tumori primari raggiungono un volume di 50-100 mm3 e la loro crescita pu...

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Analysis of Lymph Node Volume by Ultra-High-Frequency Ultrasound Imaging in the Braf/Pten Genetically Engineered Mouse Model of Melanoma

Il melanoma è una malattia molto aggressiva che si diffonde rapidamente ad altri organi. Questo protocollo descrive l'applicazione dell'imaging ecografico ad altissima frequenza, abbinato al rendering 3D, per monitorare il volume dei linfonodi inguinali nel modello murino Braf/Pten del melanoma metastatico.

Analisi del volume dei linfonodi mediante imaging ecografico ad altissima frequenza nel modello murino geneticamente modificato braf/Pten del melanoma

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;genetically engineered mice (Braf/Pten mice) are widely used as an in vivo model of metastatic melanoma. Once a ...

Il nostro metodo consente di monitorare l'aumento del coinvolgimento metastatico dei linfonodi inguinali misurando l'aumento del loro volume. Questo metodo non invasivo è molto ben tollerato, pertanto è possibile programmare più sessioni di imaging sullo stesso animale sperimentale nel corso di due settimane. Questo metodo è ideale per valutare l'impatto del trattamento farmacologico sulla malattia metastatica.Abbiamo applicato questo metodo al modello di melanoma Braf / Pten, ma in linea di principio può essere adattato per valutare l'efficacia di vari farmaci in una varietà di modelli murini preclinici di cancro metastatico. A dimostrare la procedura saranno la Dott.ssa Marianna Vitiello, post-doc del mio laboratorio, e la Dott.ssa Claudia Kusmic, collega ricercatrice presso l'IFC-CNR. Per l'induzione del melanoma, applicare tre microlitri di 4-idrossitamoxifene a cinque millimolari su circa un centimetro quadrato di pelle rasata della parte superiore della schiena per tre giorni consecutivi.Sei settimane dopo la verniciatura della pelle, utilizzare le pinze per misurare il volume del tumore primario e, infine, delle metastasi sottocutanee. Quindi, utilizzare l'imaging ad ultrasuoni per misurare il volume dei linfonodi inguinali. Dopo aver analizzato il tumore primario e i linfonodi mediante ispezione visiva, asportareli per studi istologici.Dopo aver confermato l'anestesia, trasferire l'animale su una scheda riscaldata della stazione di imaging ad ultrasuoni ad altissima frequenza, tenendo l'animale in posizione supina. Regolare la temperatura della scheda utilizzando una sonda rettale lubrificata con vaselina per mantenere la temperatura corporea del mouse nell'intervallo fisiologico. Rivestire le zampe anteriori e posteriori con pasta conduttiva e fissarle agli elettrodi della piastra ECG incorporati nella scheda.Verificare che i parametri fisiologici siano correttamente acquisiti e visualizzati. Rimuovere i peli da entrambe le aree inguinali applicando un agente depilatorio e rivestirli con un mezzo di accoppiamento acustico. Quindi, bloccare la sonda lineare ad ultrasuoni ad altissima frequenza in un motore 3D specializzato incorporato nella stazione di imaging, consentendo un movimento automatizzato e graduale della sonda.Orientare e regolare correttamente la posizione della sonda ad ultrasuoni per ottenere immagini a breve accesso del linfonodo inguinale e posizionare la regione di interesse della zona focale. Impostare la distanza di scansione tra due e cinque millimetri, la dimensione del passo a 44 micrometri con un risultato da 46 a 114 passaggi di scansione per fetta di linfonodo e un tempo di acquisizione da uno a tre minuti per animale. Scansiona l'intero volume del linfonodo inguinale come una sequenza di immagini 2D in modalità B, acquisendo immagini a più livelli mediante movimento lineare del trasduttore con dimensioni del passo su scala micrometrica per generare dati 3D in termini di respirazione e loop cine-dipendenti cardiaci.Dopo l'imaging, memorizza digitalmente le immagini acquisite in formato raw per ulteriori analisi offline. Per la post-elaborazione delle immagini ad ultrasuoni, aprire il set di dati delle immagini dei linfonodi inguinali 3D, selezionare il metodo multi-slice e premere il pulsante Start per visualizzare sia i fotogrammi correnti che le miniature di tutti i fotogrammi corrispondenti a ciascuna immagine acquisita durante l'acquisizione 3D. Selezionate la miniatura del primo fotogramma in cui il linfonodo è evidente per caricarlo nella vista di contornatura.Nella vista di contornatura, fare clic con il pulsante sinistro del mouse per rilasciare i punti lungo il bordo del linfonodo. Una volta impostato il numero desiderato di punti, leccare a destra per completare il contorno. Una volta completato il primo contorno, utilizzate la vista miniatura per selezionare l'immagine successiva per il contorno.Se necessario, saltare diverse immagini tra i contorni per ridurre il numero di tracce manuali necessarie per ogni volume 3D. Ripeti questo processo fino a quando l'intero volume non è stato delineato, quindi fai clic su Fine. Nell'area di lavoro della finestra della modalità 3D, fare clic sull'icona di misurazione del volume sotto l'area di visualizzazione dell'immagine per visualizzare il valore numerico del volume dei linfonodi e attivare la vista della superficie con il rendering 3D del volume dei linfonodi.Il trattamento dei topi con 4-idrossitamoxifene induce l'attività enzimatica creER, causando un passaggio a livello genomico da Braf wild-type a Braf V600E mutato, mentre Pten viene perso. Quattro settimane dopo il trattamento con 4-idrossitamoxifene, i tumori primari raggiungono un volume da 50 a 100 millimetri cubi e la loro crescita può essere misurata da calibri per altre due settimane, mostrando così un graduale aumento della pigmentazione osservata nei linfonodi inguinali. I depositi di melanina sono invariabilmente dovuti alla presenza di cellule di melanoma metastatizzate, come confermato dalla colorazione immunoistochimica dell'antigene del melanoma MelanA e Braf V600E.Alla fine della fase di segmentazione, tutte le sezioni hanno mostrato la sovrapposizione del contorno esterno del linfonodo. I rendering 3D di un linfonodo inguinale destro, analizzati a quattro, cinque e sei settimane dopo il trattamento 4-HT sono mostrati qui. È stato anche quantificato l'aumento di volume dei linfonodi inguinali sinistro e destro dello stesso animale nel tempo.Si raccomanda di accoppiare l'imaging ecografico con un'appropriata colorazione immunoistochimica, in modo che la presenza di cellule tumorali sia confermata a livello molecolare. Oltre ai linfonodi, anche il volume delle metastasi sottocutanee può essere monitorato nel tempo utilizzando l'imaging ad ultrasuoni. Se il periodo di tempo di due settimane è troppo breve per apprezzare gli effetti del farmaco in studio, selezionare un sito di induzione più periferico o un genotipo meno incline al tumore.

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