Name: analysis of lymph node volume by ultra-high-frequency ultrasound imaging in the braf/pten genetically engineered mouse model of melanoma
Uploaded: 2021-09-08T14:00:00
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Os autores gostariam de agradecer a S. Burchielli (FTGM, Pisa) por sua ajuda com procedimentos animais. Este trabalho foi apoiado pelo ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica financiamento institucional para lp; MFAG #17095 concedido pela AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro ao LP.

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Ministério da Saúde italiano (protocolos animais nº 754/2015-PR e nº 684/2018-PR).
1. Indução de melanoma
NOTA: Tyr de seis semanas de idade::CreER+, BrafCA/+,Ratos Ptenlox/lox [B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)] foram usados neste estudo (ver a Tabela de Materiais).
<ol><li>Trate os camundongo...

<ol>
	<li>Schvartsman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+metastatic+cutaneous+melanoma:+updates+in+clinical+practice.">Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice.</a> Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663 (2019).</li><li>Blum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+examination+of+regional+lymph+nodes+significantly+improves+early+detection+of+locoregional+metastases+during+the+follow-up+of+patients+with+cutaneous+melanoma+-+Results+of+a+prospective+study+of+1288+patients.">Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma - Results of a prospective study of 1288 patients.</a> Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).</li><li>Olmedo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+lymph+node+ultrasound+prior+to+sentinel+lymph+node+biopsy+in+384+patients+with+melanoma:+a+cost-effectiveness+analysis.">Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis.</a> Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).</li><li>Voit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+morphology+criteria+predict+metastatic+disease+of+the+sentinel+nodes+in+patients+with+melanoma.">Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).</li><li>Hayes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+cohort+study+of+ultrasound+surveillance+of+regional+lymph+nodes+in+patients+with+intermediate-risk+cutaneous+melanoma.">Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma.</a> British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).</li><li>Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ultrasound+surveillance+of+lymph+nodes+following+lymphoscintigraphy+without+sentinel+node+biopsy:+a+useful+and+safe+strategy+in+elderly+or+frail+melanoma+patients.">Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients.</a> Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).</li><li>Jayapal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+between+benign+and+metastatic+cervical+lymph+nodes+using+ultrasound.">Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, 338-346 (2019).</li><li>Dankort, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Braf(V600E)+cooperates+with+Pten+loss+to+induce+metastatic+melanoma.">Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma.</a> Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).</li><li>Damsky, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-catenin+signaling+controls+metastasis+in+Braf-activated+Pten-deficient+melanomas.">&#946;-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas.</a> Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).</li><li>Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg7+overcomes+senescence+and+promotes+growth+of+BrafV600E-driven+melanoma.">Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma.</a> Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).</li><li>Kohler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cutaneous+melanoma+induced+by+mutant+BRaf+arises+from+expansion+and+dedifferentiation+of+mature+pigmented+melanocytes.">Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).</li><li>Yuan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenformin+enhances+the+therapeutic+benefit+of+BRAF(V600E)+inhibition+in+melanoma.">Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).</li><li>Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+AKT+dependency+displayed+by+mouse+models+of+BRAFV600E-initiated+melanoma.">Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).</li><li>Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+BRAFV600E+in+an+inducible+murine+model+of+melanoma.">Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma.</a> American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).</li><li>Steinberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+inhibition+alleviates+immune+suppression+in+murine+autochthonous+melanoma.">BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma.</a> Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).</li><li>Vitiello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumoral+effects+of+attenuated+Listeria+monocytogenes+in+a+genetically+engineered+mouse+model+of+melanoma.">Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma.</a> Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).</li><li>Moon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocyte+stem+cell+activation+and+translocation+initiate+cutaneous+melanoma+in+response+to+UV+exposure.">Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).</li><li>Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+2-and+3-dimensional+assessment+of+tumor+volume+and+vascular+density+by+ultrasonography+in+a+transgenic+mouse+model+of+mammary+carcinoma.">Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma.</a> Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).</li></ol>

Os dados obtidos neste estudo atestam a capacidade da ultrassom de monitorar o envolvimento metastático de linfonodos inguinais do modelo de camundongo Braf/Pten de melanoma metastático. Como mostrado anteriormente16, esta técnica é especialmente útil para avaliar a eficácia do tratamento medicamentoso. Isso porque permite o monitoramento da alteração no volume de linfonodos no mesmo animal ao longo do tempo, comparando as medidas coletadas no t1 andt2  co...

O melanoma é uma forma agressiva de câncer de pele que muitas vezes se espalha para outros locais de pele (metástases subcutâneas), bem como para linfonodos, pulmões, fígado, cérebro e ossos1. Na última década, novos medicamentos foram introduzidos na prática clínica e contribuíram para melhorar a expectativa de vida de pacientes com melanoma metastático. No entanto, permanecem limitações, incluindo tempo variável e grau de resposta, efeitos colaterais graves e a insurgência da resistência adquirida1. Portanto, é crucial detectar a propagação metastática em seus estágios iniciais, ou seja, quando chega aos linfonodos locais.
Uma biópsia dos linfonodos locais (linfonodos sentinelas) é geralmente realizada para verificar a presença de células de melanoma. No entanto, a imagem de ultrassom está tomando conta como um método não invasivo de detecção de envolvimento metastático, pois supera a avaliação clínica e pode ajudar a evitar uma biópsia desnecessária2,3,4. Além disso, a imagem de ultrassom parece apropriada para a vigilância de linfonodos, especialmente no caso de idade avançada e/ou comorbidades5,6. As características detectadas pela análise do ultrassom e permitem a diferenciação entre linfonodos normais e metastáticos compreendem aumento de tamanho (volume), mudança de forma de oval para redondo, margem irregular, padrão ecogênico alterado e vascularização alterada7.
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox camundongos geneticamente modificados (camundongos Braf/Pten) foram recentemente disponibilizados para a comunidade científica como um modelo específico de tecido e indutível para melanoma metastático8. Neste modelo animal, os tumores primários desenvolvem-se muito rapidamente: tornam-se visíveis dentro de 2-3 semanas após a indução da mudança de braf tipo selvagem (wt) para BrafV600E e da perda de Pten, enquanto atingem um volume de 50-100 mm3 dentro de 4 semanas. Nas 2 semanas seguintes, o crescimento do tumor primário é acompanhado por um aumento progressivo da carga metastática em outros locais de pele, linfonodos e pulmões.
Os camundongos Braf/Pten têm sido amplamente utilizados para múltiplos propósitos, incluindo a dissecção de vias de sinalização envolvidas na melanomagênese 9,10, a identificação de células de melanoma de origem11,12,13 e o teste de novas opções terapêuticas em termos de terapia direcionada e imunoterapia8,14,15,16 . Especificamente, usamos camundongos Braf/Pten para demonstrar que listeria monocytogenes atenuada (Lmat) funciona como uma vacina anti-melanoma. Quando administrado sistematicamente no ambiente terapêutico, o Lmat não está associado à toxicidade geral, pois se acumula seletivamente em locais tumorais. Além disso, causa uma notável diminuição da massa primária de melanoma e uma redução da carga metastática nos linfonodos e pulmões. No nível molecular, o Lmat causa morte apoptótica de células de melanoma, o que se deve, pelo menos em parte, a atividades não autônomas de células (recrutamento no local de linfócitos CD4+ e CD8+ T)16.
Quando os camundongos Braf/Pten são usados para modelagem de melanoma, o crescimento de tumores primários e metástases subcutâneas pode ser monitorado por medidas de pinça. No entanto, o envolvimento de linfonodos e pulmões precisa ser investigado usando uma técnica alternativa, possivelmente uma não invasiva que permite aos pesquisadores seguir o mesmo animal ao longo do tempo. Este artigo descreve o uso de imagens de ultrassom (Figura 1), juntamente com uma análise volumétrica 3D subsequente dos dados obtidos, para o monitoramento longitudinal do aumento do tamanho (volume) de linfonodos inguinais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-hydroxytamoxifen</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H6278</td>
			<td>drug used for tumor induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>013590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blu gel</td>
			<td>Sooft Ialia</td>
			<td></td>
			<td>ophthalmic solution gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAFV600E antibody</td>
			<td>Spring Bioscience Corporation</td>
			<td>E19290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo (isoflorane)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>liquid for gaseous anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLANA antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M2-7C10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma gel</td>
			<td>Parker</td>
			<td></td>
			<td>electrode gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transonic gel clear</td>
			<td>Telic SAU</td>
			<td></td>
			<td>ultrasound gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veet</td>
			<td>Reckitt Benckiser IT</td>
			<td></td>
			<td>depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Dual Anesthesia System</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MX550S</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td>
			<td></td>
			<td>UHFUS linear probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 3100</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td>
			<td></td>
			<td>UHFUS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Imaging Station</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td>
			<td></td>
			<td>UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Lab</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td>
			<td></td>
			<td>software platform for ultrasound image post-processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of lymph node volume by ultra-high-frequency ultrasound imaging in the braf/pten genetically engineered mouse model of melanoma

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox camundongos geneticamente modificados (camundongos Braf/Pten) são amplamente utilizados como um modelo in vivo de melanoma metastático. Uma vez que um tumor primário tenha sido induzido pelo tratamento de tamoxifen, um aumento da carga metastática é observado dentro de 4-6 semanas após a indução. Este artigo mostra como imagens ultra-altas de frequência ultra-alta-freqüência ultrasound (UHFUS) podem ser exploradas para monitorar o aumento do envolvimento metastático dos linfonodos inguinais medindo o aumento de seu volume.
O sistema UHFUS é usado para digitalizar camundongos anestesiados com uma sonda linear UHFUS (22-55 MHz, resolução axial de 40 μm). As imagens do modo B dos linfonodos inguinais (ambos os lados esquerdo e direito) são adquiridas em uma visão de eixo curto, posicionando os animais em recumbência dorsal. Os registros de ultrassom são adquiridos usando um tamanho de passo de 44 μm em um braço mecânico motorizado. Posteriormente, aquisições bidimensionais (2D) do modo B são importadas para a plataforma de software para pós-processamento de imagens de ultrassom, e os linfonodos inguinais são identificados e segmentados semi-automaticamente nas imagens 2D transversais adquiridas. Finalmente, uma reconstrução total do volume tridimensional (3D) é obtida automaticamente juntamente com a renderização do volume do linfonodo, que também é expressa como uma medição absoluta.
Esta técnica in vivo não invasiva é muito bem tolerada e permite o agendamento de múltiplas sessões de imagem no mesmo animal experimental ao longo de 2 semanas. É, portanto, ideal avaliar o impacto do tratamento farmacológico sobre a doença metastática.

Após a pintura da pele de Tyr:::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox ratos com 4-HT, a atividade cre é induzida, devido à qual há uma mudança no nível genômico de wt Braf para BrafV600E, enquanto Pten é perdido (Figura 3A). Em 2-3 semanas, camundongos desenvolvem tumores primários no local com 100% de penetração. Após quatro semanas a partir do tratamento 4-HT (t0), os tumores primários atingem um volume de 50-100 mm3, e seu c...

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Analysis of Lymph Node Volume by Ultra-High-Frequency Ultrasound Imaging in the Braf/Pten Genetically Engineered Mouse Model of Melanoma

O melanoma é uma doença muito agressiva que rapidamente se espalha para outros órgãos. Este protocolo descreve a aplicação de imagens de ultrassom de ultra-alta frequência, juntamente com renderização 3D, para monitorar o volume dos linfonodos inguinais no modelo de camundongo Braf/Pten de melanoma metastático.

Análise do volume do nódulo linfático por ultra-alta frequência ultrassom no modelo de camundongos geneticamente modificado braf/pten de melanoma

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;genetically engineered mice (Braf/Pten mice) are widely used as an in vivo model of metastatic melanoma. Once a ...

Nosso método permite monitorar o aumento do envolvimento metastático de linfonodos inguinais medindo o aumento de seu volume. Este método não invasivo é muito bem tolerado, portanto, várias sessões de imagem podem ser agendadas no mesmo animal experimental ao longo de duas semanas. Este método é ideal para avaliar o impacto do tratamento farmacológico sobre a doença metastática.Aplicamos este método ao modelo de melanoma Braf/Pten, mas, em princípio, pode ser adaptado para avaliar a eficácia de várias drogas em uma variedade de modelos de camundongos pré-clínicos de câncer metastático. O procedimento será a Dra. Para indução de melanoma, aplique três microlitres de cinco milimonas 4-hidroxitamoxifen em aproximadamente um centímetro quadrado de pele raspada da parte superior das costas por três dias seguidos.Seis semanas após a pintura da pele, use pinças para medir o volume do tumor primário e, eventualmente, de metástases subcutâneas. Em seguida, use imagens de ultrassom para medir o volume dos linfonodos inguinais. Depois de analisar o tumor primário e os linfonodos por inspeção visual, extirvo-os para estudos histológicos.Após confirmar a anestesia, transfira o animal para uma placa aquecida da estação de ultrassom de ultra-alta frequência, segurando o animal em uma posição supina. Ajuste a temperatura da placa usando uma sonda retal lubrificada com geleia de petróleo para manter a temperatura corporal do camundongo na faixa fisiológica. Cubra as patas dianteiras e traseiras com pasta condutora e grave-as nos eletrodos da placa ECG embutidos na placa.Verifique se os parâmetros fisiológicos são corretamente adquiridos e exibidos. Remova o cabelo de ambas as áreas inguinais aplicando um agente depilatório e cubra-os com um meio de acoplamento acústico. Em seguida, fixar a sonda linear de ultra-alta frequência em um motor 3D especializado embutido na estação de imagem, permitindo o movimento automatizado e stepwise da sonda.Oriente corretamente e ajuste a posição da sonda de ultrassom para obter imagens de curto acesso do linfonodo inguinal e coloque a região de interesse da zona focal. Defina a distância de varredura entre dois e cinco milímetros, tamanho do passo para 44 micrômetros com um resultado de 46 a 114 passos de varredura por fatia de linfonodo, e um tempo de aquisição de um a três minutos por animal. Escaneie todo o volume do linfonodo inguinal como uma sequência de imagens do modo B 2D, adquirindo imagens em vários níveis por movimento linear do transdutor com tamanhos de passo em uma escala de micrômetro para gerar dados 3D em termos de respiração e laços de cine com porta cardíaca.Após a imagem, armazene digitalmente as imagens adquiridas em formato bruto para novas análises offline. Para pós-processamento de imagens de ultrassom, abra o conjunto de dados das imagens linfonodas inguinais 3D, selecione o método multi-fatia e pressione o botão Iniciar para visualizar os quadros atuais e miniaturas de todos os quadros correspondentes a cada imagem capturada durante a aquisição 3D. Selecione a miniatura do primeiro quadro onde o linfonodo é evidente para carregá-lo na visão de contorno.Na visão de contorno, clique à esquerda no mouse para soltar pontos ao longo da borda do linfonodo. Uma vez definido o número desejado de pontos, lamba direito para completar o contorno. Após o primeiro contorno ser concluído, use a exibição da miniatura para selecionar a próxima imagem para contorno.Se necessário, pule várias imagens entre contornos para reduzir o número de traços manuais necessários para cada volume 3D. Repita este processo até que todo o volume tenha sido delineado e clique em Concluir. Enquanto estiver no espaço de trabalho da janela do modo 3D, clique no ícone de medição de volume abaixo da área de exibição da imagem para visualizar o valor numérico do volume do linfonodo e ative a visão da superfície com a renderização 3D do volume do linfonodo.Tratar camundongos com 4-hidroxytamoxifen induz a atividade enzimática creer, causando um interruptor no nível genômico de Braf tipo selvagem para Braf V600E mutado, enquanto Pten está perdido. Quatro semanas após o tratamento de 4-hidroxytamoxifen, os tumores primários atingem um volume de 50 a 100 milímetros cúbicos e seu crescimento pode ser medido por pinças por mais duas semanas, mostrando assim um aumento gradual da pigmentação observada nos linfonodos inguinais. Os depósitos de melanina são invariavelmente devido à presença de células de melanoma metástase, como confirmado pela coloração imunohistoquímica do antígeno melanoma MelanA e Braf V600E.Ao final da fase de segmentação, todas as seções apresentaram a sobreposição do contorno externo do linfonodo. As renderizações 3D de um linfonodo inguinal direito, analisadas às quatro, cinco e seis semanas após o tratamento 4-HT são mostradas aqui. O aumento do volume dos linfonodos inguinais esquerdo e direito do mesmo animal ao longo do tempo também foi quantificado.Recomenda-se acoplar imagens de ultrassom com coloração imunohistoquímica apropriada, para que a presença de células cancerígenas seja confirmada a nível molecular. Além dos linfonodos, o volume de metástase subcutânea também pode ser monitorado ao longo do tempo usando imagens de ultrassom. Se o prazo de duas semanas for muito curto para apreciar os efeitos da droga em estudo, selecione um local de indução mais periférico ou um genótipo menos propenso a tumores.

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