Name: analysis of lymph node volume by ultra-high-frequency ultrasound imaging in the braf/pten genetically engineered mouse model of melanoma
Uploaded: 2021-09-08T14:00:00
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Los autores desean agradecer a S. Burchielli (FTGM, Pisa) por su ayuda con los procedimientos con animales. Este trabajo fue apoyado por ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica financiación institucional a LP; MFAG #17095 otorgado por AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro a LP.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Ministerio de Salud italiano (protocolos animales #754/2015-PR y #684/2018-PR).
1. Inducción del melanoma
NOTA: En este estudio se utilizaron ratones Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox [B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)] (ver la Tabla de Materiales).
<ol><li>Tratar a los ratones con 4-hidroxita...

<ol>
	<li>Schvartsman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+metastatic+cutaneous+melanoma:+updates+in+clinical+practice.">Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice.</a> Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663 (2019).</li><li>Blum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+examination+of+regional+lymph+nodes+significantly+improves+early+detection+of+locoregional+metastases+during+the+follow-up+of+patients+with+cutaneous+melanoma+-+Results+of+a+prospective+study+of+1288+patients.">Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma - Results of a prospective study of 1288 patients.</a> Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).</li><li>Olmedo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+lymph+node+ultrasound+prior+to+sentinel+lymph+node+biopsy+in+384+patients+with+melanoma:+a+cost-effectiveness+analysis.">Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis.</a> Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).</li><li>Voit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+morphology+criteria+predict+metastatic+disease+of+the+sentinel+nodes+in+patients+with+melanoma.">Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).</li><li>Hayes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+cohort+study+of+ultrasound+surveillance+of+regional+lymph+nodes+in+patients+with+intermediate-risk+cutaneous+melanoma.">Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma.</a> British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).</li><li>Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ultrasound+surveillance+of+lymph+nodes+following+lymphoscintigraphy+without+sentinel+node+biopsy:+a+useful+and+safe+strategy+in+elderly+or+frail+melanoma+patients.">Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients.</a> Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).</li><li>Jayapal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+between+benign+and+metastatic+cervical+lymph+nodes+using+ultrasound.">Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, 338-346 (2019).</li><li>Dankort, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Braf(V600E)+cooperates+with+Pten+loss+to+induce+metastatic+melanoma.">Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma.</a> Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).</li><li>Damsky, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-catenin+signaling+controls+metastasis+in+Braf-activated+Pten-deficient+melanomas.">&#946;-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas.</a> Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).</li><li>Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg7+overcomes+senescence+and+promotes+growth+of+BrafV600E-driven+melanoma.">Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma.</a> Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).</li><li>Kohler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cutaneous+melanoma+induced+by+mutant+BRaf+arises+from+expansion+and+dedifferentiation+of+mature+pigmented+melanocytes.">Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).</li><li>Yuan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenformin+enhances+the+therapeutic+benefit+of+BRAF(V600E)+inhibition+in+melanoma.">Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).</li><li>Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+AKT+dependency+displayed+by+mouse+models+of+BRAFV600E-initiated+melanoma.">Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).</li><li>Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+BRAFV600E+in+an+inducible+murine+model+of+melanoma.">Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma.</a> American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).</li><li>Steinberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+inhibition+alleviates+immune+suppression+in+murine+autochthonous+melanoma.">BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma.</a> Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).</li><li>Vitiello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumoral+effects+of+attenuated+Listeria+monocytogenes+in+a+genetically+engineered+mouse+model+of+melanoma.">Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma.</a> Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).</li><li>Moon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocyte+stem+cell+activation+and+translocation+initiate+cutaneous+melanoma+in+response+to+UV+exposure.">Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).</li><li>Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+2-and+3-dimensional+assessment+of+tumor+volume+and+vascular+density+by+ultrasonography+in+a+transgenic+mouse+model+of+mammary+carcinoma.">Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma.</a> Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).</li></ol>

Los datos obtenidos en este estudio atestiguan la capacidad de las imágenes ecográficas para monitorizar la afectación metastásica de los ganglios linfáticos inguinales del modelo de ratón Braf/Pten de melanoma metastásico. Como se ha demostrado anteriormente16, esta técnica es especialmente útil para evaluar la eficacia del tratamiento farmacológico. Esto se debe a que permite el seguimiento del cambio en el volumen de los ganglios linfáticos en un mismo animal a lo largo del tiempo, c...

El melanoma es una forma agresiva de cáncer de piel que a menudo se disemina a otros sitios de la piel (metástasis subcutáneas), así como a los ganglios linfáticos, los pulmones, el hígado, el cerebro y los huesos1. En la última década, se han introducido nuevos fármacos en la práctica clínica y han contribuido a mejorar la esperanza de vida de los pacientes con melanoma metastásico. Sin embargo, persisten limitaciones, incluyendo el tiempo variable y el grado de respuesta, los efectos secundarios graves y la insurgencia de la resistencia adquirida1. Por lo tanto, es crucial detectar la propagación metastásica en sus primeras etapas, es decir, cuando llega a los ganglios linfáticos locales.
Por lo general, se realiza una biopsia de los ganglios linfáticos locales (ganglios linfáticos centinela) para verificar la presencia de células de melanoma. Sin embargo, la ecografía se está afianzando como un método no invasivo para detectar la afectación metastásica, ya que supera la evaluación clínica y puede ayudar a evitar una biopsia innecesaria2,3,4. Además, la ecografía parece apropiada para la vigilancia de los ganglios linfáticos, especialmente en el caso de edad avanzada y/o comorbilidades5,6. Las características que se detectan mediante ecografía y permiten la diferenciación entre ganglios linfáticos normales y metastásicos comprenden aumento de tamaño (volumen), cambio de forma de ovalado a redondo, margen irregular, patrón ecogénico alterado y vascularización alterada (aumentada)7.
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox ratones genéticamente modificados (ratones Braf/Pten) se han puesto recientemente a disposición de la comunidad científica como un modelo tisular específico e inducible para el melanoma metastásico8. En este modelo animal, los tumores primarios se desarrollan muy rápidamente: se hacen visibles dentro de las 2-3 semanas posteriores a la inducción del cambio de Braf de tipo salvaje (wt) a BrafV600E y de la pérdida de Pten, mientras que alcanzan un volumen de 50-100 mm3 en 4 semanas. En las siguientes 2 semanas, el crecimiento del tumor primario se acompaña de un aumento progresivo de la carga metastásica en otros sitios de la piel, ganglios linfáticos y pulmones.
Los ratones Braf/Pten han sido ampliamente utilizados para múltiples propósitos, incluyendo la disección de vías de señalización implicadas en la melanomagénesis9,10, la identificación de células de melanoma de origen11,12,13 y la prueba de nuevas opciones terapéuticas tanto en términos de terapia dirigida como de inmunoterapia8,14,15,16 . Específicamente, utilizamos ratones Braf / Pten para demostrar que Listeria monocytogenes atenuada (Lmat) funciona como una vacuna contra el melanoma. Cuando se administra sistémicamente en el entorno terapéutico, Lmat no se asocia con toxicidad general, ya que se acumula selectivamente en los sitios tumorales. Además, causa una disminución notable en la masa de melanoma primario y una reducción en la carga metastásica en los ganglios linfáticos y los pulmones. A nivel molecular, Lmat provoca la muerte apoptótica de las células de melanoma, que se debe, al menos en parte, a actividades no autónomas celulares (reclutamiento in situ de linfocitos T CD4+ y CD8+)16.
Cuando se utilizan ratones Braf/Pten para el modelado de melanoma, el crecimiento de tumores primarios y metástasis subcutáneas se puede monitorear mediante mediciones de calibradores. Sin embargo, la afectación de los ganglios linfáticos y los pulmones debe investigarse utilizando una técnica alternativa, posiblemente una no invasiva que permita a los investigadores seguir al mismo animal a lo largo del tiempo. En este trabajo se describe el uso de la ecografía (Figura 1), junto con un posterior análisis volumétrico 3D de los datos obtenidos, para la monitorización longitudinal del aumento de tamaño (volumen) de los ganglios linfáticos inguinales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-hydroxytamoxifen</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H6278</td>
			<td>drug used for tumor induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>013590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blu gel</td>
			<td>Sooft Ialia</td>
			<td></td>
			<td>ophthalmic solution gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAFV600E antibody</td>
			<td>Spring Bioscience Corporation</td>
			<td>E19290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo (isoflorane)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>liquid for gaseous anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLANA antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M2-7C10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma gel</td>
			<td>Parker</td>
			<td></td>
			<td>electrode gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transonic gel clear</td>
			<td>Telic SAU</td>
			<td></td>
			<td>ultrasound gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veet</td>
			<td>Reckitt Benckiser IT</td>
			<td></td>
			<td>depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Dual Anesthesia System</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MX550S</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td>
			<td></td>
			<td>UHFUS linear probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 3100</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td>
			<td></td>
			<td>UHFUS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Imaging Station</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td>
			<td></td>
			<td>UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Lab</td>
			<td>Fujifilm, Visualsonics Inc.</td>
			<td></td>
			<td>software platform for ultrasound image post-processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of lymph node volume by ultra-high-frequency ultrasound imaging in the braf/pten genetically engineered mouse model of melanoma

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox ratones genéticamente modificados (ratones Braf/Pten) son ampliamente utilizados como modelo in vivo de melanoma metastásico. Una vez que un tumor primario ha sido inducido por el tratamiento con tamoxifeno, se observa un aumento en la carga metastásica dentro de las 4-6 semanas posteriores a la inducción. Este artículo muestra cómo las imágenes de Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) pueden ser explotadas para monitorear el aumento en la afectación metastásica de los ganglios linfáticos inguinales midiendo el aumento en su volumen.
El sistema UHFUS se utiliza para escanear ratones anestesiados con una sonda lineal UHFUS (22-55 MHz, resolución axial 40 μm). Las imágenes en modo B de los ganglios linfáticos inguinales (tanto del lado izquierdo como del derecho) se adquieren en una vista de eje corto, posicionando a los animales en reclinación dorsal. Los registros de ultrasonido se adquieren utilizando un tamaño de paso de 44 μm en un brazo mecánico motorizado. Posteriormente, las adquisiciones bidimensionales (2D) en modo B se importan a la plataforma de software para el posprocesamiento de imágenes de ultrasonido, y los ganglios linfáticos inguinales se identifican y segmentan de forma semiautomática en las imágenes 2D transversales adquiridas. Finalmente, se obtiene automáticamente una reconstrucción total del volumen tridimensional (3D) junto con la representación del volumen de los ganglios linfáticos, que también se expresa como una medición absoluta.
Esta técnica in vivo no invasiva es muy bien tolerada y permite la programación de múltiples sesiones de imagen en el mismo animal experimental durante 2 semanas. Por lo tanto, es ideal evaluar el impacto del tratamiento farmacológico en la enfermedad metastásica.

Después de la pintura de la piel de los ratones Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox con 4-HT, se induce la actividad de Cre, debido a que hay un cambio a nivel genómico de wt Braf a BrafV600E, mientras que Pten se pierde (Figura 3A). En 2-3 semanas, los ratones desarrollan tumores primarios en el sitio con una penetrancia del 100%. Después de cuatro semanas desde el tratamiento con 4-HT (t0), los tumores primarios alcanzan un volumen de 50-1...

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Analysis of Lymph Node Volume by Ultra-High-Frequency Ultrasound Imaging in the Braf/Pten Genetically Engineered Mouse Model of Melanoma

El melanoma es una enfermedad muy agresiva que se propaga rápidamente a otros órganos. Este protocolo describe la aplicación de imágenes de ultrasonido de frecuencia ultra alta, junto con la representación 3D, para monitorear el volumen de los ganglios linfáticos inguinales en el modelo de ratón Braf / Pten de melanoma metastásico.

Análisis del volumen de los ganglios linfáticos mediante imágenes de ultrasonido de frecuencia ultra alta en el modelo de melanoma de ratón genéticamente modificado braf/pten

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;genetically engineered mice (Braf/Pten mice) are widely used as an in vivo model of metastatic melanoma. Once a ...

Nuestro método permite monitorizar el aumento de la afectación metastásica de los ganglios linfáticos inguinales midiendo el aumento de su volumen. Este método no invasivo es muy bien tolerado, por lo tanto, se pueden programar múltiples sesiones de imágenes en el mismo animal experimental en el transcurso de dos semanas. Este método es ideal para evaluar el impacto del tratamiento farmacológico en la enfermedad metastásica.Aplicamos este método al modelo de melanoma braf/pten, pero en principio, se puede adaptar para evaluar la eficacia de varios fármacos en una variedad de modelos preclínicos de cáncer metastásico en ratones. Marianna Vitiello, una post-doc de mi laboratorio, y la Dra. Claudia Kusmic, investigadora del IFC-CNR. Para la inducción del melanoma, aplique tres microlitros de 4-hidroxitamoxifeno cinco milimolares sobre aproximadamente un centímetro cuadrado de piel afeitada de la parte superior de la espalda durante tres días seguidos.Seis semanas después de la pintura de la piel, use pinzas para medir el volumen del tumor primario y, finalmente, de las metástasis subcutáneas. Luego, use imágenes de ultrasonido para medir el volumen de los ganglios linfáticos inguinales. Después de analizar el tumor primario y los ganglios linfáticos mediante inspección visual, extirparlos para estudios histológicos.Después de confirmar la anestesia, transfiera al animal a una tabla calentada de la estación de imágenes de ultrasonido de frecuencia ultra alta, manteniendo al animal en posición supina. Ajuste la temperatura de la placa con una sonda rectal lubricada con vaselina para mantener la temperatura corporal del ratón en el rango fisiológico. Cubra las patas delanteras y traseras con pasta conductora y péguelas con cinta adhesiva a los electrodos de la placa de ECG incrustados en la placa.Compruebe que los parámetros fisiológicos se adquieren y muestran correctamente. Eliminar el vello de ambas zonas inguinales aplicando un agente depilatorio y recubrirlas con un medio de acoplamiento acústico. Luego, sujete la sonda lineal de ultrasonido de frecuencia ultra alta en un motor 3D especializado integrado en la estación de imágenes, lo que permite el movimiento automatizado y paso a paso de la sonda.Orientar y ajustar adecuadamente la posición de la sonda de ultrasonido para obtener imágenes de acceso corto del ganglio linfático inguinal, y colocar la región de interés en la zona focal. Establezca la distancia de escaneo entre dos y cinco milímetros, el tamaño del paso a 44 micrómetros con un resultado de 46 a 114 pasos de escaneo por corte de ganglio linfático y un tiempo de adquisición de uno a tres minutos por animal. Escanee todo el volumen del ganglio linfático inguinal como una secuencia de imágenes 2D en modo B, adquiriendo imágenes a múltiples niveles mediante el movimiento lineal del transductor con tamaños de paso a escala micrométrica para generar datos 3D en términos de respiración y bucles de cine activados cardíacos.Después de la obtención de imágenes, almacene digitalmente las imágenes adquiridas en formato RAW para realizar más análisis fuera de línea. Para el posprocesamiento de imágenes de ultrasonido, abra el conjunto de datos de las imágenes de ganglios linfáticos inguinales 3D, seleccione el método de corte múltiple y presione el botón Inicio para visualizar tanto los fotogramas actuales como las miniaturas de todos los fotogramas correspondientes a cada imagen capturada durante la adquisición 3D. Seleccione la miniatura del primer fotograma donde el ganglio linfático es evidente para cargarlo en la vista de contorno.En la vista de contorno, haga clic con el botón izquierdo del mouse para colocar puntos a lo largo del borde del ganglio linfático. Una vez que se haya establecido el número deseado de puntos, lama derecha para completar el contorno. Una vez completado el primer contorno, utilice la vista en miniatura para seleccionar la siguiente imagen para el contorno.Si es necesario, omita varias imágenes entre contornos para reducir el número de rastros manuales necesarios para cada volumen 3D. Repita este proceso hasta que se haya delineado todo el volumen, luego, haga clic en Finalizar. Mientras esté en el espacio de trabajo de la ventana de modo 3D, haga clic en el icono de medición de volumen debajo del área de visualización de la imagen para visualizar el valor numérico del volumen de los ganglios linfáticos y active la vista de superficie con la representación 3D del volumen de los ganglios linfáticos.El tratamiento de ratones con 4-hidroxitamoxifeno induce la actividad de la enzima CreER, causando un cambio a nivel genómico de Braf de tipo salvaje a Braf V600E mutado, mientras que Pten se pierde. Cuatro semanas después del tratamiento con 4-hidroxitamoxifeno, los tumores primarios alcanzan un volumen de 50 a 100 milímetros cúbicos y su crecimiento puede medirse con pinzas durante dos semanas adicionales, mostrando así un aumento gradual de la pigmentación observada en los ganglios linfáticos inguinales. Los depósitos de melanina se deben invariablemente a la presencia de células de melanoma metastásicas, como lo confirma la tinción inmunohistoquímica del antígeno del melanoma MelanA y Braf V600E.Al final de la fase de segmentación, todas las secciones mostraron la superposición del contorno externo del ganglio linfático. Las representaciones 3D de un ganglio linfático inguinal derecho, analizadas a las cuatro, cinco y seis semanas después del tratamiento con 4-HT se muestran aquí. También se cuantificó el aumento de volumen de los ganglios linfáticos inguinales izquierdo y derecho del mismo animal a lo largo del tiempo.Se recomienda combinar las imágenes de ultrasonido con la tinción inmunohistoquímica adecuada, de modo que se confirme la presencia de células cancerosas a nivel molecular. Además de los ganglios linfáticos, el volumen de metástasis subcutáneas también se puede controlar a lo largo del tiempo mediante imágenes de ultrasonido. Si el período de dos semanas es demasiado corto para apreciar los efectos del fármaco en estudio, seleccione un sitio de inducción más periférico o un genotipo menos propenso a tumores.

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