Name: three differential expression analysis methods for rna sequencing: limma, edger, deseq2
Uploaded: 2021-09-18T14:00:00
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这项工作得到了中国国家自然科学基金（81860276号赠款）和国家重点研发计划重点专项资金项目（2018YFC1003200号赠款）的支持。

注：打开 R 工作室程序并加载 R 文件"DEGs.R"，该文件可以从补充文件/脚本中获取。
1. 数据的下载和预处理
<ol><li>从癌症基因组图集 （TCGA） 下载胆管癌 （CHOL） 的高通量测序 （HTSeq） 计数数据。此步骤可以通过以下 R 代码轻松实现。<ol>
<li>单击 "运行" 以安装 R 包。</li>
		<li>单击 "运行" 以加载 R 包。 如果 （！ 需要命名空间 （"生物经理"， 悄悄?...

<ol>
	<li>Tambonis, T., Boareto, M., Leite, V. B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Expression+Analysis+in+RNA-seq+Data+Using+a+Geometric+Approach.">Differential Expression Analysis in RNA-seq Data Using a Geometric Approach.</a> Journal of Computational Biology. 25, 1257-1265 (2018).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews. 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丰富的癌症异常记录可以通过RNA-seq差分分析5轻松识别。但是，RNA-seq 差分表达分析的应用往往受到限制，因为它需要具有某些 R 语言技能和选择适当方法的能力。为了解决这个问题，我们提供了三种最已知的方法（limma、EdgeR 和 DESeq2）的详细介绍，以及应用 RNA-seq 差分表达分析的教程。这将促进理解所有三种方法的相似性和差异，使选择适合单个数据的方法，并使我们能够了解...

RNA测序（RNA-seq）是转录学中应用最广泛的技术之一，具有许多优点（例如，高数据可重复性），并极大地增进了我们对复杂生物过程1、2的功能和动力学的理解。在不同的生物背景下识别异常记录（也称为微分表达基因 ）是RNA-seq分析的关键步骤。RNA-seq 使深入了解发病机制相关的分子机制和生物功能成为可能。因此，差异分析被认为是有价值的诊断，预后和治疗肿瘤3，4，5。目前，更多的开源R/生物导体包已经开发为RNA-seq差分表达分析，特别是利马，DESeq2和EdgeR 1，6，7。然而，差异分析需要一定的R语言技能和选择适当方法的能力，这是医学教育课程所缺乏的。
在本协议中，根据从癌症基因组图集 （TCGA） 中提取的胆管癌 （CHOL） RNA-seq 计数数据，R 程序11分别执行了三种最已知的方法（limma8、EdgeR9和 DESeq210），以确定 CHOL 和正常组织之间的 DEG。伽马、EdgeR 和 DESeq2 的三种方案相似，但在分析过程中有不同的步骤。例如，EdgeR 和 limma8、9需要规范化的 RNA-seq 计数数据，而 DESeq2 则使用自己的库差异来更正数据，而不是校正10。此外，edgeR 特别适用于 RNA-seq 数据，而 limma 则用于微阵列和 RNA-seq。Limma 采用线性模型来评估 DEG12，而 edgeR 中的统计数据基于负二元分布，包括经验贝叶估计、精确测试、通用线性模型和准可能性测试9。
总之，我们分别使用 limma、DESeq2 和 EdgeR 提供 RNA-seq 差分表达分析的详细协议。通过引用本文，用户可以轻松地执行 RNA-seq 差分分析，并为其数据选择适当的差分分析方法。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td>version 3.6.2</td>
			<td>free software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>free software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three differential expression analysis methods for rna sequencing: limma, edger, deseq2

RNA测序（RNA-seq）是转录学中最广泛使用的技术之一，因为它可以揭示基因改变与复杂的生物过程之间的关系，在肿瘤的诊断、预后和治疗方面具有重要价值。RNA-seq 数据的微分分析对于识别异常转录至关重要，而 limma、EdgeR 和 DESeq2 是微分分析的有效工具。然而，RNA-seq差异分析需要一定的R语言技能和选择适当方法的能力，这是医学教育课程所缺乏的。
在此，我们提供详细的协议，以确定胆管癌 （CHOL） 和正常组织之间通过伽马， DESeq2 和 EdgeR 的差异表达基因 （DEG）， 结果在火山地块和维恩图中显示。伽马、DESeq2 和 EdgeR 这三种方案相似，但在分析过程中有不同的步骤。例如，线性模型用于伽马体的统计，而负二元分布用于边缘R和DESeq2。此外，正常化的RNA-seq计数数据对于 EdgeR 和 limma 是必要的，但对于 DESeq2 来说不是必要的。
在这里，我们为三种微分分析方法提供了详细的协议：伽利马、EdgeR 和 DESeq2。这三种方法的结果是部分重叠的。这三种方法都有各自的优势，方法的选择只取决于数据。

有各种方法可视化差异表达分析的结果，其中火山图和维恩图特别使用。利马用|logFC|≥2和adj识别了 CHOL 和正常组织之间的 3323 个 DEG。P.Val<0.05作为阈值，其中1880个在CHOL组织中被降低调节，1443个被调高（图1a）。同时，EdgeR 确定了 1578 个下监管 DEG 和 3121 个向上监管的 DEG（图 1b）：DESeq2 确定了 1616 个下行监管的 DEG 和 2938 个向上监管的 DEG（<strong class="...

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Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

提供了RNA测序的微分表达分析方法的详细协议：伽利马、EdgeR、DESeq2。

RNA 测序的三种微分表达分析方法：利马、边缘、DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...

RNA 测序的三种差分表达分析方法：利玛、EdgeR 和 DESeq2。打开 RStudio 程序，然后加载 R 文件、DEG。该文件可以从补充文件中获取。一。数据的下载和预处理。从癌症基因组图集下载胆管癌的高通量测序计数数据。此选项卡可以通过以下代码轻松实现。单击"运行"以安装 R 包。单击运行以加载 R 包。设置工作目录。选择癌症类型。从 GDCquery 文件中运行 R 代码以下载数据。文件 GDCquery 可以从补充文件/脚本中获取。执行后，可下载并命名 CNT，其中行表示合奏基因 ID，列代表符号 ID。请注意符号 ID 中第 14 到 15 个位置的数字。数字范围从01到09表示肿瘤，10到19表示正常组织。将组合基因 ID 与基因符号的对话。根据其存储路径将注释文件导入 R 中。注释文件可以从补充文件中获取。从 gtf v22 文件中运行 R 代码。可以从补充文件/脚本中获取。应用"功能"功能，将合奏基因 ID 转换为基因符号。过滤低表达基因。单击运行以安装包边缘R"点击运行加载 R 包边缘"运行遵循 R 代码，以保持基因与计数每百万值大于一个至少两个样本。二。通过 limma"点击运行以安装 R 包 limma""点击运行以加载 R 包 limma"edgeR"运行以下 R 代码以创建设计矩阵的差分表达分析。提取组信息。设置 01"作为肿瘤组织。设置 11"作为正常组织。创建设计矩阵。创建 DGE 列表对象。使数据正常化。运行以下 R 代码以执行基于利马趋势方法的差分表达分析。计算 CPM 值。单击"运行"以适合线性模型以预测数据或推断变量之间的关系。根据贝叶斯计算 T 值、F 值和日志赔率。提取结果表。差分表达分析的结果保存在res_limma"，其中包括日志2折变值。实验中基因的平均日志2表达水平。修改后的T统计、P值、误发现率修正了p值和微分表达基因的日志奇数。识别不同表达的基因。因此，调整后的P值小于0.05，而日志假变化大于或等于两个的绝对值是筛选差异表达基因的阈值。研究结果显示，与正常组织相比，1443个基因被向上调节，1880个基因在胆癌组织中处于下调节状态。将结果表输出到文件。单击运行以安装 R 包 ggplot2"单击运行以加载 R 包 ggplot2"从火山文件中运行 R 代码以创建火山图，文件火山可以从补充文件中获取。基因可以根据其日志2折叠变化和调整的P值映射到不同的位置。因此，受调节的微分表达基因以红色着色。和向下调节的微分表达基因是绿色的。点击出口"，以挽救火山情节。三。通过 edgeR 进行差分表达分析"点击运行以加载 R 包边缘"运行以下 R 代码以创建设计矩阵。单击"运行"创建 DGEList 对象并使数据正常化。单击"运行"以估计基因表达值的分散性。单击"运行"以适合模型以计数数据。进行统计测试。提取结果表。结果保存在 res edgeR 中"，其中包括日志折叠更改值、日志CPM、F、p 值和错误发现率更正 p 值。识别不同表达的基因。结果res edgeR"显示，与正常组织相比，3，121个基因被向上调节，1，578个基因在胆管癌组织中处于下调节状态。将结果表输出到文件。创建火山图。单击出口以保存火山地块。四。通过 DESeq2 进行差异表达分析。单击"运行"以安装 R 包 DESeq2""单击运行以加载 R 包 DESeq2"运行以下 R 代码以确定摸索因子。创建 DESeq2 数据集对象。执行分析。生成结果表。结果保存在 res DESeq2 中，其中包括规范化读数的均值、日志折叠更改值、日志折叠更改标准箭头、焊接统计、原始 P 值和更正 P 值。识别 DEG。DESeq2的结果表明，与正常组织相比，二千九百三十八个基因被向上调节，一千六百一十六个基因在胆癌组织中被降低调节。将结果表输出到文件。创建火山图。单击出口以保存火山地块。五。维恩图。单击"运行"以安装 R 包文尼图。单击"运行"以加载 R 包文尼图。制作一个向上调节的微分表达基因的静脉图。单击导出以保存面包车图，制作下调节的微分表达基因的静脉图。单击导出以保存静脉图。六。代表结果。图一显示了由伽马、边缘和DESeq2获得的所有基因的火山图谱。负日志 p 值根据日志折叠更改绘制。红点表示向上调节的微分表达基因，绿点表示向下调节的微分表达基因。Limma 识别了一千八百八十个向下调节的微分表达基因，以及一千四百四十三个向上调节的微分表达基因在胆管癌组织中。EdgeR 识别一千五百七十八个向下调节的微分表达基因，以及三千一百二十一个向上调节的微分表达基因。DESeq2 识别一千六百一十六个向下调节的微分表达基因，以及二千九百三十八个向上调节的微分表达基因。图二，静脉图显示从利马边缘和DESeq2分隔的结果之间重叠。比较这三种方法的结果，一千四百三十一个向上调节的微分表达基因和一千五百三十一个向下调节的微分表达基因是重叠的。七.结论。在此协议中，我们使用 R 包、limma、边缘和 DESeq2 为高排序计数数据提供了不同类型的测量分析的详细协议。三种方法具有相似性，工作人员在分析过程中也有类似情况。然后，他们从这三种药物是部分重叠。这三种药物都有各自的优势。选择只是取决于数据的时间。如果有我目前的数据，应该优先考虑 limma，但优先选择 edgeR 和 DESeq2 中的生成测序数据。

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