Name: three differential expression analysis methods for rna sequencing: limma, edger, deseq2
Uploaded: 2021-09-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2 at JoVE.com

この研究は、中国国立自然科学財団(グラント第81860276)と国家主要研究開発プログラム(グラント2018YFC1003200)の主要特別基金プロジェクトによって支援されました。

注:R-studioプログラムを開き、Rファイル"DEGs.R"をロードし、ファイルは補助ファイル/スクリプトから取得することができます。
1. データのダウンロードと前処理
<ol><li>がんゲノムアトラス(TCGA)からコリンジオカルシノーマ(CHOL)のハイスループットシーケンシング(HTSeq)カウントデータをダウンロードしてください。このステップは、次の R コードで簡単に実現できます。<...

<ol>
	<li>Tambonis, T., Boareto, M., Leite, V. B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Expression+Analysis+in+RNA-seq+Data+Using+a+Geometric+Approach.">Differential Expression Analysis in RNA-seq Data Using a Geometric Approach.</a> Journal of Computational Biology. 25, 1257-1265 (2018).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews. Genetics. 10, 57-63 (2009).</li><li>Anders, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Count-based+differential+expression+analysis+of+RNA+sequencing+data+using+R+and+Bioconductor.">Count-based differential expression analysis of RNA sequencing data using R and Bioconductor.</a> Nature Protocols. 8, 1765-1786 (2013).</li><li>McDermaid, A., Monier, B., Zhao, J., Liu, B., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+differential+gene+expression+results+of+RNA-seq+data:+review+and+integration.">Interpretation of differential gene expression results of RNA-seq data: review and integration.</a> Briefings in Bioinformatics. 20, 2044-2054 (2019).</li><li>Costa-Silva, J., Domingues, D., Lopes, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+differential+expression+analysis:+An+extended+review+and+a+software+tool.">RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool.</a> PloS One. 12, 0190152 (2017).</li><li>Law, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+analysis+is+easy+as+1-2-3+with+limma,+Glimma+and+edgeR.">RNA-seq analysis is easy as 1-2-3 with limma, Glimma and edgeR.</a> F1000Research. 5, (2016).</li><li>Varet, H., Brillet-Gu&#233;guen, L., Copp&#233;e, J. Y., Dillies, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARTools:+A+DESeq2-+and+EdgeR-Based+R+Pipeline+for+Comprehensive+Differential+Analysis+of+RNA-Seq+Data.">SARTools: A DESeq2- and EdgeR-Based R Pipeline for Comprehensive Differential Analysis of RNA-Seq Data.</a> PloS One. 11, 0157022 (2016).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43, 47 (2015).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26, 139-140 (2010).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15, 550 (2014).</li><li>Gentleman, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioconductor:+open+software+development+for+computational+biology+and+bioinformatics.">Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics.</a> Genome Biology. 5, 80 (2004).</li><li>Law, C. W., Chen, Y., Shi, W., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=voom:+Precision+weights+unlock+linear+model+analysis+tools+for+RNA-seq+read+counts.">voom: Precision weights unlock linear model analysis tools for RNA-seq read counts.</a> Genome Biology. 15, 29 (2014).</li><li>Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+models+and+empirical+bayes+methods+for+assessing+differential+expression+in+microarray+experiments.">Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 3, (2004).</li><li>Lund, S. P., Nettleton, D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+differential+expression+in+RNA-sequence+data+using+quasi-likelihood+with+shrunken+dispersion+estimates.">Detecting differential expression in RNA-sequence data using quasi-likelihood with shrunken dispersion estimates.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 11, (2012).</li><li>Reeb, P. D., Steibel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+statistical+analysis+models+for+RNA+sequencing+experiments.">Evaluating statistical analysis models for RNA sequencing experiments.</a> Frontiers in Genetics. 4, 178 (2013).</li><li>Rocke, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+False+Positive+Rates+in+Methods+for+Differential+Gene+Expression+Analysis+using+RNA-Seq+Data.">Excess False Positive Rates in Methods for Differential Gene Expression Analysis using RNA-Seq Data.</a> bioRxiv. , (2015).</li><li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+and+calibration+of+transcriptome+data+from+RNA-Seq+and+tiling+arrays.">Comparison and calibration of transcriptome data from RNA-Seq and tiling arrays.</a> BMC genomics. 11, 383 (2010).</li><li>Leng, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EBSeq:+an+empirical+Bayes+hierarchical+model+for+inference+in+RNA-seq+experiments.">EBSeq: an empirical Bayes hierarchical model for inference in RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 29, 1035-1043 (2013).</li></ol>

癌における豊富な異常性転写物は、RNA-seq差動分析5によって容易に同定することができる。しかし、RNA-seq微分発現解析の適用は、R言語と適切な方法を選択する能力を持つ特定のスキルを必要とするため、しばしば制限されています。この問題に対処するために、我々は、3つの最も知られている方法(リンマ、EdgeRおよびDESeq2)とRNA-seqの微分発現解析を適用するためのチュート...

RNA-シーケンシング(RNA-seq)は、多くの利点(例えば、高いデータ再現性)を有するトランスクリプトミクスで最も広く使用されている技術の1つであり、複雑な生物学的プロセス1,2の機能とダイナミクスについての理解を劇的に高めています。異なる生物学的文脈下での異常転写物の同定は、RNA-seq分析の重要なステップである。RNA-seqは、病因と関連する分子機構と生物学的機能を深く理解することを可能にします。したがって、微分分析は、腫瘍3、4、5の診断、予後および治療に対して価値があると考えられてきた。現在、RNA-seqの微分発現解析、特にリンマ、DESeq2およびEdgeR1、6、7のために、よりオープンソースのR/バイオ伝導体パッケージが開発されている。しかし、差分分析には、R言語を持つ特定のスキルと、医学教育のカリキュラムに欠けている適切な方法を選択する能力が必要です。
このプロトコルでは、がんゲノムアトラス(TCGA)から抽出された胆管癌(CHOL)RNA-seqカウントデータに基づいて、最も知られた方法の3つ(リンマ8、EdgeR9およびDESeq210)を、それぞれRプログラム11によって実施し、CHOLと正常組織との間のDEGsを同定した。リンマ、EdgeR、DESeq2の3つのプロトコルは似ていますが、分析のプロセス間で異なるステップがあります。例えば、正規化された RNA-seq カウントデータは、EdgeR および limma8,9に必要ですが、DESeq2 は独自のライブラリーの不一致を使用して、正規化10ではなくデータを修正します。さらに、edgeRはRNA-seqデータに特に適しており、リムマはマイクロアレイおよびRNA-seqに使用されます。線形モデルは、DEG12を評価するためにlimmaによって採用され、edgeRの統計は経験的ベイズ推定、正確なテスト、一般化線形モデルおよび準尤度検定を含む負の二項分布に基づいている。
要約すると、それぞれリンマ、DESeq2、EdgeRを用いたRNA-seq微分発現解析の詳細なプロトコルを提供します。この記事を参照することにより、ユーザーは簡単にRNA-seqの微分分析を行い、データに適切な微分分析方法を選択することができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td>version 3.6.2</td>
			<td>free software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>free software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three differential expression analysis methods for rna sequencing: limma, edger, deseq2

RNAシーケンシング(RNA-seq)は、遺伝子改変と複雑な生物学的プロセスとの関係を明らかにし、腫瘍の診断、予後、および治療に大きな価値を持つため、トランスクリプトミクスで最も広く使用されている技術の1つです。RNA-seqデータの微分分析は異常転写を同定するために非常に重要であり、リンマ、EdgeRおよびDESeq2は微分分析のための効率的なツールである。しかし、RNA-seq微分解析には、R言語を持つ特定のスキルと、医学教育のカリキュラムに欠けている適切な方法を選択する能力が必要です。
本明細書において、リンマ、DESeq2およびEdgeRを介して、脈管癌(CHOL)と正常組織の間で、それぞれ微分発現遺伝子(DEG)を同定するための詳細なプロトコルを提供し、その結果は火山プロットおよびベン図に示される。リンマ、DESeq2およびEdgeRの3つのプロトコルは類似しているが、分析のプロセス間で異なったステップを有する。たとえば、線形モデルは limma の統計に使用され、負の二項分布は edgeR および DESeq2 で使用されます。さらに、正規化された RNA-seq カウント データは、EdgeR と limma に必要ですが、DESeq2 には必要ありません。
ここでは、リンマ、EdgeR、DESeq2の3つの差分解析方法の詳細なプロトコルを提供します。3つの方法の結果は部分的に重なっています。3 つのメソッドには独自の利点があり、メソッドの選択はデータのみに依存します。

火山プロットとベン図が特に使用されている微分表現解析の結果を可視化するための様々なアプローチがあります。リンマは、cholと正常組織の間の3323 AGを|logFC|≥2およびadjで同定した。P.Val <0.05 しきい値として、その中で1880はCHOL組織でダウンレギュレートされ、1443 はアップレギュレートされた (図 1a)。一方、edgeR は 1578 のダウンレギュレーション DEG と 3121 のアップ...

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Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

RNAシーケンシングの微分発現解析方法の詳細なプロトコルが提供されました: リンマ, エッジ, DESeq2.

RNAシーケンシング用の3つの微分発現解析方法:リンマ、エッジャー、DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...

RNAシーケンシングの3つの微分発現解析方法:リンマ、エッジ、DESeq2。RStudio プログラムを開き、R ファイル DEG をロードします。ファイルは補助ファイルから取得できます。1。データのダウンロードと前処理.1.1.がんゲノムアトラスから、胆管癌のハイスループットシーケンシングカウントデータをダウンロードします。このタブは、次のコードで簡単に実行できます。[実行] をクリックして R パッケージをインストールします。[実行] をクリックして R パッケージを読み込みます。作業ディレクトリを設定します。がんの種類を選択します。GDCquery ファイルから R コードを実行して、データをダウンロードします。ファイル GDCquery は補助ファイル/スクリプトから取得できます。実行後、コリンジオカルシノマRNAシーケンシングカウントデータをダウンロードしてCNTと名付けることができ、行はアンサンブル遺伝子IDを表し、カラムはシンボルIDを表します。シンボル ID の 14 ~ 15 桁目の数字に注意してください。01から09の範囲の範囲は腫瘍を示し、10〜19は正常組織を示す。遺伝子シンボルに対するアンサンブル遺伝子IDの会話。注釈ファイルを R にインポートします(そのストレージ パスに従って)。注釈ファイルは、補助ファイルから取得できます。gtf v22 ファイルから R コードを実行します。補助ファイル/スクリプトから取得できます。イン"機能を適用し、アンサンブル遺伝子IDを遺伝子シンボルに変換します。低発現遺伝子をフィルター処理します。パッケージ edgeR をインストールするクリックして実行する R パッケージ edgeR"次の R コードを実行して、少なくとも 2 つのサンプルの 1 より大きい 100 万個あたりの値を持つ遺伝子を保持します。2。limmaを介した微分式分析「Rパッケージリンマをインストールするには実行をクリックしてください」「Rパッケージlimma"edgeR"をロードするには、次のRコードを実行して設計マトリックスを作成します。グループ情報を抽出します。01"を腫瘍組織として設定する。11"を正常組織として設定する。設計マトリックスを作成します。DGEList オブジェクトを作成します。データを正規化します。次の R コードを実行して、リンマトレンドメソッドベースの微分式分析を実行します。CPM 値を計算します。[実行]をクリックして線形モデルに適合し、データを予測するか、変数間の関係を推測します。ベイジアンに基づいて T 値、F 値、および対数オッズを計算します。結果表を抽出します。微分式解析の結果は、log2の折り返し変更値を含むres_limma」に保存されます。実験における遺伝子の平均log2発現量。改変されたT統計量、P値、偽発見率がp値を補正し、微分発現遺伝子の対数オッズを補正した。遺伝子の発現を確認します。したがって、調整されたP値が0.05未満、および2以上のログ偽変化の絶対値は、微分発現遺伝子をスクリーニングするための閾値である。結果は、正常組織と比較して、1,443個の遺伝子が上調節され、1,880個の遺伝子がコリンジオカルシノマ組織でダウンレギュレートされていることを示している。結果表をファイルに出力します。Rパッケージggplot2をインストールするには実行をクリックしてRパッケージggplot2"火山ファイルからRコードを実行して火山プロットを作成し、ファイル火山は補助ファイルから取得することができます。遺伝子は、log2の折り返し変化と調整されたP値に従って異なる位置にマッピングすることができます。したがって、アップレギュレートされた微分発現遺伝子は赤色で着色される。下降制御された微分発現遺伝子は緑色で着色されています。「エクスポート」をクリックして火山プロットを保存します。3。edgeRを介した微分式分析「実行をクリックして R パッケージ edgeR をロードする」次の R コードを実行して、設計マトリックスを作成します。[実行] をクリックして DGEList オブジェクトを作成し、データを正規化します。[実行]をクリックして、遺伝子発現値の分散を推定します。[実行] をクリックして、データをカウントするモデルに適合します。統計的検定を実施します。結果表を抽出します。結果は、ログフォールド変更値、logCPM、F、p値、および修正されたp値の偽検出率を含むres edgeRに保存されます。遺伝子の発現を確認します。結果res edgeR」は、正常組織と比較して、3、121個の遺伝子がアップレギュレートされ、1,578遺伝子がコリンジオカルシノ組織でダウンレギュレートされていることを示している。結果表をファイルに出力します。火山プロットを作成します。[エクスポート]をクリックして、火山プロットを保存します。4。DESeq2による微分式解析R パッケージ DESeq2 をインストールするには、[実行] をクリックして R パッケージ DESeq2"次の R コードを実行して、手探り係数を決定します。DESeq2 データ・セット・オブジェクトを作成します。解析を実行します。結果表を生成します。結果は、正規化された読み取り回数の平均、ログフォールド変更値、ログフォールド変更標準矢印、溶接統計量、元のP値、および修正されたP値を含むreseq2に保存されます。DEG を識別します。結果はDESeq2は正常組織と比較すると、2938個の遺伝子がアップレギュレートされ、1,661遺伝子がコリンジオカルマ組織でダウンレギュレートされていることを示している。結果表をファイルに出力します。火山プロットを作成します。[エクスポート]をクリックして、火山プロットを保存します。5。ベン図。[実行] をクリックして、R パッケージのベン図をインストールします。[実行] をクリックして、R パッケージベン図を読み込みます。アップレギュレーションされた微分発現遺伝子のベン図を作成します。バン図を保存するためにエクスポートをクリックし、ダウンレギュレートされた微分発現遺伝子のベン図を作成します。[エクスポート] をクリックしてベン図を保存します。6。代表結果。図1は、リンマ、エッジ、DESeq2によって獲得されたすべての遺伝子の火山プロットを示しています。負の対数 p 値は、ログ折りたたみの変化に対してプロットされます。赤い点は、アップレギュレートされた微分発現遺伝子を表し、緑色の点は、ダウンレギュレートされた差動発現遺伝子を表します。リンマは、遺伝子を1880個のダウンレギュレーションされた差動発現遺伝子と、胆管癌組織における1443個のアップレギュレートされた微分発現遺伝子を同定する。EdgeRは、1578個のダウンレギュレーションされた微分発現遺伝子と、3,000121のアップレギュレートされた微分発現遺伝子を同定します。DESeq2は、1,000611個のダウンレギュレーションされた微分発現遺伝子と、2938個のアップレギュレートされた微分発現遺伝子を同定します。図2は、ベン図は、リンマエッジRとDESeq2からの結果の分裂の間で重複を示す。これら3つの方法、1,000431のアップレギュレートされた微分発現遺伝子と、1,531個のダウンレギュレートされた微分発現遺伝子が重複している結果を比較します。7.結論: このプロトコルでは、R パッケージ、limma、edgeR、および DESeq2 を使用して、カウント データのシーケンスの異なる種類の詳細なプロトコルをここに提供しました。3つの方法は、分析のプロセスの中で同様のスタッフを持っています。そして、これらの3つの薬から部分的に重複しています。3つの薬にはいずれも独自の利点があります。そして、選択はデータの時間に依存します。私の現在のデータがある場合、limmaは優先順位を持って与えられるべきですが、生成シーケンシングデータ、edgeR、およびDESeq2が好ましいです。

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