Name: three differential expression analysis methods for rna sequencing: limma, edger, deseq2
Uploaded: 2021-09-18T14:00:00
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이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(81860276 보조금)과 국가 핵심 R&D 프로그램의 주요 특별 기금 프로젝트(보조금 2018YFC1003200)의 지원을 받았습니다.

참고: R-스튜디오 프로그램을 열고 R 파일 "DEGs.R"을 로드하면 추가 파일/스크립트에서 파일을 얻을 수 있습니다.
1. 데이터 다운로드 및 사전 처리
<ol><li>암 게놈 아틀라스(TCGA)에서 콜린고이오사르키노마(CHOL)의 고처리량 시퀀싱(HTSeq) 카운트 데이터를 다운로드한다. 이 단계는 다음 R 코드로 쉽게 수행할 수 있습니다.<ol>
<li>R 패키지를 설치하려면 실행을 클릭합니?...

<ol>
	<li>Tambonis, T., Boareto, M., Leite, V. B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Expression+Analysis+in+RNA-seq+Data+Using+a+Geometric+Approach.">Differential Expression Analysis in RNA-seq Data Using a Geometric Approach.</a> Journal of Computational Biology. 25, 1257-1265 (2018).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+differential+expression+analysis:+An+extended+review+and+a+software+tool.">RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool.</a> PloS One. 12, 0190152 (2017).</li><li>Law, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+analysis+is+easy+as+1-2-3+with+limma,+Glimma+and+edgeR.">RNA-seq analysis is easy as 1-2-3 with limma, Glimma and edgeR.</a> F1000Research. 5, (2016).</li><li>Varet, H., Brillet-Gu&#233;guen, L., Copp&#233;e, J. Y., Dillies, M. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioconductor:+open+software+development+for+computational+biology+and+bioinformatics.">Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics.</a> Genome Biology. 5, 80 (2004).</li><li>Law, C. W., Chen, Y., Shi, W., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=voom:+Precision+weights+unlock+linear+model+analysis+tools+for+RNA-seq+read+counts.">voom: Precision weights unlock linear model analysis tools for RNA-seq read counts.</a> Genome Biology. 15, 29 (2014).</li><li>Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+models+and+empirical+bayes+methods+for+assessing+differential+expression+in+microarray+experiments.">Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 3, (2004).</li><li>Lund, S. P., Nettleton, D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+differential+expression+in+RNA-sequence+data+using+quasi-likelihood+with+shrunken+dispersion+estimates.">Detecting differential expression in RNA-sequence data using quasi-likelihood with shrunken dispersion estimates.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 11, (2012).</li><li>Reeb, P. D., Steibel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+statistical+analysis+models+for+RNA+sequencing+experiments.">Evaluating statistical analysis models for RNA sequencing experiments.</a> Frontiers in Genetics. 4, 178 (2013).</li><li>Rocke, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+False+Positive+Rates+in+Methods+for+Differential+Gene+Expression+Analysis+using+RNA-Seq+Data.">Excess False Positive Rates in Methods for Differential Gene Expression Analysis using RNA-Seq Data.</a> bioRxiv. , (2015).</li><li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+and+calibration+of+transcriptome+data+from+RNA-Seq+and+tiling+arrays.">Comparison and calibration of transcriptome data from RNA-Seq and tiling arrays.</a> BMC genomics. 11, 383 (2010).</li><li>Leng, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EBSeq:+an+empirical+Bayes+hierarchical+model+for+inference+in+RNA-seq+experiments.">EBSeq: an empirical Bayes hierarchical model for inference in RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 29, 1035-1043 (2013).</li></ol>

암에 있는 풍부한 수차성 전사체는 RNA-seq 차동 분석에 의해 쉽게 확인할 수 있습니다5. 그러나, RNA-seq 차동 발현 분석의 적용은 R 언어와 적절한 방법을 선택할 수 있는 특정 능력을 필요로 하기 때문에 종종 제한됩니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 RNA-seq 차동 발현 분석을 적용하기위한 세 가지 가장 잘 알려진 방법 (limma, EdgeR 및 DESeq2)에 대한 자세한 소개및 자습서를 제공합...

RNA-시퀀싱(RNA-seq)은 많은 장점(예를 들어, 높은 데이터 재현성)을 가진 전사학에서 가장 널리 사용되는 기술 중 하나이며, 복잡한 생물학적 과정의 기능 및 역학에 대한 이해를 크게증가시켰습니다 1,2. 다른 생물학적 맥락에서 비정상적인 전사체의 식별은 또한 분화 유전자 (DEGs)로 알려져 있으며, RNA-seq 분석에서 중요한 단계입니다. RNA-seq는 병인과 관련된 분자 메커니즘 및 생물학적 기능에 대한 깊은 이해를 얻을 수 있게 합니다. 따라서, 차동 분석은종양의진단, 예후 및 치료에 귀중한 것으로 간주되어 왔다3,4,5. 현재, RNA-seq 차동 발현 분석, 특히 림마, DESeq2 및 EdgeR1,6,7을위해 더 많은 오픈 소스 R/바이오 컨덕터 패키지가 개발되었다. 그러나, 차등 분석은 R 언어와 특정 기술과 의료 교육의 교육 과정에서 부족한 적절한 방법을 선택하는 능력이 필요합니다.
본 프로토콜에서, 암 게놈 아틀라스(TCGA)로부터 추출된 담랑고카르시노마(CHOL) RNA-seq 카운트 데이터를 기반으로, 가장 공지된 방법 중 3개(림마8,EdgeR9 및 DESeq210)가각각 R프로그램에 의해 CHOL과 정상 조직 간의 DEGs를 식별하였다. limma, EdgeR 및 DESeq2의 세 가지 프로토콜은 유사하지만 분석 프로세스 마다 다른 단계가 있습니다. 예를 들어, 정규화된 RNA-seq 카운트 데이터는 EdgeR 및 limma8,9에필요하며, DESeq2는 자체 라이브러리 불일치를 사용하여정규화(10)가아닌 데이터를 수정한다. 더욱이, edgeR은 RNA-seq 데이터에 특히 적합하며, 림마는 마이크로어레이 및 RNA-seq에 사용된다. 선형 모델은 LIMma에 의해 채택되어DEGs(12)를평가하고, edgeR의 통계는 경험적 베이추정, 정확한 테스트, 일반화선형 모델 및 준가능성 시험9을포함한 음수 이난 분포를 기반으로 한다.
요약하자면, 우리는 각각 림마, DESeq2 및 EdgeR을 사용하여 RNA-seq 차동 발현 분석의 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 문서를 참조함으로써 사용자는 RNA-seq 차동 분석을 쉽게 수행하고 데이터에 적합한 차동 분석 방법을 선택할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td></td>
			<td>version 3.6.2</td>
			<td>free software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>free software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three differential expression analysis methods for rna sequencing: limma, edger, deseq2

RNA 시퀀싱 (RNA-seq)은 유전 적 변경과 복잡한 생물학적 과정 사이의 관계를 밝힐 수 있으며 종양의 진단, 예후 및 치료에서 큰 가치를 가지고 있기 때문에 전사학에서 가장 널리 사용되는 기술 중 하나입니다. RNA-seq 데이터의 차동 분석은 비정상적인 전사를 식별하는 데 매우 중요하며 림마, EdgeR 및 DESeq2는 차동 분석을 위한 효율적인 도구입니다. 그러나, RNA-seq 차동 분석은 R 언어를 가진 특정 기술과 의학 교육의 교과 과정에서 부족한 적당한 방법을 선택하는 기능이 필요합니다.
본 명세서에서는, 당사는 각각 림마, DESeq2 및 EdgeR을 통해 담랑고아르시노마(CHOL) 및 정상 조직 간의 분화유전자(DEGs)를 식별하고, 그 결과는 화산 플롯및 벤 다이어그램에 도시된다. limma, DESeq2 및 EdgeR의 세 가지 프로토콜은 유사하지만 분석 프로세스 마다 다른 단계가 있습니다. 예를 들어 선형 모델은 림마의 통계에 사용되는 반면 음수 이비알 분포는 edgeR 및 DESeq2에서 사용됩니다. 또한, 정규화된 RNA-seq 카운트 데이터는 EdgeR 및 림마에 필요하지만 DESeq2에는 필요하지 않습니다.
여기서는 림마, EdgeR 및 DESeq2의 세 가지 차동 분석 방법에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 세 가지 방법의 결과는 부분적으로 겹칩니다. 세 가지 방법 모두 고유한 장점이 있으며 메서드 선택은 데이터에만 따라 다릅니다.

화산 플롯과 Venn 다이어그램이 특히 사용되는 차동 식 분석의 결과를 시각화하는 다양한 접근 방식이 있습니다. 림마는 |로그FC|≥2와 adj를 가진 CHOL과 정상 조직 사이 3323개의 DEG를 확인했습니다. P.Val<0.05는 임계값으로, 그 중 1880은 CHOL 조직에서 하향 조절되었고 1443은 업규제(그림 1a)였다. 한편, EdgeR은 1578개의 다운 규제 DEGs와 3121개의 업 규제 DEGs(그림1b);를 ?...

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Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

RNA 시퀀싱을 위한 차동 발현 분석 방법의 상세한 프로토콜이 제공되었다: 림마, EdgeR, DESeq2.

RNA 시퀀싱을 위한 3개의 차동 발현 분석 방법: 림마, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...

RNA 시퀀싱을 위한 3개의 차동 발현 분석 방법:림마, EdgeR 및 DESeq2. RStudio 프로그램을 열고 R 파일, DEG를 로드합니다. 파일은 보충 파일에서 얻을 수 있습니다. 1.데이터 다운로드 및 사전 처리.1. 암 게놈 아틀라스에서 Cholangiocarcinoma의 높은 처리량 시퀀싱 카운트 데이터를 다운로드합니다. 이 탭은 다음 코드로 쉽게 얻을 수 있습니다.달리기를 클릭하여 R 패키지를 설치합니다. R 패키지를 로드하려면 실행을 클릭합니다. 작업 디렉터리 설정합니다.암 유형을 선택합니다. 데이터를 다운로드하려면 GDCquery 파일에서 R 코드를 실행합니다. 파일 GDCquery는 추가 파일/스크립트에서 획득할 수 있습니다.실행 후 Cholangiocarcinoma RNA 시퀀싱 카운트 데이터를 다운로드하고 이름을 지정할 수 있으며, 여기서 행은 앙상블 유전자 ID를 나타내고 컬럼은 기호 ID를 나타냅니다. 기호 ID에서 위치 14 ~15의 숫자를 확인하십시오. 숫자 범위는 01에서 09까지 종양을 나타내고 10 에서 19사이 정상 조직을 나타냅니다.1.2.유전자 기호에 앙상블 유전자 ID의 대화. 해당 저장소 경로에 따라 어반으로 가져와야 합니다. 추가 파일에서 추가 파일을 수집할 수 있습니다.gtf v22 파일에서 R 코드를 실행합니다. 보충 파일 / 스크립트에서 획득 할 수 있습니다. 여관"기능을 적용하고 앙상블 유전자 ID를 유전자 기호로 변환합니다.1.3.낮은 발현 유전자를 필터링합니다. 패키지 edgeR을 설치하려면 실행을 클릭"R 패키지 edgeR을로드실행"R 코드 다음 실행은 적어도 두 샘플에서 하나 보다 큰 백만 값으로 유전자를 유지합니다. 2. limma를 통한 차분식 분석 "클릭 실행하여 R 패키지 림마를 설치합니다"클릭 실행하여 R 패키지 림마"edgeR"다음 R 코드를 실행하여 설계 매트릭스를 만듭니다.그룹 정보를 추출합니다. 종양 조직으로 01"을 설정합니다. 11"을 정상 조직으로 설정합니다.디자인 매트릭스를 만듭니다. DGEList 개체를 만듭니다. 데이터를 정규화합니다.다음 R 코드를 실행하여 림마 추세 메서드 기반 차동 식 해석을 수행합니다. CPM 값을 계산합니다. 선형 모델에 맞게 실행을 클릭하여 데이터를 예측하거나 변수 간의 관계를 추론합니다.베이지안을 기준으로 T 값, F 값 및 로그 배당률을 계산합니다. 결과 테이블을 추출합니다. 차동식 해석의 결과는 res_limma"로그2 접이식 변경 값을 포함하는 저장됩니다.실험에서 유전자의 평균 log2 발현 수준이다. 수정된 T 통계, P 값, 거짓 발견률이 p값과 차별화된 발현 유전자의 로그 확률을 보정했다. 차별화된 발현 유전자를 식별합니다.따라서 조정된 P값은 0.05 미만이며, 2보다 크거나 동등한 로그 거짓 변화의 절대값은 차별화된 발현 유전자를 선별하는 임계값이다. 결과 res limma는 일반적인 조직과 비교, 1, 443 유전자는 위로 통제되고, 1, 880 유전자는 Cholangiocarcinoma 조직에서 아래로 통제된다는 것을 보여줍니다. 결과 테이블을 파일에 출력합니다.R 패키지 ggplot2를 설치하려면 실행을 클릭 "R 패키지 ggplot2"화산 파일에서 R 패키지 ggplot2"실행 R 코드를로드하고 파일 화산은 보충 파일에서 획득 할 수 있습니다. 유전자는 그들의 log2 접기 변경 및 조정된 P 값에 따라 다른 위치에 매핑될 수 있습니다. 그래서 상이하게 조절된 분화유전자는 빨간색으로 착색됩니다.그리고 하향 조절 된 분화 유전자는 녹색으로 착색된다. 화산 플롯을 저장하려면 내보내기"를 클릭합니다. 3. edgeR을 통한 차동 식 분석"R 패키지 에지R을 로드하려면 실행을 클릭합니다"디자인 행렬을 만들기 위해 다음 R 코드를 실행합니다.실행을 클릭하여 DGEList 개체를 만들고 데이터를 정규화합니다. 실행을 클릭하여 유전자 발현 값의 분산을 추정합니다. 실행을 클릭하여 모델을 사용하여 데이터를 계산합니다.통계 테스트를 수행합니다. 결과 테이블을 추출합니다. 결과는 로그 폴드 변경 값, logCPM, F, p 값 및 잘못된 검색률수정 p 값을 포함하는 res edgeR"에 저장됩니다.차별화된 발현 유전자를 식별합니다. 결과 res edgeR"는 일반적인 조직과 비교하는 것을 보여줍니다, 3, 121 유전자는 위로 통제되고, 1, 578 유전자는 Cholangiocarcinoma 조직에서 아래로 통제됩니다. 결과 테이블을 파일에 출력합니다.화산 플롯을 만듭니다. 화산 플롯을 저장하려면 내보내기를 클릭합니다. 4. DESeq2를 통한 차동 식 분석.R 패키지 DESeq2를 설치하려면 실행을 클릭"R 패키지 DESeq2를 로드하려면 실행을 클릭"모색 계수를 결정하기 위해 다음 R 코드를 실행합니다. DESeq2 데이터 집합 개체를 만듭니다. 분석을 수행합니다.결과 테이블을 생성합니다. 결과는 정규화된 읽기 수, 로그 폴드 변경 값, 로그 폴드 변경 표준 화살표, 용접 통계, 원본 P 값 및 수정된 P 값의 평균을 포함하는 res DESeq2에 저장됩니다. DEGs를 식별합니다.결과 RES DESeq2는 일반적인 조직과 비교하는 것을 보여줍니다, 이천 아백 삼십8 유전자는 위로 통제되고, 1,000의 6백 및 16개의 유전자는 Cholangiocarcinoma 조직에서 아래로 통제됩니다. 결과 테이블을 파일에 출력합니다. 화산 플롯을 만듭니다.화산 플롯을 저장하려면 내보내기를 클릭합니다. 5. 벤 다이어그램. 실행을 클릭하여 R 패키지 벤 다이어그램을 설치합니다.달리기를 클릭하여 R 패키지 벤 다이어그램을 로드합니다. 최대 조절 된 분화 유전자의 벤 다이어그램을 만듭니다. 밴 다이어그램을 저장하려면 내보내기를 클릭하고, 하향 조절된 분화 유전자의 벤 다이어그램을 만듭니다.내보내기를 클릭하여 벤 다이어그램을 저장합니다. 6. 대표적인 결과. 그림 하나는 림마, edgeR 및 DESeq2에 의해 취득 된 모든 유전자의 화산 플롯을 보여줍니다.음수 로그 p 값은 로그 폴드 변경에 대해 플롯됩니다. 적색점은 상조절된 분화 유전자를 나타내며, 녹색점은 하향 조절된 분화 유전자를 나타낸다. 림마는 1만 80080개의 하향 조절유전자를 분화하고, Cholangiocarcinoma 조직에서 1,000만 4백사십삼의 상발성 발현 유전자를 식별한다.EdgeR은 1,000만 십백8개의 하향 조절 된 분화 유전자를 식별하고, 3천 1백 21 개의 상반된 발현 유전자를 식별합니다. DESeq2는 1,000개의 6백 16개의 하향 조절 된 분화 유전자를 식별하고, 2천 9백삼8개의 상반된 분화 유전자를 식별합니다. 그림 2, 벤 다이어그램은 limma edgeR 및 DESeq2에서 결과 나누기 사이에 중복을 보여 준다.이 세 가지 방법의 결과를 비교하면, 1,000사백삼1up-regulated 분화 유전자, 그리고 1,000,300 개의 다운 조절 된 분화 유전자가 겹치고 있다. 7.결론. 이 프로토콜에서는 R 패키지, 림마, 에지R 및 DESeq2를 사용하여 높은 계열의 카운트 데이터에 대한 다양한 유형의 측정 분석의 세부 프로토콜을 여기에 제공했습니다. 세 가지 방법은 분석 과정에서 유사하고 직원들이 있습니다.그리고 그 세 가지 약에서 그들의 부분적으로 겹칩니다. 세 가지 의약품 모두 고유한 장점이 있습니다. 그리고 선택은 데이터의 시간에 따라 달라집니다.현재 데이터가 있는 경우 limma를 우선적으로 제공해야 하지만 세대 시퀀싱 데이터, edgeR 및 DESeq2가 선호됩니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

에 약물 저항 관련 소설 스플 라이스 변종을 감지하는 RNA 시퀀싱을 사용하여<em&gt; 체외</em&gt; 암 모델

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

연구

암 연구학

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

2 차원 젤 전기 이동 법 질량 분석 방법으로 인간의 뇌 Adenoma 조직 프로테옴의 분석에 대 한 결합

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성

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