Name: imaging and quantification of intact neuronal dendrites via clarity tissue clearing
Uploaded: 2021-04-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing at JoVE.com

نود أن نشكر NRDDC الأساسية الفيروسية في معهد جان ودان دنكان العصبي لإنتاج AAVs والفيروسات العدسية المستخدمة في هذه التجارب. بالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر مركز كلية بايلور للطب المقارن تربية الفئران والصيانة العامة للفئران المستخدمة. نود أن نشكر جمعية القلب الأمريكية على دعمها بموجب الجائزة رقم 20PRE35040011 ، و BRASS: Baylor دعاة البحوث للطلاب العلماء لدعمهم (PJH). وأخيرا، نود أن نشكر Logos على تزويد مختبرنا بنظام إزالة الأنسجة الكهربائية X-Clarity.

يتبع البروتوكول التالي جميع إرشادات رعاية الحيوان لكلية بايلور للطب.
1. تشريح وإعداد الأنسجة
<ol><li>قتل رحيم الماوس مع جرعة زائدة من isoflurane عن طريق وضع الماوس في حاوية مغلقة مع منشفة غارقة في isoflurane (أو من قبل وسائل أخرى وافق IUCAC).</li>
	<li>Perfuse الحيوان عبر البطاقة باستخدام إبرة 25 G مع...

<ol>
	<li>Abbott, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mind+of+a+mouse.">The Mind of a mouse.</a> Cell. 182 (6), 1372-1376 (2020).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex.">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), (2015).</li><li>Winnubst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+1,000+projection+neurons+reveals+new+cell+types+and+organization+of+long-range+connectivity+in+the+mouse+brain.">Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain.</a> Cell. 179 (1), 268-281 (2019).</li><li>Araya, R., Vogels, T. P., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+spine+neck+changes+are+correlated+with+synaptic+strength.">Activity-dependent dendritic spine neck changes are correlated with synaptic strength.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (28), (2014).</li><li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+dendritic+spines.">Structural plasticity of dendritic spines.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).</li><li>Mart&#237;nez-Cerde&#241;o, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrite+and+spine+modifications+in+autism+and+related+neurodevelopmental+disorders+in+patients+and+animal+models.">Dendrite and spine modifications in autism and related neurodevelopmental disorders in patients and animal models.</a> Developmental Neurobiology. 77 (4), 393-404 (2017).</li><li>Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+and+imaging+technologies+for+circuit-based+neuroanatomy.">Molecular genetics and imaging technologies for circuit-based neuroanatomy.</a> Nature. 461 (7266), 900-907 (2009).</li><li>Kim, E. H., Chin, G., Rong, G., Poskanzer, K. E., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probes+for+neurobiological+sensing+and+imaging.">Optical probes for neurobiological sensing and imaging.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (5), 1023-1032 (2018).</li><li>Weissman, T. A., Pan, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainbow:+New+resources+and+emerging+biological+applications+for+multicolor+genetic+labeling+and+analysis.">Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis.</a> Genetics. 199 (2), 293-306 (2014).</li><li>Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+vectors+in+neuroscience+research.">Adeno-associated viral vectors in neuroscience research.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 69-82 (2020).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+diversity+in+development+and+disease.">Motor neuron diversity in development and disease.</a> Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).</li><li>Ledda, F., Paratcha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+dendritic+arbor+patterning.">Mechanisms regulating dendritic arbor patterning.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (24), 4511-4537 (2017).</li><li>Falougy, H. E., Filova, B., Ostatnikova, D., Bacova, Z., Bakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+morphology+alterations+in+autism+and+possible+role+of+oxytocin.">Neuronal morphology alterations in autism and possible role of oxytocin.</a> Endocrine Regulations. 53 (1), 46-54 (2019).</li></ol>

قبل ظهور تقنيات إزالة الأنسجة المعاصرة ، كانت دراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية تتكون من قسم مكثف الوقت والتصوير وإعادة بناء الأجزاء الرقيقة جدا المجاورة. باستخدام تطهير الأنسجة الكهربائية في تركيبة مع التصوير confocal يوفر وجهة نظر دون عائق من مورفولوجيا الخلايا العصبية كاملة. من الأشجار ا?...

فهم التنظيم المكاني، وأنماط الاتصال، ومورفولوجيا الهياكل البيولوجية ثلاثية الأبعاد المعقدة أمر ضروري لتحديد وظائف خلايا وأنسجة محددة. وهذا صحيح بشكل خاص في علم الأعصاب، حيث تم تكريس جهد هائل لبناء خرائط عصبية تحليلية عالية الدقة للجهاز العصبي المركزي1،2. الفحص الدقيق للخلايا العصبية التي تتألف منها هذه الخرائط تسفر عن مورفولوجيا متنوعة، مع الاتصالات والمواقع التي تعكس وظيفة هذه المجموعات المتنوعة من الخلايا العصبية3،4. وعلاوة على ذلك، التحقيق في الهياكل دون الخلوية، وخاصة العمود الفقري التشجر، يمكن أن تبلغ نضج نقاط الاشتباك العصبي، وبالتالي تعكس عمليات النمو والأمراض العصبية الدول5،6،7. وهكذا، فإن النهج التي تحسن دقة التصوير والإنتاجية ضرورية لفهم أفضل لوظيفة الدماغ على جميع المقاييس.
وقد وسعت التطورات الأخيرة مجموعة الأدوات الجزيئية والجينية لوضع علامات والتلاعب بمجموعات الخلايا العصبية. تطوير علامات الفلورسنت جديدة, جنبا إلى جنب مع أساليب جديدة لإدخال هذه العلامات في الخلايا العصبية, يسمح للتفاضلي وضع العلامات من السكان من الخلايا العصبية التفاعل داخل نفس الحيوان أو عينة الدماغ8,9,10,11. نظرا لأن الضوء مبعثر بواسطة الدهون المبهمة ، ونظرا للمحتوى الدهني العالي لأنسجة الدماغ ، فقد اقتصر تصوير مجموعات الخلايا العصبية في المقام الأول على أقسام رقيقة أو اعتمد على تقنيات ميكروسكوبي متقدمة (على سبيل المثال ، المجهر confocal ، متعدد الفوتونات ، وورقة الضوء) لتصوير الهياكل العميقة. ومع ذلك، فقد تعززت هذه الجهود إلى حد كبير من خلال التقدم في تقنيات إزالة الأنسجة. واضح الدهون تبادل الأكريلاميد الهجين التصوير جامدة / المناعة /في الموقع التهجين متوافقة مع الأنسجة hYdrogel (وضوح) هي واحدة من هذه التقنية، التي يتم غرس الأنسجة ذات الاهتمام مع مونومرات هيدروجيل (الأكريلاميد وببيس أكريلاميد) ومن ثم غسلها مع المنظفات12. تهجين مونومرات الهيدروجيل لإنشاء سقالة هيدروجيل ثلاثية الأبعاد مستقرة شفافة بصريا و نفاذية لتسميات الجزيئات الكبيرة. يتم الحفاظ على الأحماض النووية والبروتينات داخل المصفوفة المهجنة ، في حين تتم إزالة الدهون بواسطة يغسل المنظفات(الشكل 1). وهذا يؤدي إلى نسيج مستقر جامد بما يكفي للحفاظ على الشكل الأصلي والتوجه للخلايا والجزيئات غير الدهنية ، في حين شفافة بصريا بما يكفي لتصوير الهياكل العميقة بسهولة بدقة عالية. تسمح هذه الصيانة لهيكل الأنسجة واتجاهها بتصوير الشرائح السميكة ، وبالتالي الحفاظ على الاتصالات من خلية إلى خلية والعلاقات المكانية. وعلاوة على ذلك، ونظرا للحفاظ على موقع وتوافر البروتينات والأحماض النووية أثناء عملية التطهير، فإن الأنسجة المطهية قادرة على الاحتفاظ بعلامات مستندة إلى التعبير، بالإضافة إلى التسميات الخارجية. وهكذا ، CLARITY يفسح المجال كوسيلة قوية لتصوير كميات كبيرة من هياكل الدماغ العميقة والاتصالات بين هذه الهياكل في دقة عالية.
استخدام وضوح يحسن كثيرا النهج لتصوير مجموعات الخلايا العصبية. هذه التقنية بارعة بشكل خاص في توليد كميات كبيرة من بيانات التصوير. يعمل CLARITY بشكل جيد مع أشكال متعددة من الفلورسينس القائم على البروتين. يستخدم هذا البروتوكول نهجا قائما على العدسية للخلايا ذات التسمية القليلة مع EGFP و tdTomato؛ ومع ذلك، تم استخدام الأليل مراسل المعدلة وراثيا التعبير عن tdTomato أو EGFP لتسمية الخلايا لإعادة الإعمار بشكل روتيني. من المهم اختيار الفلوروفور المستقر والمشراق (على سبيل المثال، EGFP أو tdTomato). بالإضافة إلى ذلك، استخدام مروج قوي للتعبير عن الفلوروفور ينتج تباينا فائقا وجودة صورة. عيوب هذه التقنية تنشأ كما تحليل صحيح هذا الكم الكبير من البيانات يمكن أن تكون كثيفة العمالة والوقت على حد سواء. يمكن للمجاهر المتخصصة المساعدة في تحسين الإنتاجية وتقليل عبء العمل. ومع ذلك، فإن بناء المجاهر المتقدمة وامتلاكها و/أو تشغيلها غالبا ما تكون باهظة التكلفة بالنسبة للعديد من المختبرات. يقدم هذا العمل طريقة عالية الإنتاجية وسريعة وبسيطة نسبيا لتصور كميات كبيرة من الأنسجة العصبية بدقة عالية باستخدام مسح أنسجة CLARITY للأقسام الكبيرة ، إلى جانب المجهر الكونفوفيكال القياسي. يصف هذا البروتوكول هذا النهج من خلال الخطوات التالية: 1) تشريح وإعداد الأنسجة العصبية ، 2) تطهير الأنسجة ، 3) تركيب الأنسجة ، 4) تصوير الشرائح المعدة ، و 5) معالجة صور الشريحة الكاملة باستخدام إعادة بناء وتحليل برامج التصور المجهري(الشكل 2). هذه الجهود تؤدي إلى صور عالية الدقة التي يمكن استخدامها لتحليل مجموعات من الخلايا العصبية، وأنماط اتصال الخلايا العصبية، مورفولوجيا التشجرات ثلاثية الأبعاد، وفرة العمود الفقري التغصني ومورفولوجيا، وأنماط التعبير الجزيئي داخل أنسجة الدماغ سليمة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 1&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide (No-Bis)</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoretic Tissue Clearing Solution</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2158-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel Solution Kit</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C1310X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case</td>
			<td>fisher</td>
			<td>MT21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044</td>
			<td>Wako</td>
			<td>925-41020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-CLARITY Polymerization System</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-CLARITY Tissue Clearing System II</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C30001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and quantification of intact neuronal dendrites via clarity tissue clearing

يتم تحديد نشاط الدماغ ، والإشارات الكهروكيميائية التي تنتقل بين الخلايا العصبية ، من خلال أنماط الاتصال في شبكات الخلايا العصبية ، ومن مورفولوجيا العمليات والهياكل الفرعية داخل هذه الخلايا العصبية. على هذا النحو، نشأ الكثير مما هو معروف عن وظيفة الدماغ جنبا إلى جنب مع التطورات في تقنيات التصوير التي تسمح بمزيد من البصيرة في كيفية تنظيم الخلايا العصبية وتوصيلها في الدماغ. وقد سمحت التحسينات في تطهير الأنسجة للتصوير عالي الدقة لشرائح الدماغ السميكة، مما يسهل إعادة البناء المورفولوجي وتحليل الهياكل الفرعية العصبية، مثل المشجرات والعمود الفقري. جنبا إلى جنب ، والتقدم في برامج معالجة الصور توفير أساليب لتحليل مجموعات البيانات بسرعة التصوير الكبيرة. يقدم هذا العمل طريقة سريعة نسبيا لمعالجة وتصور وتحليل شرائح سميكة من الأنسجة العصبية المسماة بدقة عالية باستخدام إزالة الأنسجة CLARITY ، والتنظير المجهري confocal ، وتحليل الصور. سيسهل هذا البروتوكول الجهود الرامية إلى فهم أنماط الاتصال ومورفولوجيا الخلايا العصبية التي تميز الأدمغة السليمة، والتغيرات في هذه الخصائص التي تنشأ في حالات الدماغ المريضة.

بعد الحصول على الصورة ، تم تحليل مورفولوجيا الخلية التمثيلية باستخدام إحصاءات مضمنة وتصنيف البرامج النصية داخل برنامج التحليل. البيانات التي تم جمعها(الشكل 6A)يعكس أن الخلايا العصبية 2 لديها بنية أكبر dendritic مع كثافة أعلى من العمود الفقري. ككل، تشير البيانات إلى أن الخلايا ا...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing at JoVE.com

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

المورفولوجيا التشجرية العصبية غالبا ما تكمن وراء وظيفة. في الواقع، العديد من العمليات المرض التي تؤثر على تطوير الخلايا العصبية تظهر مع النمط الظاهري المورفولوجي. يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وقوية لتحليل المشجرات التشجرية السليمة والعمود الفقري المرتبط بها.

التصوير والتحديد الكمي للتشعبات العصبية السليمة عن طريق إزالة الأنسجة الوضوح

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

سيسمح هذا البروتوكول للباحثين بالإجابة على الأسئلة المهمة حول أنماط الخلايا العصبية للاتصال والتنظيم المكاني الذي يقوم عليه العمل داخل الدائرة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تمكن التصور من مورفولوجيا الخلايا العصبية الموجودة في عمق الأنسجة ثلاثية الأبعاد سليمة. هذه الطريقة واضحة وبالتالي يمكن استنساخها بسهولة.يجب أن يكون المجربون لأول مرة مرتاحين لأداء هذه التقنية. من الضروري الحصول على عينة أنسجة واضحة من أجل الحصول على بيانات عالية الجودة. وسوف العرض البصري للوضوح الأنسجة المناسبة وتقنيات المقاصة تمكين نتائج قابلة للاستنساخ بسهولة.للبدء، ضع أنسجة الدماغ المغمورة بالهيدروجيل في حاضنة فراغ لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية مع فراغ ناقص 90 كيلوباسكال. اترك الأنبوب العلوي غير مفكك للسماح للفراغ بالتشكل بشكل صحيح. غسل الأنسجة مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف.ضع عينة الأنسجة البلمرة في غرفة الكهرومورفوريس، مع تتبع اتجاه الأنسجة داخل الغرفة. ملء الغرفة والخزان مع العازلة SDS الكهربائي الموردة. تشغيل العينة في 70 فولت، أمبير واحد، و 35 درجة مئوية مع تيار ثابت لمدة ساعتين تقريبا لكل ملليلتر من الأنسجة.تحقق من العينة بشكل دوري للتأكد من تطهير كافية من أنسجة الدماغ عن طريق إزالته من الغرفة واستبداله في نفس الاتجاه. بعد الانتهاء من مسح العينة، وغسلها في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة، واستبدال برنامج تلفزيوني مع برنامج تلفزيوني جديد في كثير من الأحيان ممكن. بعد الغسل النهائي في PBS، اغسل الأنسجة لمدة خمس دقائق في الماء المتأين في درجة حرارة الغرفة ثلاث مرات.سوف تصبح الأنسجة مبهمة وقد تتوسع. احتضان الأنسجة في محلول مطابقة مؤشر الانكسار لمدة أربع ساعات على الأقل في درجة حرارة الغرفة. أثناء الحضانة ، وبناء غرفة سكنية مناسبة لتصوير العينة.ابدأ باستخدام شريحة زجاجية كقاعدة للتركيب ، ثم ضع إما مسافات مطاطية أو بلاستيكية وآمنها بالغراء الفائق ، مع التأكد من عدم وجود أي ثقوب. ضع الأنسجة الواضحة في غرفة التركيب المليئة مسبقا بمحلول مطابقة الفهرس الانكساري. جبل آمن الأنسجة عن طريق وضع غطاء زجاجي على رأس وختم مع طلاء الأظافر.صورة هذا النسيج عن طريق إضافة قطرة من مؤشر الانكسار مطابقة حل تصاعد مباشرة على رأس الزجاج. لبناء غرفة تصوير أنسجة كبيرة للأنسجة التي يزيد سمكها عن خمسة ملليمترات، استخدم طبق زجاجي طوله 10 سنتيمترات مع جدار مرتفع. ضع أنبوبا مخروطيا 50 ملليلتر في المركز ، مع التأكد من أن قطر الأنبوب كبير بما يكفي لقبول برميل العدسة الموضوعية المستخدمة.جعل 3٪ agarose في الماء وتصب في الفضاء بين الطبق الزجاجي وأنبوب مخروطي، ثم السماح لها لتبرد لمدة ساعة واحدة. هذا سوف يشكل حلقة من الآغروز الصلبة. تلتزم بأمان الأنسجة إلى الجزء السفلي من الغرفة باستخدام الغراء السوبر وملء الغرفة مع معامل الانكسار مطابقة الحل، والتي قد تبدأ في البلمرة ما لم يتم الحفاظ عليها من الهواء وتخزينها في أربع درجات مئوية.الحصول على الصورة باستخدام المجهر confocal. قم بتشغيل جميع معدات التصوير ذات الصلة. ضع العينة على المسرح.اقترب بعناية من وسائل الإعلام الغمر مع الهدف وتشكيل عمود مستمر من وسائل الإعلام. باستخدام الفلورة، ابحث عن حقل تصوير مناسب. ابدأ بتعيين إعدادات الدقة وسرعة المسح الضوئي.إذا التصوير باستخدام المجهر confocal، إغلاق الثقب تماما للحصول على أصغر قسم البصرية وبالتالي أفضل دقة Z. قم بزيادة قوة الليزر أو زيادة المستشعر تدريجيا حتى يتم الحصول على صورة مناسبة بنسبة إشارة إلى ضوضاء عالية. إذا كنت تستخدم معيار EGFP أو tdTomato التصوير بلونين، تعيين إعدادات جمع الضوء.تعيين المعلمات Z-المكدس على أساس نقاط البداية والنهاية الملاحظة من الأنسجة. تعيين حجم الخطوة استنادا إلى دقة Z المطلوبة. سوف أحجام خطوة أصغر تسفر عن دقة Z أكبر، ولكن قد يؤدي إلى تبييض العينة.عندما تكون راضيا عن إعدادات الحصول على الصورة، احصل على الصورة. تأكد من أن الصورة تحتوي على نسبة إشارة عالية إلى ضوضاء وتظهر حدودا متميزة للهياكل. بعد الحصول على الصورة ، تم تحليل مورفولوجيا الخلية التمثيلية باستخدام إحصاءات مضمنة وتصنيف البرامج النصية داخل برنامج التحليل.البيانات التي تم جمعها يعكس أن العصبية 2 لديها أكبر من الهيكل dendritic مع كثافة أعلى من العمود الفقري مقارنة مع العصبية 1. لإثبات هذه النتيجة، تم إجراء تحليل شول القياسية، مما يؤكد أن العصبية 2 هو أكثر تعقيدا dendritically من العصبية 1 كما يدل على ذلك زيادة عدد تقاطعات شول في 50 إلى 100 ميكرومتر من سوما. الخلايا العصبية 1 يحتوي على نسبة أكبر من العمود الفقري مع أشكال أكثر مثل filopodia وهو نوع فرعي العمود الفقري غير ناضجة.العمود الفقري مع رؤساء محددة، ودعا العمود الفقري الفطر، من المرجح أن تحتوي على نقاط الاشتباك العصبي أكثر تطورا ونضجا. وهكذا، الخلايا العصبية 2 هو أكثر نضجا مع كثافة أعلى من العمود الفقري ناضجة. بعد التطهير ، يمكن تلوين قطع الأنسجة باستخدام الكيمياء المناعية التقليدية.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

توصيف نسيجية سليمة من الأجهزة بالغة الصغر زرع الدماغ والأنسجة المحيطة بها

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

التصوير ألياف هرمون السيروتونين في الحبل الشوكي الماوس عن طريق وضوح / تقنية مكعب

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

المقاصة البصري للنظام العصبي المركزي الماوس عن طريق وضوح السلبي

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

الحضانة لفترات طويلة الحادة العصبية الأنسجة للالكهربية والكالسيوم التصوير

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

تصوير الكالسيوم اثنين-فوتون في Dendrites العصبية في الدماغ شرائح

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

رواية السلبي مسح أساليب للإنتاج السريع للشفافية الضوئية في كامل أنسجة الجهاز العصبي المركزي

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy

رصد بقاء الخلايا العصبية عن طريق الفحص المجهري Fluorescence طولية

Standard cytotoxicity assays, which require the collection of lysates or fixed cells at multiple time points, have limited sensitivity and capacity to ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

طريقة إزالة الأنسجة الكارهة للماء لأنسجة دماغ الفئران

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

إعداد الكبار Drosophila melanogaster لتصوير الدماغ كله أثناء السلوك والمحفزات الاستجابات

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

الاحتواء المناعي لشبكية العين الكاملة مع طريقة إزالة الأنسجة الوضوح

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...