Name: imaging and quantification of intact neuronal dendrites via clarity tissue clearing
Uploaded: 2021-04-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing at JoVE.com

我们要感谢Jan和Dan Duncan神经学研究所的病毒核心NRDDC生产了这些实验中使用的AAV和慢病毒。此外，我们要感谢贝勒医学院比较医学中心为小鼠饲养和所用小鼠的一般维护。我们要感谢美国心脏协会对奖项编号20PRE35040011的支持，以及BRASS：贝勒学生科学家研究倡导者（PJH）的支持。最后，我们要感谢Logos为我们的实验室提供了Logos X-Clarity电泳组织清除系统。

以下方案遵循贝勒医学院的所有动物护理指南。
1. 解剖和组织准备
<ol><li>通过将小鼠置于封闭的容器中，用毛巾浸泡在异氟醚中（或通过其他IUCAC批准的方法）用过量的异氟醚对小鼠实施安乐死。</li>
	<li>使用 25 G 针头和 10 mL 冰冷 PBS 经心电泳为动物灌注，然后用 10 mL 4% PFA 输注动物。</li>
	<li>解剖感兴趣的大脑区域（或组织）。</li>
	<li>将解剖的组织置于4°C下4%PFA过夜。 正?...

<ol>
	<li>Abbott, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mind+of+a+mouse.">The Mind of a mouse.</a> Cell. 182 (6), 1372-1376 (2020).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex.">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), (2015).</li><li>Winnubst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+1,000+projection+neurons+reveals+new+cell+types+and+organization+of+long-range+connectivity+in+the+mouse+brain.">Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain.</a> Cell. 179 (1), 268-281 (2019).</li><li>Araya, R., Vogels, T. P., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+spine+neck+changes+are+correlated+with+synaptic+strength.">Activity-dependent dendritic spine neck changes are correlated with synaptic strength.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (28), (2014).</li><li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+dendritic+spines.">Structural plasticity of dendritic spines.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).</li><li>Mart&#237;nez-Cerde&#241;o, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrite+and+spine+modifications+in+autism+and+related+neurodevelopmental+disorders+in+patients+and+animal+models.">Dendrite and spine modifications in autism and related neurodevelopmental disorders in patients and animal models.</a> Developmental Neurobiology. 77 (4), 393-404 (2017).</li><li>Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+and+imaging+technologies+for+circuit-based+neuroanatomy.">Molecular genetics and imaging technologies for circuit-based neuroanatomy.</a> Nature. 461 (7266), 900-907 (2009).</li><li>Kim, E. H., Chin, G., Rong, G., Poskanzer, K. E., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probes+for+neurobiological+sensing+and+imaging.">Optical probes for neurobiological sensing and imaging.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (5), 1023-1032 (2018).</li><li>Weissman, T. A., Pan, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainbow:+New+resources+and+emerging+biological+applications+for+multicolor+genetic+labeling+and+analysis.">Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis.</a> Genetics. 199 (2), 293-306 (2014).</li><li>Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+vectors+in+neuroscience+research.">Adeno-associated viral vectors in neuroscience research.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 69-82 (2020).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+diversity+in+development+and+disease.">Motor neuron diversity in development and disease.</a> Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).</li><li>Ledda, F., Paratcha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+dendritic+arbor+patterning.">Mechanisms regulating dendritic arbor patterning.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (24), 4511-4537 (2017).</li><li>Falougy, H. E., Filova, B., Ostatnikova, D., Bacova, Z., Bakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+morphology+alterations+in+autism+and+possible+role+of+oxytocin.">Neuronal morphology alterations in autism and possible role of oxytocin.</a> Endocrine Regulations. 53 (1), 46-54 (2019).</li></ol>

在当代组织清除技术出现之前，研究神经元形态学包括时间密集型切片，成像和相邻非常薄切片的重建。将电泳组织清除与共聚焦成像结合使用，可提供完整神经元形态的无障碍视图。从完整的树突树到最小的突触，成像和量化神经元形态从未如此可行。
清除脑组织的准备非常简单，只需要一件专用设备。使用该协议清除和成像组织颠覆了繁琐的薄切片，处理和安装的需求?...

了解复杂三维生物结构的空间组织，连接模式和形态对于描绘特定细胞和组织的功能至关重要。这在神经科学中尤其如此，其中投入了巨大的精力来构建中枢神经系统的高分辨率神经解剖图1，2。仔细检查构成这些图谱的神经元会产生不同的形态，其连接和位置反映了这些不同神经元集的功能3，4。此外，对亚细胞结构的研究，特别是树突棘，可以告知突触的成熟，从而反映发育过程和神经系统疾病状态5，6，7。因此，提高成像分辨率和通量的方法对于更好地了解所有尺度上的大脑功能至关重要。
最近的进展扩展了用于标记和操纵神经元群体的分子和遗传工具包。新的荧光标记物的发展，结合将这些标记物引入神经元的新方法，允许对同一动物或大脑样本8，9，10，11中的相互作用神经元群体进行差异标记。由于光被不透明的脂质散射，并且考虑到脑组织的高脂质含量，成像神经元群体主要局限于薄切片或依赖于先进的显微技术（例如，共聚焦，多光子和光片显微镜）来成像深层结构。然而，这些努力得到了组织清除技术的进步的极大支持。透明脂质交换丙烯酰胺杂交的刚性成像/免疫染色/原位杂交相容的组织 - hYdrogel（CLARITY）就是这样一种技术，其中感兴趣的组织注入水凝胶单体（丙烯酰胺和双丙烯酰胺），然后用洗涤剂洗涤12。水凝胶单体杂交以产生稳定的3D水凝胶支架，该支架具有光学透明性且可渗透到大分子标签。核酸和蛋白质保持在杂交基质中，而脂质通过洗涤剂洗涤剂除去（图1）。这导致稳定的组织足够坚固，以保持细胞和非脂质分子的原始形状和方向，同时光学透明，足以以高分辨率轻松成像深层结构。这种组织结构和方向的维持允许对厚切片进行成像，从而保留细胞间连接和空间关系。此外，由于蛋白质和核酸的位置和可用性在清除过程中得到维持，因此清除的组织能够持有基于表达的标记物以及外源标记。因此，CLARITY是一种有效的方法，用于以高分辨率对大量深部脑结构以及这些结构之间的联系进行成像。
CLARITY的使用大大改进了神经元群体成像的方法。这种技术特别擅长生成大量的成像数据。CLARITY适用于多种形式的基于蛋白质的荧光。该协议利用基于慢病毒的方法，用EGFP和tdTomato稀疏标记细胞;然而，表达tdTomato或EGFP以标记细胞进行重建的转基因报告等位基因已被常规使用。选择光稳定且明亮的荧光团（例如EGFP或tdTomato）非常重要。此外，使用强力启动剂表达荧光团可产生卓越的对比度和图像质量。这种技术的缺点是，正确分析如此大量的数据既费力又费时。专用显微镜可以帮助提高通量并减少工作量。然而，对于许多实验室来说，建造、拥有和/或操作先进的显微镜往往成本过高。这项工作提出了一种高通量，相对快速和简单的方法，使用CLARITY组织清除大切片，结合标准共聚焦显微镜，以高分辨率可视化大量神经组织。该协议通过以下步骤描述了这种方法：1）解剖和制备神经组织，2）清除组织，3）安装组织，4）成像制备的切片，以及5）使用显微镜可视化软件重建和分析处理全切片图像（图2）。这些努力产生了高分辨率图像，可用于分析神经元群体，神经元连接模式，3D树突形态，树突状脊柱丰度和形态以及完整脑组织内的分子表达模式。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 1&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide (No-Bis)</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoretic Tissue Clearing Solution</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2158-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel Solution Kit</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C1310X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case</td>
			<td>fisher</td>
			<td>MT21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044</td>
			<td>Wako</td>
			<td>925-41020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-CLARITY Polymerization System</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-CLARITY Tissue Clearing System II</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C30001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and quantification of intact neuronal dendrites via clarity tissue clearing

大脑活动，即神经元之间传递的电化学信号，由神经元网络的连接模式以及这些神经元内过程和子结构的形态决定。因此，关于大脑功能的许多已知知识都与成像技术的发展一起出现，这些技术可以进一步了解神经元在大脑中的组织和连接方式。组织清除的改进允许对厚厚的脑切片进行高分辨率成像，促进形态重建和神经元下部结构的分析，如树突状乔木和棘。同时，图像处理软件的进步提供了快速分析大型成像数据集的方法。这项工作提出了一种相对快速的方法，使用CLARITY组织清除，共聚焦显微镜和图像分析，以高分辨率处理，可视化和分析标记神经组织的厚片。该协议将有助于理解健康大脑特征的连接模式和神经元形态，以及患病大脑状态中出现的这些特征的变化。

图像采集后，使用分析软件中的嵌入式统计数据和分类脚本分析具有代表性的细胞形态。收集到的数据（图6A）反映了神经元2具有更大的树突结构和更高的棘密度。总体而言，数据表明，与神经元1相比，神经元2具有更复杂的树突状结构。为了证实这一结果，进行了标准的Sholl分析，该分析肯定了神经元2比神经元1更具树突复杂性，这表示为从体细胞50-100μm处增加的Sholl交叉?...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing at JoVE.com

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

神经元树突形态通常是功能的基础。事实上，许多影响神经元发育的疾病过程都表现为形态表型。该协议描述了一种简单而强大的方法，用于分析完整的树突状乔木及其相关的棘。

通过 CLARITY 组织清除对完整神经元树突进行成像和定量

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

该协议将允许研究人员回答有关电路内功能基础的连接和空间组织的神经元模式的重要问题。这种技术的主要优点是，它能够可视化位于完整三维组织深处的神经元形态。这种方法很简单，因此易于重现。首次实验者应该能够自如地执行这种技术。为了获得高质量的数据，必须有一个透明的组织样本。适当的组织清晰度和清除技术的视觉演示将使结果易于重复。首先，将水凝胶浸没的脑组织置于真空培养箱中，在37摄氏度和零下90千帕斯卡真空下放置三个小时。将管顶部拧下，以使真空正确形成。用PBS在室温下用轻轻摇动洗纸巾10分钟。将聚合组织样品置于电泳室中，跟踪室内组织的方向。用随附的电泳SDS缓冲液填充腔室和储液槽。以70伏，一安培和35摄氏度的恒定电流每毫升组织运行样品约2小时。定期检查样品，通过将其从腔室中取出并以相同的方向替换来充分清除脑组织。样品清除完成后，在室温下在PBS中洗涤过夜，尽可能经常用新鲜的PBS代替PBS。在PBS中进行最后洗涤后，在室温下用去离子水洗涤纸巾五分钟三次。组织将变得不透明并可能扩张。在室温下将组织在折射率匹配溶液中孵育至少四小时。在孵育过程中，构建一个合适的壳室来对样品进行成像。首先使用载玻片作为安装底座，然后放下橡胶或塑料垫片并用超级胶水固定它们，确保没有任何孔。将透明组织放入预先填充有折射率匹配溶液的安装室中。将玻璃盖玻片放在顶部并用指甲油密封，以牢固地安装纸巾。通过直接在玻璃顶部添加一滴折射率匹配的安装溶液来成像该组织。要为厚度超过5毫米的组织构建大型组织成像室，请使用具有高壁的10厘米玻璃皿。在中心放置一个50毫升的锥形管，确保管的直径足够大，可以接受所用物镜的镜筒。在水中加入3%琼脂糖，倒入玻璃盘和锥形管之间的空间中，然后冷却一小时。这将形成一个固体琼脂糖环。使用超级胶水将组织牢固地粘附在腔室底部，并用折射率匹配溶液填充腔室，除非从空气中保存并储存在四摄氏度下，否则可能会开始聚合。使用共聚焦显微镜获取图像。打开所有相关的成像设备。将样品放在载物台上。小心地接近带有物镜的浸入式介质，并形成连续的介质柱。使用落射荧光，找到合适的成像区域。首先设置分辨率和扫描速度设置。如果使用共聚焦显微镜进行成像，请完全关闭针孔以获得最小的光学截面，从而获得最佳的Z分辨率。逐渐增加激光功率或传感器增益，直到获得具有高信噪比的合适图像。如果使用标准EGFP或tdTomato双色成像，请设置光收集设置。根据观察到的组织起点和终点设置 Z 轴堆栈参数。根据所需的 Z 分辨率设置步长。较小的步长将产生更大的Z分辨率，但可能导致样品漂白。当对图像采集设置感到满意时，采集图像。确保图像具有高信噪比，并显示结构的明显边界。图像采集后，使用分析软件中的嵌入式统计数据和分类脚本分析具有代表性的细胞形态。收集的数据表明，与神经元1相比，神经元2具有比树突状结构更大的刺密度和更高的棘密度。为了证实这一结果，进行了标准的Scholl分析，该分析肯定了神经元2比神经元1更具树突复杂性，这表示在距离体细胞50至100微米处的Scholl交叉点数量增加。神经元1包含更大比例的棘，具有更多类似丝状的棘，是一种未成熟的脊柱亚型。具有明确头部的棘，称为蘑菇棘，可能包含更发达和成熟的突触。因此，神经元2更成熟，成熟棘的密度更高。清除后，可以使用传统的免疫组织化学对组织块进行染色。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

脑植入的微型器件及周围组织的完整的组织学特性研究

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

科研

神经科学

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

影像学检查HT能纤维在小鼠脊髓使用CLARITY / CUBIC技术

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

鼠标中枢神经系统的光透明使用被动CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

对于电生理和钙成像急性神经组织的长时间培养

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

脑切片神经元树突的双光子钙成像

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

一种新的用于全中枢神经系统光透明快速生成的无源清除方法

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy

通过纵向荧光显微镜监测新生儿生存

Standard cytotoxicity assays, which require the collection of lysates or fixed cells at multiple time points, have limited sensitivity and capacity to ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

鼠脑组织疏水组织清除方法

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

在行为和刺激反应期间为整个大脑成像准备成人德罗索菲拉褪黑麦片加斯特

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

使用清晰组织清除方法对全山视网膜进行免疫染色

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...