Name: imaging and quantification of intact neuronal dendrites via clarity tissue clearing
Uploaded: 2021-04-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing at JoVE.com

We willen de virale kern NRDDC van het Jan en Dan Duncan Neurological Institute bedanken voor het produceren van de AAV's en lentivirussen die in deze experimenten worden gebruikt. Daarnaast willen we het Baylor College of Medicine Center for Comparative Medicine bedanken voor het houden van muizen en het algemene onderhoud van de gebruikte muizen. We willen de American Heart Association bedanken voor hun steun onder awardnummer 20PRE35040011, en BRASS: Baylor Research Advocates for Student Scientists voor hun steun (PJH). Tot slot willen we Logos bedanken voor het leveren van het Logos X-Clarity elektroforetische weefselverwijderingssysteem aan ons lab.

Het volgende protocol volgt alle richtlijnen voor dierverzorging voor Baylor College of Medicine.
1. Dissectie en weefselpreparaat
<ol><li>Euthanaseer de muis met een overdosis isofluraan door de muis in een gesloten container te plaatsen met een handdoek gedrenkt in isofluraan (of op andere IUCAC-goedgekeurde middelen).</li>
	<li>Perfuseer het dier transcardiaal met behulp van een naald van 25 G met 10 ml ijskoude PBS, gevolgd door 10 ml 4% PFA.</li>
	<li>Ontleed het hersengebied (of weefse...

<ol>
	<li>Abbott, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mind+of+a+mouse.">The Mind of a mouse.</a> Cell. 182 (6), 1372-1376 (2020).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex.">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), (2015).</li><li>Winnubst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+1,000+projection+neurons+reveals+new+cell+types+and+organization+of+long-range+connectivity+in+the+mouse+brain.">Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain.</a> Cell. 179 (1), 268-281 (2019).</li><li>Araya, R., Vogels, T. P., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+spine+neck+changes+are+correlated+with+synaptic+strength.">Activity-dependent dendritic spine neck changes are correlated with synaptic strength.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (28), (2014).</li><li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+dendritic+spines.">Structural plasticity of dendritic spines.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).</li><li>Mart&#237;nez-Cerde&#241;o, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrite+and+spine+modifications+in+autism+and+related+neurodevelopmental+disorders+in+patients+and+animal+models.">Dendrite and spine modifications in autism and related neurodevelopmental disorders in patients and animal models.</a> Developmental Neurobiology. 77 (4), 393-404 (2017).</li><li>Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+and+imaging+technologies+for+circuit-based+neuroanatomy.">Molecular genetics and imaging technologies for circuit-based neuroanatomy.</a> Nature. 461 (7266), 900-907 (2009).</li><li>Kim, E. H., Chin, G., Rong, G., Poskanzer, K. E., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probes+for+neurobiological+sensing+and+imaging.">Optical probes for neurobiological sensing and imaging.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (5), 1023-1032 (2018).</li><li>Weissman, T. A., Pan, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainbow:+New+resources+and+emerging+biological+applications+for+multicolor+genetic+labeling+and+analysis.">Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis.</a> Genetics. 199 (2), 293-306 (2014).</li><li>Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+vectors+in+neuroscience+research.">Adeno-associated viral vectors in neuroscience research.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 69-82 (2020).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+diversity+in+development+and+disease.">Motor neuron diversity in development and disease.</a> Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).</li><li>Ledda, F., Paratcha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+dendritic+arbor+patterning.">Mechanisms regulating dendritic arbor patterning.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (24), 4511-4537 (2017).</li><li>Falougy, H. E., Filova, B., Ostatnikova, D., Bacova, Z., Bakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+morphology+alterations+in+autism+and+possible+role+of+oxytocin.">Neuronal morphology alterations in autism and possible role of oxytocin.</a> Endocrine Regulations. 53 (1), 46-54 (2019).</li></ol>

Vóór de komst van hedendaagse weefselzuiveringstechnieken bestond het bestuderen van neuronale morfologie uit tijdsintensieve secties, beeldvorming en reconstructie van aangrenzende zeer dunne secties. Het gebruik van elektroforetische weefselverwijdering in combinatie met confocale beeldvorming biedt een onbelemmerd beeld van de volledige neuronale morfologie. Van intacte dendritische bomen tot de kleinste synaptische bouton, beeldvorming en kwantificering van neuronale morfologie is nog nooit zo haalbaar geweest....

Het begrijpen van de ruimtelijke organisatie, patronen van connectiviteit en morfologie van complexe driedimensionale biologische structuren is essentieel voor het afbakenen van de functies van specifieke cellen en weefsels. Dit geldt met name in de neurowetenschappen, waar enorme inspanningen zijn besteed aan het bouwen van neuroanatomische kaarten met hoge resolutie van het centrale zenuwstelsel1,2. Nauwkeurig onderzoek van de neuronen waaruit deze kaarten bestaan, levert gevarieerde morfologieën op, met verbindingen en locaties die de functie van deze diverse sets neuronen weerspiegelen3,4. Bovendien kan onderzoek van subcellulaire structuren, met name dendritische stekels, de volwassenheid van synapsen informeren, waardoor ontwikkelingsprocessen en neurologische ziektetoestanden worden weerspiegeld5,6,7. Benaderingen die de beeldresolutie en doorvoer verbeteren, zijn dus essentieel voor een beter begrip van de hersenfunctie op alle schalen.
Recente ontwikkelingen hebben de moleculaire en genetische toolkit voor het markeren en manipuleren van populaties van neuronen uitgebreid. De ontwikkeling van nieuwe fluorescerende markers, gecombineerd met nieuwe methoden om deze markers in neuronen te introduceren, maakt differentiële labeling van populaties van interagerende neuronen binnen hetzelfde dier of hersenmonster8,9,10,11mogelijk. Omdat licht wordt verstrooid door ondoorzichtige lipiden en gezien het hoge lipidengehalte van hersenweefsel, is het afbeelden van neuronale populaties voornamelijk beperkt tot dunne secties of heeft het vertrouwd op geavanceerde microscropy-technieken (bijv. Confocale, multi-foton en lichtbladmicroscopie) om diepe structuren in beeld te brengen. Deze inspanningen zijn echter sterk versterkt door de vooruitgang in weefselreinigingstechnieken. Clear Lipid-exchange Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/immunostaining/in situ hybridization-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) is zo'n techniek, waarbij weefsels van belang worden doordrenkt met hydrogelmonomeren (acrylamide en bis-acrylamide) en vervolgens worden gewassen met detergentia12. De hydrogelmonomeren hybridiseren om een stabiele 3D-hydrogelsteiger te creëren die optisch transparant is en doorlaatbaar voor macromolecuullabels. Nucleïnezuren en eiwitten worden binnen de gehybridiseerde matrix gehouden, terwijl lipiden worden verwijderd door de wasbeurten van het wasmiddel(figuur 1). Dit resulteert in een stabiel weefsel dat stijf genoeg is om de oorspronkelijke vorm en oriëntatie van cellen en niet-lipidemoleculen te behouden, terwijl het optisch transparant genoeg is om gemakkelijk diepe structuren met hoge resolutie in beeld te brengen. Dit behoud van weefselstructuur en oriëntatie maakt het mogelijk om dikke plakken af te beelden, waardoor cel-tot-celverbindingen en ruimtelijke relaties behouden blijven. Bovendien, omdat de locatie en beschikbaarheid van eiwitten en nucleïnezuren tijdens het clearingproces wordt gehandhaafd, kunnen geklaarde weefsels op expressie gebaseerde markers bevatten, evenals exogene labels. CLARITY leent zich dus als een krachtige methode voor het in beeld brengen van grote hoeveelheden diepe hersenstructuren en de verbindingen tussen deze structuren met hoge resolutie.
Het gebruik van CLARITY verbetert de benaderingen voor het in beeld brengen van neuronale populaties aanzienlijk. Deze techniek is vooral bedreven in het genereren van grote hoeveelheden beeldgegevens. CLARITY werkt goed met meerdere vormen van op eiwitten gebaseerde fluorescentie. Dit protocol maakt gebruik van een lentivirale benadering om cellen spaarzaam te labelen met EGFP en tdTomato; transgene reporter-allelen die tdTomato of EGFP tot expressie brengen om cellen voor reconstructie te labelen, zijn echter routinematig gebruikt. Het is belangrijk om een fluorofoor te kiezen die zowel fotostabiel als helder is (bijv. EGFP of tdTomato). Bovendien levert het gebruik van een sterke promotor om de fluorofoor uit te drukken een superieur contrast en beeldkwaliteit op. De nadelen van deze techniek ontstaan omdat het goed analyseren van deze grote hoeveelheid data zowel arbeids- als tijdsintensief kan zijn. Gespecialiseerde microscopen kunnen helpen de doorvoer te verbeteren en de werklast te verminderen. Het bouwen, bezitten en / of bedienen van geavanceerde microscopen is echter vaak onbetaalbaar voor veel laboratoria. Dit werk presenteert een hoge doorvoer, relatief snelle en eenvoudige methode om grote hoeveelheden neuraal weefsel met hoge resolutie te visualiseren met behulp van CLARITY-weefselzuivering van grote secties, gecombineerd met standaard confocale microscopie. Dit protocol beschrijft deze aanpak door middel van de volgende stappen: 1) het ontleden en voorbereiden van het neurale weefsel, 2) het opruimen van het weefsel, 3) het monteren van het weefsel, 4) het in beeld brengen van de voorbereide plakjes en 5) het verwerken van volledige plakbeelden met behulp van microscopie visualisatiesoftware reconstructie en analyse(Figuur 2). Deze inspanningen resulteren in beelden met een hoge resolutie die kunnen worden gebruikt om populaties van neuronen, neuronale verbindingspatronen, 3D-dendritische morfologie, dendritische wervelkolomrijkdom en morfologie en moleculaire expressiepatronen in intact hersenweefsel te analyseren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 1&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide (No-Bis)</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoretic Tissue Clearing Solution</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2158-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel Solution Kit</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C1310X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case</td>
			<td>fisher</td>
			<td>MT21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044</td>
			<td>Wako</td>
			<td>925-41020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-CLARITY Polymerization System</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-CLARITY Tissue Clearing System II</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C30001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and quantification of intact neuronal dendrites via clarity tissue clearing

Hersenactiviteit, de elektrochemische signalen die tussen neuronen worden doorgegeven, wordt bepaald door de connectiviteitspatronen van neuronale netwerken en door de morfologie van processen en substructuren binnen deze neuronen. Als zodanig is veel van wat bekend is over de hersenfunctie ontstaan naast ontwikkelingen in beeldvormingstechnologieën die meer inzicht geven in hoe neuronen zijn georganiseerd en verbonden in de hersenen. Verbeteringen in het opruimen van weefsel hebben beeldvorming met hoge resolutie van dikke hersenplakken mogelijk gemaakt, waardoor morfologische reconstructie en analyses van neuronale substructuren, zoals dendritische priëlen en stekels, mogelijk zijn. Tegelijkertijd biedt de vooruitgang in beeldverwerkingssoftware methoden om snel grote beeldgegevenssets te analyseren. Dit werk presenteert een relatief snelle methode voor het verwerken, visualiseren en analyseren van dikke plakken gelabeld neuraal weefsel met hoge resolutie met behulp van CLARITY-weefselzuivering, confocale microscopie en beeldanalyse. Dit protocol zal inspanningen vergemakkelijken om de connectiviteitspatronen en neuronale morfologieën te begrijpen die gezonde hersenen kenmerken, en de veranderingen in deze kenmerken die zich voordoen in zieke hersentoestanden.

Na beeldacquisitie werd de representatieve celmorfologie geanalyseerd met behulp van ingebedde statistieken en het classificeren van scripts binnen de analysesoftware. De verzamelde gegevens (Figuur 6A) geven aan dat neuron 2 een grotere dendritische structuur heeft met een hogere dichtheid van stekels. Als geheel suggereren de gegevens dat neuron 2 een complexere dendritische structuur heeft in vergelijking met neuron 1. Om dit resultaat te onderbouwen, werd standaard Sholl-analyse uitgevoe...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing at JoVE.com

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

Neuronale dendritische morfologie ligt vaak ten grondslag aan functie. Inderdaad, veel ziekteprocessen die de ontwikkeling van neuronen beïnvloeden, manifesteren zich met een morfologisch fenotype. Dit protocol beschrijft een eenvoudige en krachtige methode voor het analyseren van intacte dendritische priëlen en hun bijbehorende stekels.

Beeldvorming en kwantificering van intacte neuronale dendrieten via CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

Dit protocol stelt onderzoekers in staat om belangrijke vragen te beantwoorden over neuronale patronen van connectiviteit en ruimtelijke organisatie die ten grondslag liggen aan de functie binnen een circuit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het visualisatie mogelijk maakt van neuronale morfologieën die zich diep in intact driedimensionaal weefsel bevinden. Deze methode is eenvoudig en dus gemakkelijk reproduceerbaar.Beginnende experimentatoren moeten zich comfortabel voelen bij het uitvoeren van deze techniek. Het is noodzakelijk om een duidelijk weefselmonster te hebben om gegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen. De visuele demonstratie van geschikte weefselhelderheid en clearingtechnieken zal gemakkelijk reproduceerbare resultaten mogelijk maken.Plaats om te beginnen het hydrogel-ondergedompelde hersenweefsel gedurende drie uur in een vacuümincubator bij 37 graden Celsius met min 90 kilopascal vacuüm. Laat de bovenkant van de buis losgeschroefd zodat het vacuüm zich goed kan vormen. Was het doekje met PBS gedurende 10 minuten op kamertemperatuur met zacht schudden.Plaats het gepolymeriseerde weefselmonster in de elektroforesekamer en houd de oriëntatie van het weefsel in de kamer bij. Vul de kamer en het reservoir met de meegeleverde elektroforese SDS-buffer. Voer het monster uit op 70 volt, één ampère en 35 graden Celsius met constante stroom gedurende ongeveer twee uur per milliliter weefsel.Controleer het monster regelmatig op voldoende opruiming van hersenweefsel door het uit de kamer te verwijderen en in dezelfde richting te vervangen. Nadat het monster is opgeruimd, wast u het 's nachts in PBS op kamertemperatuur en vervangt u de PBS zo vaak mogelijk door verse PBS. Na de laatste wasbeurt in PBS, was het weefsel gedurende vijf minuten drie keer in gedeioniseerd water op kamertemperatuur.Het weefsel wordt ondoorzichtig en kan uitzetten. Incubeer het weefsel in de refractieve index matching oplossing gedurende ten minste vier uur bij kamertemperatuur. Bouw tijdens de incubatie een geschikte behuizingskamer om het monster in beeld te geven.Begin met het gebruik van een glazen schuif als basis voor montage, leg vervolgens rubberen of plastic afstandhouders neer en bevestig ze met superlijm, zorg ervoor dat er geen gaten zijn. Plaats het heldere weefsel in de montagekamer die vooraf is gevuld met een oplossing voor het matchen van brekingsindexen. Monteer het weefsel stevig door er een glazen afdekplaat op te leggen en deze af te dichten met nagellak.Stel dit weefsel voor door een druppel brekingsindex die overeenkomt met de montageoplossing direct op het glas toe te voegen. Om een grote weefselbeeldvormingskamer te bouwen voor weefsels met een dikte van meer dan vijf millimeter, gebruikt u een glazen schaal van 10 centimeter met een hoge wand. Plaats een conische buis van 50 milliliter in het midden en zorg ervoor dat de diameter van de buis groot genoeg is om de loop van de gebruikte objectieflens te accepteren.Maak 3% agarose in water en giet het in de ruimte tussen de glazen schaal en de conische buis en laat het vervolgens een uur afkoelen. Dit vormt een ring van vaste agarose. Hecht het weefsel stevig aan de onderkant van de kamer met behulp van superlijm en vul de kamer met een brekingsindex-bijpassende oplossing, die kan beginnen te polymeriseren tenzij bewaard uit lucht en opgeslagen bij vier graden Celsius.Verkrijg het beeld met behulp van een confocale microscoop. Schakel alle relevante beeldapparatuur in. Plaats het monster op het podium.Benader de onderdompelingsmedia zorgvuldig met het doel en vorm een continue kolom van media. Zoek met behulp van epifluorescentie een geschikt beeldvormingsveld. Begin met het instellen van de instellingen voor resolutie en scansnelheid.Als u een confocale microscoop afbeeldt, sluit u het gaatje volledig om het kleinste optische gedeelte en dus de beste Z-resolutie te verkrijgen. Verhoog geleidelijk het laservermogen of de sensorverkrachting totdat een geschikt beeld wordt verkregen met een hoge signaal-ruisverhouding. Als u standaard EGFP of tdTomato tweekleurenbeeldvorming gebruikt, stelt u de instellingen voor lichtverzameling in.Stel de Z-stack parameters in op basis van het waargenomen begin- en eindpunt van het weefsel. Stel de stapgrootte in op basis van de gewenste Z-resolutie. Kleinere stapgroottes leveren een grotere Z-resolutie op, maar kunnen leiden tot het bleken van monsters.Wanneer u tevreden bent met de instellingen voor beeldacquisitie, verwerft u de afbeelding. Zorg ervoor dat het beeld een hoge signaal-ruisverhouding heeft en duidelijke grenzen van structuren vertoont. Na beeldacquisitie werd de representatieve celmorfologie geanalyseerd met behulp van ingebedde statistieken en het classificeren van scripts binnen de analysesoftware.De verzamelde gegevens weerspiegelen dat Neuron 2 een grotere dan dendritische structuur heeft met een hogere dichtheid van stekels in vergelijking met Neuron 1. Om dit resultaat te onderbouwen, werd standaard Scholl-analyse uitgevoerd, die bevestigt dat Neuron 2 dendritisch complexer is dan Neuron 1, zoals aangegeven door het toegenomen aantal Scholl-kruispunten op 50 tot 100 micrometer van de soma. Neuron 1 bevat een groter deel van de stekels met meer filopodia-achtige vormen en is een onvolgroeid wervelkolomsubtype.Stekels met gedefinieerde hoofden, paddenstoelstekels genoemd, bevatten waarschijnlijk meer ontwikkelde en volwassen synapsen. Neuron 2 is dus volwassener met een hogere dichtheid van volwassen stekels. Na het opruimen kunnen de weefselbrokken worden gekleurd met behulp van traditionele immunohistochemie.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Intact Histologische Karakterisering van Brain-geïmplanteerde Microdevices en het omringende weefsel

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Beeldvorming Serotonerge vezels in de muis Spinal Cord Met behulp van de DUIDELIJKHEID / CUBIC Techniek

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Optische Clearing van de Muis centrale zenuwstelsel met passieve DUIDELIJKHEID

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Langdurige incubatie van Acute neuronaal weefsel voor elektrofysiologie en calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Twee-foton Calcium Imaging in neuronale Dendrites in hersenen plakjes

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Nieuwe passieve methoden voor de snelle productie van optische transparantie in hele CNS weefsel wissen

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy

Controle van de neuronale overleven via longitudinale fluorescentie microscopie

Standard cytotoxicity assays, which require the collection of lysates or fixed cells at multiple time points, have limited sensitivity and capacity to ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Een hydrofobe weefselopruimingsmethode voor rattenhersenweefsel

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Volwassen Drosophila melanogaster voorbereiden op whole brain imaging tijdens gedrags- en stimulireacties

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

Immunostaining van Whole-Mount Retinas met de CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...