Name: imaging and quantification of intact neuronal dendrites via clarity tissue clearing
Uploaded: 2021-04-20T15:00:00
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Nous tenons à remercier le noyau viral NRDDC de l’Institut neurologique Jan et Dan Duncan pour avoir produit les AAV et les lentivirus utilisés dans ces expériences. De plus, nous tenons à remercier le Baylor College of Medicine Center for Comparative Medicine pour l’élevage de souris et l’entretien général des souris utilisées. Nous tenons à remercier l’American Heart Association pour son soutien sous le numéro de bourse 20PRE35040011, et BRASS: Baylor Research Advocates for Student Scientists pour leur soutien (PJH). Enfin, nous tenons à remercier Logos d’avoir fourni à notre laboratoire le système de nettoyage des tissus électrophorétiques Logos X-Clarity.

Le protocole suivant suit toutes les directives en matière de soins aux animaux pour le Baylor College of Medicine.
1. Dissection et préparation des tissus
<ol><li>Euthanasier la souris avec un surdosage d’isoflurane en plaçant la souris dans un récipient fermé avec une serviette imbibée d’isoflurane (ou par d’autres moyens approuvés par l’IUCAC).</li>
	<li>Perfuser l’animal de manière transcardique à l’aide d’une aiguille de 25 G avec 10 mL de PBS glacé, suivie de 10...

<ol>
	<li>Abbott, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mind+of+a+mouse.">The Mind of a mouse.</a> Cell. 182 (6), 1372-1376 (2020).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex.">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), (2015).</li><li>Winnubst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+1,000+projection+neurons+reveals+new+cell+types+and+organization+of+long-range+connectivity+in+the+mouse+brain.">Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain.</a> Cell. 179 (1), 268-281 (2019).</li><li>Araya, R., Vogels, T. P., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+spine+neck+changes+are+correlated+with+synaptic+strength.">Activity-dependent dendritic spine neck changes are correlated with synaptic strength.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (28), (2014).</li><li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+dendritic+spines.">Structural plasticity of dendritic spines.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).</li><li>Mart&#237;nez-Cerde&#241;o, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrite+and+spine+modifications+in+autism+and+related+neurodevelopmental+disorders+in+patients+and+animal+models.">Dendrite and spine modifications in autism and related neurodevelopmental disorders in patients and animal models.</a> Developmental Neurobiology. 77 (4), 393-404 (2017).</li><li>Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+and+imaging+technologies+for+circuit-based+neuroanatomy.">Molecular genetics and imaging technologies for circuit-based neuroanatomy.</a> Nature. 461 (7266), 900-907 (2009).</li><li>Kim, E. H., Chin, G., Rong, G., Poskanzer, K. E., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probes+for+neurobiological+sensing+and+imaging.">Optical probes for neurobiological sensing and imaging.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (5), 1023-1032 (2018).</li><li>Weissman, T. A., Pan, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainbow:+New+resources+and+emerging+biological+applications+for+multicolor+genetic+labeling+and+analysis.">Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis.</a> Genetics. 199 (2), 293-306 (2014).</li><li>Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+vectors+in+neuroscience+research.">Adeno-associated viral vectors in neuroscience research.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 69-82 (2020).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+diversity+in+development+and+disease.">Motor neuron diversity in development and disease.</a> Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).</li><li>Ledda, F., Paratcha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+dendritic+arbor+patterning.">Mechanisms regulating dendritic arbor patterning.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (24), 4511-4537 (2017).</li><li>Falougy, H. E., Filova, B., Ostatnikova, D., Bacova, Z., Bakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+morphology+alterations+in+autism+and+possible+role+of+oxytocin.">Neuronal morphology alterations in autism and possible role of oxytocin.</a> Endocrine Regulations. 53 (1), 46-54 (2019).</li></ol>

Avant l’avènement des techniques contemporaines de nettoyage des tissus, l’étude de la morphologie neuronale consistait en une coupe, une imagerie et une reconstruction de sections très minces adjacentes. L’utilisation de la clairière électrophorétique des tissus en combinaison avec l’imagerie confocale fournit une vue dégagée de la morphologie neuronale complète. Des arbres dendritiques intacts jusqu’au plus petit bouton synaptique, l’imagerie et la quantification de la morphologie neuronale n’ont...

Comprendre l’organisation spatiale, les modèles de connectivité et la morphologie de structures biologiques tridimensionnelles complexes est essentiel pour délimiter les fonctions de cellules et de tissus spécifiques. Cela est particulièrement vrai en neurosciences, dans lesquelles des efforts considérables ont été consacrés à la construction de cartes neuroanatomiques à haute résolution du système nerveux central1,2. Un examen attentif des neurones qui composent ces cartes donne des morphologies variées, avec des connexions et des emplacements qui reflètent la fonction de ces divers ensembles de neurones3,4. De plus, l’étude des structures subcellulaires, en particulier des épines dendritiques, peut informer la maturité des synapses, reflétant ainsi les processus de développement et les états de maladie neurologique5,6,7. Ainsi, les approches qui améliorent la résolution et le débit d’imagerie sont essentielles pour mieux comprendre le fonctionnement du cerveau à toutes les échelles.
Des progrès récents ont élargi la boîte à outils moléculaire et génétique pour marquer et manipuler les populations de neurones. Le développement de nouveaux marqueurs fluorescents, combiné à de nouvelles méthodes d’introduction de ces marqueurs dans les neurones, permet un marquage différentiel des populations de neurones en interaction au sein du même échantillon animal ou cérébral8,9,10,11. Étant donné que la lumière est diffusée par des lipides opaques et compte tenu de la teneur élevée en lipides des tissus cérébraux, l’imagerie des populations neuronales a été principalement limitée à des sections minces ou s’est appuyée sur des techniques avancées de microscropy (par exemple, la microscopie confocale, multiphotonique et à feuille de lumière) pour imager les structures profondes. Cependant, ces efforts ont été grandement renforcés par les progrès des techniques de nettoyage des tissus. Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/immunostaining/insitu hybridization-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) est l’une de ces techniques, dans laquelle les tissus d’intérêt sont infusés avec des monomères d’hydrogel (acrylamide et bis-acrylamide) puis lavés avec des détergents12. Les monomères d’hydrogel s’hybrident pour créer un échafaudage d’hydrogel 3D stable, optiquement transparent et perméable aux étiquettes de macromolécules. Les acides nucléiques et les protéines sont maintenus dans la matrice hybridée, tandis que les lipides sont éliminés par les lavages détergents (Figure 1). Il en résulte un tissu stable suffisamment rigide pour maintenir la forme et l’orientation d’origine des cellules et des molécules non lipidiques, tout en faisant preuve d’une transparence optique suffisante pour imager facilement des structures profondes à haute résolution. Ce maintien de la structure et de l’orientation des tissus permet l’imagerie de tranches épaisses, préservant ainsi les connexions de cellule à cellule et les relations spatiales. De plus, comme l’emplacement et la disponibilité des protéines et des acides nucléiques sont maintenus pendant le processus de nettoyage, les tissus nettoyés sont capables de contenir des marqueurs basés sur l’expression, ainsi que des étiquettes exogènes. Ainsi, CLARITY se prête comme une méthode puissante pour imager de grandes quantités de structures cérébrales profondes et les connexions entre ces structures à haute résolution.
L’utilisation de CLARITY améliore considérablement les approches d’imagerie des populations neuronales. Cette technique est particulièrement efficace pour générer de grandes quantités de données d’imagerie. CLARITY fonctionne bien avec de multiples formes de fluorescence à base de protéines. Ce protocole utilise une approche basée sur lentiviral pour étiqueter de manière éparse les cellules avec EGFP et tdTomato; cependant, des allèles rapporteurs transgéniques exprimant tdTomato ou EGFP pour étiqueter les cellules à reconstruire ont été couramment utilisés. Il est important de choisir un fluorophore qui est à la fois photo-stable et brillant (par exemple, EGFP ou tdTomato). De plus, l’utilisation d’un promoteur puissant pour exprimer le fluorophore donne un contraste et une qualité d’image supérieurs. Les inconvénients de cette technique surviennent car l’analyse correcte de cette grande quantité de données peut prendre à la fois beaucoup de travail et de temps. Les microscopes spécialisés peuvent aider à améliorer le débit et à réduire la charge de travail. Cependant, la construction, la possession et / ou l’exploitation de microscopes avancés sont souvent prohibitifs pour de nombreux laboratoires. Ce travail présente une méthode simple, à haut débit, relativement rapide et simple de visualisation de grandes quantités de tissu neural à haute résolution en utilisant le nettoyage tissulaire CLARITY de grandes sections, combiné à la microscopie confocale standard. Ce protocole décrit cette approche à travers les étapes suivantes : 1) disséquer et préparer le tissu neural, 2) nettoyer le tissu, 3) monter le tissu, 4) imager les tranches préparées et 5) traiter des images de tranches complètes à l’aide de la reconstruction et de l’analyse du logiciel de visualisation par microscopie(Figure 2). Ces efforts aboutissent à des images à haute résolution qui peuvent être utilisées pour analyser les populations de neurones, les modèles de connexion neuronale, la morphologie dendritique 3D, l’abondance et la morphologie de la colonne vertébrale dendritique et les modèles d’expression moléculaire dans les tissus cérébraux intacts.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 1&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide (No-Bis)</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoretic Tissue Clearing Solution</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2158-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel Solution Kit</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C1310X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case</td>
			<td>fisher</td>
			<td>MT21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044</td>
			<td>Wako</td>
			<td>925-41020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-CLARITY Polymerization System</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-CLARITY Tissue Clearing System II</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C30001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and quantification of intact neuronal dendrites via clarity tissue clearing

L’activité cérébrale, les signaux électrochimiques transmis entre les neurones, est déterminée par les modèles de connectivité des réseaux neuronaux et par la morphologie des processus et des sous-structures au sein de ces neurones. En tant que tel, une grande partie de ce que l’on sait sur le fonctionnement du cerveau est apparue parallèlement aux développements des technologies d’imagerie qui permettent de mieux comprendre comment les neurones sont organisés et connectés dans le cerveau. Les améliorations apportées à l’élimination des tissus ont permis l’imagerie à haute résolution de tranches cérébrales épaisses, facilitant la reconstruction morphologique et l’analyse des sous-structures neuronales, telles que les tonnelles dendritiques et les épines. En parallèle, les progrès des logiciels de traitement d’images fournissent des méthodes d’analyse rapide de grands ensembles de données d’imagerie. Ce travail présente une méthode relativement rapide de traitement, de visualisation et d’analyse d’épaisses tranches de tissu neural marqué à haute résolution à l’aide de la clairière tissulaire CLARITY, de la microscopie confocale et de l’analyse d’images. Ce protocole facilitera les efforts visant à comprendre les modèles de connectivité et les morphologies neuronales qui caractérisent les cerveaux sains, ainsi que les changements de ces caractéristiques qui surviennent dans les états cérébraux malades.

Après l’acquisition de l’image, la morphologie cellulaire représentative a été analysée à l’aide de statistiques intégrées et de scripts de classification dans le logiciel d’analyse. Les données recueillies(Figure 6A)reflètent que le neurone 2 a une structure dendritique plus grande avec une densité plus élevée d’épines. Dans l’ensemble, les données suggèrent que le neurone 2 a une structure dendritique plus complexe que le neurone 1. Pour étayer ce résultat, un...

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Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

La morphologie dendritique neuronale sous-tend souvent la fonction. En effet, de nombreux processus pathologiques qui affectent le développement des neurones se manifestent par un phénotype morphologique. Ce protocole décrit une méthode simple et puissante pour analyser les tonnelles dendritiques intactes et leurs épines associées.

Imagerie et quantification de dendrites neuronales intactes via CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

Ce protocole permettra aux chercheurs de répondre à des questions importantes sur les modèles neuronaux de connectivité et d’organisation spatiale qui sous-tendent la fonction au sein d’un circuit. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de visualiser les morphologies neuronales situées profondément dans des tissus tridimensionnels intacts. Cette méthode est simple et donc facilement reproductible.Les expérimentateurs pour la première fois devraient être à l’aise d’exécuter cette technique. Il est impératif d’avoir un échantillon de tissu clair afin d’obtenir des données de haute qualité. La démonstration visuelle de la clarté tissulaire appropriée et des techniques de nettoyage permettra des résultats facilement reproductibles.Pour commencer, placez le tissu cérébral immergé dans l’hydrogel dans un incubateur à vide pendant trois heures à 37 degrés Celsius avec moins 90 kilopascal de vide. Laissez le dessus du tube dévissé pour permettre au vide de se former correctement. Lavez le mouchoir avec du PBS pendant 10 minutes à température ambiante en agitant doucement.Placez l’échantillon de tissu polymérisé dans la chambre d’électrophorèse, en gardant une trace de l’orientation du tissu dans la chambre. Remplissez la chambre et le réservoir avec le tampon SDS d’électrophorèse fourni. Exécutez l’échantillon à 70 volts, un ampère et 35 degrés Celsius avec un courant constant pendant environ deux heures par millilitre de tissu.Vérifiez périodiquement l’échantillon pour un dégagement suffisant du tissu cérébral en le retirant de la chambre et en le remplaçant dans la même orientation. Une fois que l’échantillon a fini de se nettoyer, lavez-le dans du PBS pendant la nuit à température ambiante, en remplaçant le PBS par du PBS frais aussi souvent que possible. Après le lavage final dans pbS, lavez le tissu pendant cinq minutes dans de l’eau désionisée à température ambiante trois fois.Le tissu deviendra opaque et pourra se dilater. Incuber le tissu dans la solution correspondant à l’indice de réfraction pendant au moins quatre heures à température ambiante. Pendant l’incubation, construisez une chambre de logement appropriée pour imager l’échantillon.Commencez par utiliser une glissière en verre comme base de montage, puis posez des entretoises en caoutchouc ou en plastique et fixez-les avec de la super colle, en vous assurant qu’il n’y a pas de trous. Placez le tissu clair dans la chambre de montage préremplie avec une solution d’appariement de l’indice de réfraction. Montez solidement le tissu en plaçant un couvercle en verre sur le dessus et en le scellant avec du vernis à ongles.Imagez ce tissu en ajoutant une goutte de solution de montage correspondant à l’indice de réfraction directement sur le verre. Pour construire une grande chambre d’imagerie tissulaire pour les tissus de plus de cinq millimètres d’épaisseur, utilisez un plat en verre de 10 centimètres avec une paroi haute. Placez un tube conique de 50 millilitres au centre, en vous assurant que le diamètre du tube est suffisamment grand pour accepter le canon de l’objectif utilisé.Faites 3% d’agarose dans l’eau et versez-la dans l’espace entre le plat en verre et le tube conique, puis laissez-la refroidir pendant une heure. Cela formera un anneau d’agarose solide. Collez solidement le tissu au fond de la chambre à l’aide de super colle et remplissez la chambre avec une solution correspondant à l’indice de réfraction, qui peut commencer à polymériser à moins d’être préservée de l’air et stockée à quatre degrés Celsius.Acquérir l’image à l’aide d’un microscope confocal. Rallumez tous les équipements d’imagerie appropriés. Placez l’échantillon sur la scène.Approchez soigneusement les médias d’immersion avec l’objectif et formez une colonne continue de médias. En utilisant l’épifluorescence, trouvez un champ d’imagerie approprié. Commencez par définir les paramètres de résolution et de vitesse d’analyse.Si vous imaginez à l’aide d’un microscope confocal, fermez complètement le sténopé pour obtenir la plus petite section optique et donc la meilleure résolution Z. Augmentez progressivement la puissance du laser ou le gain du capteur jusqu’à ce qu’une image appropriée soit obtenue avec un rapport signal/bruit élevé. Si vous utilisez l’imagerie bicolore EGFP ou tdTomato standard, définissez les paramètres de collecte de lumière.Définissez les paramètres de la pile Z en fonction des points de départ et d’extrémité observés du tissu. Définissez la taille du pas en fonction de la résolution Z souhaitée. Des tailles d’étape plus petites donneront une plus grande résolution Z, mais peuvent entraîner un blanchiment de l’échantillon.Lorsque vous êtes satisfait des paramètres d’acquisition d’image, acquérez l’image. Assurez-vous que l’image a un rapport signal/bruit élevé et montre des limites distinctes des structures. Après l’acquisition de l’image, la morphologie cellulaire représentative a été analysée à l’aide de statistiques intégrées et de scripts de classification dans le logiciel d’analyse.Les données recueillies reflètent que le neurone 2 a une structure plus grande que dendritique avec une densité d’épines plus élevée que le neurone 1. Pour étayer ce résultat, une analyse scholl standard a été effectuée, qui affirme que le neurone 2 est plus complexe dendritiquement que le neurone 1, comme en témoigne le nombre accru d’intersections de Scholl à 50 à 100 micromètres du soma. Le neurone 1 contient une plus grande proportion d’épines avec des formes plus filopodia et est un sous-type de colonne vertébrale immature.Les épines avec des têtes définies, appelées épines de champignons, contiennent probablement des synapses plus développées et matures. Ainsi, le neurone 2 est plus mature avec une densité plus élevée d’épines matures. Après nettoyage, les morceaux de tissu peuvent être colorés en utilisant l’immunohistochimie traditionnelle.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Intact Caractérisation histologique du cerveau Microdevices-implantées et les tissus environnants

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Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Clearing optique du système nerveux central de souris utilisant CLARITY passive

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

L&#39;incubation prolongée de aiguë Neuronal tissus pour électrophysiologie et Calcium-imagerie

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

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