Name: imaging and quantification of intact neuronal dendrites via clarity tissue clearing
Uploaded: 2021-04-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing at JoVE.com

Wir möchten dem viralen Kern NRDDC am Jan and Dan Duncan Neurological Institute für die Herstellung der in diesen Experimenten verwendeten AAVs und Lentiviren danken. Darüber hinaus möchten wir uns beim Baylor College of Medicine Center for Comparative Medicine für die Maushaltung und die allgemeine Wartung der verwendeten Mäuse bedanken. Wir danken der American Heart Association für ihre Unterstützung unter der Preisnummer 20PRE35040011 und BRASS: Baylor Research Advocates for Student Scientists für ihre Unterstützung (PJH). Abschließend möchten wir logos dafür danken, dass sie unserem Labor das elektrophoretische Gewebereinigungssystem Logos X-Clarity zur Verfügung gestellt haben.

Das folgende Protokoll folgt allen Tierpflegerichtlinien für das Baylor College of Medicine.
1. Dissektion und Gewebevorbereitung
<ol><li>Die Maus mit einer Überdosis Isofluran einschläfern, indem Sie die Maus in einen geschlossenen Behälter mit einem mit Isofluran getränkten Handtuch legen (oder mit anderen IUCAC-zugelassenen Mitteln).</li>
	<li>Perfundieren Sie das Tier transkardiell mit einer 25 G Nadel mit 10 ml eiskaltem PBS, gefolgt von 10 ml 4% PFA.</li>
	<li>Sezieren Sie die Geh...

<ol>
	<li>Abbott, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mind+of+a+mouse.">The Mind of a mouse.</a> Cell. 182 (6), 1372-1376 (2020).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex.">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), (2015).</li><li>Winnubst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+1,000+projection+neurons+reveals+new+cell+types+and+organization+of+long-range+connectivity+in+the+mouse+brain.">Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain.</a> Cell. 179 (1), 268-281 (2019).</li><li>Araya, R., Vogels, T. P., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+spine+neck+changes+are+correlated+with+synaptic+strength.">Activity-dependent dendritic spine neck changes are correlated with synaptic strength.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (28), (2014).</li><li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+dendritic+spines.">Structural plasticity of dendritic spines.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).</li><li>Mart&#237;nez-Cerde&#241;o, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrite+and+spine+modifications+in+autism+and+related+neurodevelopmental+disorders+in+patients+and+animal+models.">Dendrite and spine modifications in autism and related neurodevelopmental disorders in patients and animal models.</a> Developmental Neurobiology. 77 (4), 393-404 (2017).</li><li>Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+and+imaging+technologies+for+circuit-based+neuroanatomy.">Molecular genetics and imaging technologies for circuit-based neuroanatomy.</a> Nature. 461 (7266), 900-907 (2009).</li><li>Kim, E. H., Chin, G., Rong, G., Poskanzer, K. E., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probes+for+neurobiological+sensing+and+imaging.">Optical probes for neurobiological sensing and imaging.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (5), 1023-1032 (2018).</li><li>Weissman, T. A., Pan, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainbow:+New+resources+and+emerging+biological+applications+for+multicolor+genetic+labeling+and+analysis.">Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis.</a> Genetics. 199 (2), 293-306 (2014).</li><li>Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+vectors+in+neuroscience+research.">Adeno-associated viral vectors in neuroscience research.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 69-82 (2020).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+diversity+in+development+and+disease.">Motor neuron diversity in development and disease.</a> Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).</li><li>Ledda, F., Paratcha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+dendritic+arbor+patterning.">Mechanisms regulating dendritic arbor patterning.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (24), 4511-4537 (2017).</li><li>Falougy, H. E., Filova, B., Ostatnikova, D., Bacova, Z., Bakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+morphology+alterations+in+autism+and+possible+role+of+oxytocin.">Neuronal morphology alterations in autism and possible role of oxytocin.</a> Endocrine Regulations. 53 (1), 46-54 (2019).</li></ol>

Vor dem Aufkommen zeitgenössischer Gewebereinigungstechniken bestand das Studium der neuronalen Morphologie aus zeitintensiven Schnitten, Bildgebung und Rekonstruktion benachbarter sehr dünner Schnitte. Die elektrophoretische Gewebereinigung in Kombination mit konfokaler Bildgebung bietet einen ungehinderten Blick auf die gesamte neuronale Morphologie. Von intakten dendritischen Bäumen bis hin zum kleinsten synaptischen Bouton war die Bildgebung und Quantifizierung der neuronalen Morphologie noch nie so praktikabel wi...

Das Verständnis der räumlichen Organisation, der Konnektivitätsmuster und der Morphologie komplexer dreidimensionaler biologischer Strukturen ist für die Abgrenzung der Funktionen bestimmter Zellen und Gewebe unerlässlich. Dies gilt insbesondere für die Neurowissenschaften, in denen enorme Anstrengungen unternommen wurden, um hochauflösende neuroanatomische Karten des zentralen Nervensystems zu erstellen1,2. Eine genaue Untersuchung der Neuronen, aus denen diese Karten bestehen, ergibt unterschiedliche Morphologien mit Verbindungen und Orten, die die Funktion dieser verschiedenen Neuronensätze widerspiegeln3,4. Darüber hinaus kann die Untersuchung subzellulärer Strukturen, insbesondere dendritischer Stacheln, die Reife von Synapsen beeinflussen und dabei Entwicklungsprozesse und neurologische Krankheitszuständewiderspiegeln 5,6,7. Daher sind Ansätze, die die Bildauflösung und den Durchsatz verbessern, unerlässlich, um die Gehirnfunktion auf allen Ebenen besser zu verstehen.
Jüngste Fortschritte haben das molekulare und genetische Toolkit zur Markierung und Manipulation von Populationen von Neuronen erweitert. Die Entwicklung neuer fluoreszierender Marker, kombiniert mit neuen Methoden zur Einführung dieser Marker in Neuronen, ermöglicht eine differentielle Markierung von Populationen interagierender Neuronen innerhalb derselben Tier- oder Gehirnprobe8,9,10,11. Da Licht durch undurchsichtige Lipide gestreut wird und angesichts des hohen Lipidgehalts des Hirngewebes die Bildgebung neuronaler Populationen in erster Linie auf dünne Schnitte beschränkt war oder sich auf fortschrittliche mikroskropige Techniken (z. B. konfokale, Multiphotonen- und Lichtblattmikroskopie) stützte, um tiefe Strukturen abzubilden. Diese Bemühungen wurden jedoch durch Fortschritte bei den Gewebereinigungstechniken stark unterstützt. Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/immunostaining/in situ hybridization-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) ist eine solche Technik, bei der interessante Gewebe mit Hydrogelmonomeren (Acrylamid und Bisacrylamid) infundiert und anschließend mit Reinigungsmitteln gewaschen werden12. Die Hydrogel-Monomere hybridisieren zu einem stabilen 3D-Hydrogel-Gerüst, das optisch transparent und durchlässig für Makromolekül-Etiketten ist. Nukleinsäuren und Proteine bleiben innerhalb der hybridisierten Matrix erhalten, während Lipide durch die Waschmittelwäschen entfernt werden (Abbildung 1). Dies führt zu einem stabilen Gewebe, das starr genug ist, um die ursprüngliche Form und Ausrichtung von Zellen und Nicht-Lipidmolekülen beizubehalten, während es optisch transparent genug ist, um tiefe Strukturen mit hoher Auflösung abzubilden. Diese Aufrechterhaltung der Gewebestruktur und -orientierung ermöglicht die Abbildung dicker Scheiben, wodurch Zell-zu-Zell-Verbindungen und räumliche Beziehungen erhalten bleiben. Da die Lage und Verfügbarkeit von Proteinen und Nukleinsäuren während des Clearingprozesses aufrechterhalten wird, können gereinigte Gewebe außerdem expressionsbasierte Marker sowie exogene Markierungen enthalten. Somit eignet sich CLARITY als potente Methode, um große Mengen tiefer Hirnstrukturen und die Verbindungen zwischen diesen Strukturen mit hoher Auflösung abzubilden.
Der Einsatz von CLARITY verbessert die Ansätze zur Bildgebung neuronaler Populationen erheblich. Diese Technik ist besonders geschickt bei der Erzeugung großer Mengen von Bilddaten. CLARITY funktioniert gut mit mehreren Formen der proteinbasierten Fluoreszenz. Dieses Protokoll verwendet einen lentiviral-basierten Ansatz, um Zellen mit EGFP und tdTomato spärlich zu markieren; Transgene Reporterallele, die tdTomato oder EGFP exprimieren, um Zellen für die Rekonstruktion zu markieren, wurden jedoch routinemäßig verwendet. Es ist wichtig, ein Fluorophor zu wählen, das sowohl lichtstabil als auch hell ist (z. B. EGFP oder tdTomato). Darüber hinaus führt die Verwendung eines starken Promotors zur Expression des Fluorophors zu einem überlegenen Kontrast und einer hervorragenden Bildqualität. Die Nachteile dieser Technik ergeben sich, da die richtige Analyse dieser großen Datenmenge sowohl arbeits- als auch zeitintensiv sein kann. Spezialisierte Mikroskope können dazu beitragen, den Durchsatz zu verbessern und die Arbeitsbelastung zu verringern. Der Bau, Besitz und /oder Betrieb fortschrittlicher Mikroskope ist jedoch für viele Labore oft unerschwinglich. Diese Arbeit stellt eine relativ schnelle und einfache Methode mit hohem Durchsatz dar, um große Mengen neuronalen Gewebes mit hoher Auflösung unter Verwendung von CLARITY-Gewebereinigung großer Abschnitte in Kombination mit konfokaler Standardmikroskopie zu visualisieren. Dieses Protokoll beschreibt diesen Ansatz durch die folgenden Schritte: 1) Sezieren und Vorbereiten des Nervengewebes, 2) Reinigen des Gewebes, 3) Mounten des Gewebes, 4) Abbildung der vorbereiteten Scheiben und 5) Verarbeiten von Vollschnittbildern mit Hilfe der Rekonstruktion und Analyse der Mikroskopie-Visualisierungssoftware (Abbildung 2). Diese Bemühungen führen zu hochauflösenden Bildern, die verwendet werden können, um Populationen von Neuronen, neuronale Verbindungsmuster, 3D-dendritische Morphologie, dendritische Wirbelsäulenhäufigkeit und -morphologie sowie molekulare Expressionsmuster in intaktem Hirngewebe zu analysieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 1&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide (No-Bis)</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoretic Tissue Clearing Solution</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2158-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel Solution Kit</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C1310X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case</td>
			<td>fisher</td>
			<td>MT21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044</td>
			<td>Wako</td>
			<td>925-41020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-CLARITY Polymerization System</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-CLARITY Tissue Clearing System II</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C30001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and quantification of intact neuronal dendrites via clarity tissue clearing

Die Gehirnaktivität, die elektrochemischen Signale, die zwischen Neuronen übertragen werden, wird durch die Konnektivitätsmuster neuronaler Netzwerke und durch die Morphologie von Prozessen und Unterstrukturen innerhalb dieser Neuronen bestimmt. Daher ist vieles von dem, was über die Gehirnfunktion bekannt ist, neben Entwicklungen in bildgebenden Technologien entstanden, die weitere Einblicke in die Organisation und Verbindung von Neuronen im Gehirn ermöglichen. Verbesserungen bei der Gewebereinigung haben eine hochauflösende Bildgebung dicker Hirnschnitte ermöglicht, was die morphologische Rekonstruktion und Analyse neuronaler Unterstrukturen wie dendritischer Dorne und Stacheln erleichtert. Gleichzeitig bieten Fortschritte in der Bildverarbeitungssoftware Methoden zur schnellen Analyse großer bildgebender Datensätze. Diese Arbeit stellt eine relativ schnelle Methode zur Verarbeitung, Visualisierung und Analyse dicker Scheiben von markiertem Nervengewebe in hoher Auflösung mit CLARITY-Gewebereinigung, konfokaler Mikroskopie und Bildanalyse vor. Dieses Protokoll wird die Bemühungen erleichtern, die Konnektivitätsmuster und neuronalen Morphologien zu verstehen, die gesunde Gehirne charakterisieren, und die Veränderungen dieser Eigenschaften, die in kranken Gehirnzuständen auftreten.

Nach der Bildaufnahme wurde die repräsentative Zellmorphologie mit Hilfe eingebetteter Statistiken und Klassifikationsskripte innerhalb der Analysesoftware analysiert. Die gesammelten Daten (Abbildung 6A) spiegeln wider, dass Neuron 2 eine größere dendritische Struktur mit einer höheren Dichte an Stacheln aufweist. Insgesamt deuten die Daten darauf hin, dass Neuron 2 im Vergleich zu Neuron 1 eine komplexere dendritische Struktur aufweist. Um dieses Ergebnis zu untermauern, wurde eine Sta...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing at JoVE.com

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

Neuronale dendritische Morphologie liegt oft der Funktion zugrunde. Tatsächlich manifestieren sich viele Krankheitsprozesse, die die Entwicklung von Neuronen beeinflussen, mit einem morphologischen Phänotyp. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und leistungsfähige Methode zur Analyse intakter dendritischer Dornen und der dazugehörigen Stacheln.

Bildgebung und Quantifizierung intakter neuronaler Dendriten mittels CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

Dieses Protokoll wird es den Forschern ermöglichen, wichtige Fragen zu neuronalen Konnektivitätsmustern und räumlicher Organisation zu beantworten, die der Funktion innerhalb eines Schaltkreises zugrunde liegen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Visualisierung neuronaler Morphologien ermöglicht, die sich tief im intakten dreidimensionalen Gewebe befinden. Diese Methode ist unkompliziert und somit leicht reproduzierbar.Erstexperimentatoren sollten sich bei der Durchführung dieser Technik wohl fühlen. Es ist unerlässlich, eine klare Gewebeprobe zu haben, um qualitativ hochwertige Daten zu erhalten. Die visuelle Demonstration geeigneter Gewebeklarheit und Clearing-Techniken ermöglicht leicht reproduzierbare Ergebnisse.Zu Beginn legen Sie das hydrogelgetauchte Hirngewebe für drei Stunden bei 37 Grad Celsius mit minus 90 Kilopascal Vakuum in einen Vakuum-Inkubator. Lassen Sie die Rohroberseite abgeschraubt, damit sich das Vakuum richtig bilden kann. Waschen Sie das Gewebe mit PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln.Legen Sie die polymerisierte Gewebeprobe in die Elektrophoresekammer und verfolgen Sie die Ausrichtung des Gewebes in der Kammer. Füllen Sie die Kammer und das Reservoir mit dem mitgelieferten Elektrophorese-SDS-Puffer. Lassen Sie die Probe bei 70 Volt, einem Ampere und 35 Grad Celsius mit konstantem Strom für etwa zwei Stunden pro Milliliter Gewebe laufen.Überprüfen Sie die Probe regelmäßig auf eine ausreichende Reinigung des Hirngewebes, indem Sie es aus der Kammer entfernen und in der gleichen Ausrichtung ersetzen. Nachdem die Probe fertig geklärt ist, waschen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur in PBS und ersetzen Sie das PBS so oft wie möglich durch frisches PBS. Nach der letzten Wäsche in PBS waschen Sie das Gewebe fünf Minuten lang in deionisiertem Wasser bei Raumtemperatur dreimal.Das Gewebe wird undurchsichtig und kann sich ausdehnen. Inkubieren Sie das Gewebe in der Brechungsindex-Matching-Lösung für mindestens vier Stunden bei Raumtemperatur. Konstruieren Sie während der Inkubation eine geeignete Gehäusekammer, um die Probe abzubilden.Beginnen Sie mit einem Glasschieber als Basis für die Montage, legen Sie dann entweder Gummi- oder Kunststoffabstandhalter ab und sichern Sie sie mit Sekundenkleber, um sicherzustellen, dass keine Löcher vorhanden sind. Legen Sie das durchsichtige Gewebe in die Montagekammer, die mit einer Brechungsindex-Matching-Lösung vorgefüllt ist. Montieren Sie das Gewebe sicher, indem Sie einen Glasdecker darauf legen und mit Nagellack versiegeln.Stellen Sie sich dieses Gewebe vor, indem Sie einen Tropfen Brechungsindex-matching-Montagelösung direkt auf das Glas geben. Um eine große Gewebebildgebungskammer für Gewebe mit einer Dicke von mehr als fünf Millimetern zu konstruieren, verwenden Sie eine 10 Zentimeter große Glasschale mit einer hohen Wand. Platzieren Sie ein konisches 50-Milliliter-Rohr in der Mitte und stellen Sie sicher, dass der Durchmesser des Rohrs groß genug ist, um den Lauf der verwendeten Objektivlinse aufzunehmen.Machen Sie 3% Agarose in Wasser und gießen Sie es in den Raum zwischen der Glasschale und dem konischen Rohr, dann lassen Sie es für eine Stunde abkühlen. Dies wird einen Ring aus fester Agarose bilden. Kleben Sie das Gewebe mit Sekundenkleber sicher auf den Boden der Kammer und füllen Sie die Kammer mit einer Brechungsindex-Matching-Lösung, die zu polymerisieren beginnen kann, es sei denn, sie wird aus der Luft konserviert und bei vier Grad Celsius gelagert.Erfassen Sie das Bild mit einem konfokalen Mikroskop. Schalten Sie alle relevanten Bildgebungsgeräte ein. Stellen Sie die Probe auf die Bühne.Nähern Sie sich den Immersionsmedien vorsichtig mit dem Ziel und bilden Sie eine kontinuierliche Mediensäule. Finden Sie mit Hilfe der Epifluoreszenz ein geeignetes Bildgebungsfeld. Legen Sie zunächst die Einstellungen für Auflösung und Scangeschwindigkeit fest.Bei der Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop schließen Sie das Loch vollständig, um den kleinsten optischen Schnitt und damit die beste Z-Auflösung zu erhalten. Erhöhen Sie allmählich die Laserleistung oder den Sensorgewinn, bis ein geeignetes Bild mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis erhalten wird. Wenn Sie die Standard-EGFP- oder tdTomato-Zweifarbbildgebung verwenden, legen Sie die Einstellungen für die Lichtsammlung fest.Stellen Sie die Z-Stack-Parameter basierend auf den beobachteten Start- und Endpunkten des Gewebes ein. Stellen Sie die Schrittweite basierend auf der gewünschten Z-Auflösung ein. Kleinere Schrittweiten führen zu einer höheren Z-Auflösung, können aber zu einer Probenbleiche führen.Wenn Sie mit den Bildaufnahmeeinstellungen zufrieden sind, erfassen Sie das Bild. Stellen Sie sicher, dass das Bild ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis aufweist und deutliche Grenzen der Strukturen aufweist. Nach der Bildaufnahme wurde die repräsentative Zellmorphologie mit Hilfe eingebetteter Statistiken und Klassifikationsskripte innerhalb der Analysesoftware analysiert.Die gesammelten Daten spiegeln wider, dass Neuron 2 eine größere als dendritische Struktur mit einer höheren Dichte an Stacheln im Vergleich zu Neuron 1 aufweist. Um dieses Ergebnis zu untermauern, wurde eine Standard-Scholl-Analyse durchgeführt, die bestätigt, dass Neuron 2 dendritisch komplexer ist als Neuron 1, was durch die erhöhte Anzahl von Scholl-Schnittpunkten bei 50 bis 100 Mikrometern vom Soma aus angezeigt wird. Neuron 1 enthält einen größeren Anteil an Stacheln mit filopodienartigeren Formen und ist ein unreifer Wirbelsäulensubtyp.Stacheln mit definierten Köpfen, Pilzstacheln genannt, enthalten wahrscheinlich entwickeltere und reifere Synapsen. So ist Neuron 2 reifer mit einer höheren Dichte an reifen Stacheln. Nach der Klärung können die Gewebebrocken mit der traditionellen Immunhistochemie gefärbt werden.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Intact Histologische Charakterisierung von Brain-implantierten Microdevices und des umgebenden Gewebes

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Forschung

Neurowissenschaften

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Serotonerge Fasern im Rückenmark der Maus Mit der CLARITY / CUBIC Technik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Optische Clearing der Maus Zentralnervensystem Passive CLARITY Verwendung

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Längerer Inkubation von Akute neuronales Gewebe für Elektrophysiologie und Calcium-Bildgebung

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Neuartige passiv Clearing Methoden für die schnelle Produktion von optischen Transparenz im gesamten ZNS-Gewebe

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy

Überwachung der neuronalen Überleben über längs-Fluoreszenz-Mikroskopie

Standard cytotoxicity assays, which require the collection of lysates or fixed cells at multiple time points, have limited sensitivity and capacity to ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Eine hydrophobe Gewebereinigungsmethode für Rattenhirngewebe

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Vorbereitung von Adult Drosophila melanogaster für die Bildgebung des gesamten Gehirns während des Verhaltens und der Stimuli-Reaktionen

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

Immunfärbung von Whole-Mount-Netzhäuten mit der CLARITY Tissue Clearing Methode

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...