Name: imaging and quantification of intact neuronal dendrites via clarity tissue clearing
Uploaded: 2021-04-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing at JoVE.com

ברצוננו להודות ל- NRDDC הליבה הנגיפית במכון הנוירולוגי יאן ודן דאנקן על ייצור ה- AAVs וה- lentiviruses המשמשים בניסויים אלה. בנוסף, ברצוננו להודות למרכז ביילור לרפואה השוואתית על גידול עכברים ותחזוקה כללית של העכברים המשמשים. ברצוננו להודות לאיגוד הלב האמריקאי על תמיכתם תחת פרס מספר 20PRE35040011, ו- BRASS: תומכי מחקר ביילור למדעני סטודנטים על תמיכתם (PJH). לבסוף, ברצוננו להודות ללוגואים על שסיפקו למעבדה שלנו את מערכת ניקוי הרקמות האלקטרופורטיות Logos X-Clarity.

הפרוטוקול הבא עוקב אחר כל הנחיות הטיפול בבעלי חיים עבור מכללת ביילור לרפואה.
1. ניתוח והכנת רקמות
<ol><li>המת חסד את העכבר עם מנת יתר של איזופלוראן על ידי הצבת העכבר במיכל סגור עם מגבת ספוגה איזופלוריין (או באמצעים אחרים שאושרו IUCAC).</li>
	<li>לטבול את החיה באופן transcardially באמצעות מחט 2...

<ol>
	<li>Abbott, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mind+of+a+mouse.">The Mind of a mouse.</a> Cell. 182 (6), 1372-1376 (2020).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex.">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), (2015).</li><li>Winnubst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+1,000+projection+neurons+reveals+new+cell+types+and+organization+of+long-range+connectivity+in+the+mouse+brain.">Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain.</a> Cell. 179 (1), 268-281 (2019).</li><li>Araya, R., Vogels, T. P., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+spine+neck+changes+are+correlated+with+synaptic+strength.">Activity-dependent dendritic spine neck changes are correlated with synaptic strength.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (28), (2014).</li><li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+dendritic+spines.">Structural plasticity of dendritic spines.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).</li><li>Mart&#237;nez-Cerde&#241;o, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrite+and+spine+modifications+in+autism+and+related+neurodevelopmental+disorders+in+patients+and+animal+models.">Dendrite and spine modifications in autism and related neurodevelopmental disorders in patients and animal models.</a> Developmental Neurobiology. 77 (4), 393-404 (2017).</li><li>Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+and+imaging+technologies+for+circuit-based+neuroanatomy.">Molecular genetics and imaging technologies for circuit-based neuroanatomy.</a> Nature. 461 (7266), 900-907 (2009).</li><li>Kim, E. H., Chin, G., Rong, G., Poskanzer, K. E., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probes+for+neurobiological+sensing+and+imaging.">Optical probes for neurobiological sensing and imaging.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (5), 1023-1032 (2018).</li><li>Weissman, T. A., Pan, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainbow:+New+resources+and+emerging+biological+applications+for+multicolor+genetic+labeling+and+analysis.">Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis.</a> Genetics. 199 (2), 293-306 (2014).</li><li>Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+vectors+in+neuroscience+research.">Adeno-associated viral vectors in neuroscience research.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 69-82 (2020).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+diversity+in+development+and+disease.">Motor neuron diversity in development and disease.</a> Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).</li><li>Ledda, F., Paratcha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+dendritic+arbor+patterning.">Mechanisms regulating dendritic arbor patterning.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (24), 4511-4537 (2017).</li><li>Falougy, H. E., Filova, B., Ostatnikova, D., Bacova, Z., Bakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+morphology+alterations+in+autism+and+possible+role+of+oxytocin.">Neuronal morphology alterations in autism and possible role of oxytocin.</a> Endocrine Regulations. 53 (1), 46-54 (2019).</li></ol>

לפני הופעתן של טכניקות עכשוויות לניקוי רקמות, לימוד מורפולוגיה עצבית כלל חתך, הדמיה ושחזור עתירי זמן של חלקים דקים מאוד סמוכים. שימוש בניקוי רקמות אלקטרופורטיות בשילוב עם הדמיה קונפוצלית מספק תצוגה ללא הפרעה של מורפולוגיה עצבית מלאה. מעצים דנדריטיים שלמים, עד לבוטון הסינפטי הקטן ביותר, ה?...

הבנת הארגון המרחבי, דפוסי הקישוריות והמורפולוגיה של מבנים ביולוגיים תלת-ממדיים מורכבים חיונית לתיווג הפונקציות של תאים ורקמות ספציפיים. זה נכון במיוחד במדעי המוח, שבהם הוקדש מאמץ עצום לבניית מפות נוירואנטומיות ברזולוציה גבוהה של מערכת העצבים המרכזית1,2. בחינה מדוקדקת של הנוירונים המרכיבים מפות אלה מניבה מורפורוגיות מגוונות, עם קשרים ומיקומים המשקפים את הפונקציה של קבוצות שונות אלה של נוירונים3,4. יתר על כן, חקירה של מבנים תת-תאיים, במיוחד קוצים דנדריטיים, יכולה ליידע את בגרות הסינפסות, ובכך לשקף תהליכים התפתחותיים ומדינות מחלה נוירולוגיות5,6,7. לכן, גישות המשפרות את רזולוציית ההדמיה ואת התפוקה חיוניות להבנה טובה יותר של תפקוד המוח בכל קנה מידה.
ההתקדמות האחרונה הרחיבה את ערכת הכלים המולקולרית והגנטית לסימון ומניפולציה של אוכלוסיות של נוירונים. הפיתוח של סמנים פלואורסצנטיים חדשים, בשילוב עם שיטות חדשות של החדרת סמנים אלה לתוך נוירונים, מאפשר תיוג דיפרנציאלי של אוכלוסיות של נוירונים אינטראקציה בתוך אותה חיה או דגימת מוח8,9,10,11. מכיוון שהאור מפוזר על ידי שומנים אטומים, ובהתחשב בתוכן השומנים הגבוה של רקמת המוח, אוכלוסיות עצביות הדמיה הוגבלה בעיקר לחלקים דקים או הסתמכה על טכניקות מיקרו-סקרופיות מתקדמות (למשל, קונפוקלית, מיקרוסקופיה רב-פוטונית וגיליון אור) למבנים עמוקים של תמונה. עם זאת, מאמצים אלה התחזקו מאוד על ידי התקדמות בטכניקות ניקוי רקמות. הדמיה נוקשה/חיסונים היברידיים/חיסונים היברידיים/חיסונים/ בהיברידיהתואמת רקמות (CLARITY) היא טכניקה אחת כזו, שבה רקמות מעניינות מושרות במונומרים הידרוג'ל (אקרילאמיד וביס-אקרילאמיד) ולאחר מכן נשטפות עם דטרגנטים12. המונומרים ההידרוג'לים מתכלים ויוצרים פיגום הידרוג'ל תלת-ממדי יציב שקוף אופטית וחדיר לתוויות מקרומולקוליות. חומצות גרעין וחלבונים נשמרים בתוך המטריצה ההיברידית, ואילו השומנים מוסרים על ידי שטיפת חומרי הניקוי(איור 1). התוצאה היא רקמה יציבה כי הוא נוקשה מספיק כדי לשמור על הצורה המקורית ואת הכיוון של תאים ומולקולות שאינן שומנים בדם, בעוד שקוף אופטית מספיק כדי בקלות לדמיין מבנים עמוקים ברזולוציה גבוהה. תחזוקה זו של מבנה הרקמה והכיוון מאפשרת הדמיה של פרוסות עבות, ובכך משמרת חיבורים בין תא לתא ויחסים מרחביים. יתר על כן, מכיוון שהמיקום והזמינות של חלבונים וחומצות גרעין נשמרים במהלך תהליך הסליקה, רקמות מנוקות מסוגלות להחזיק סמנים מבוססי ביטוי, כמו גם תוויות אקסוגניות. לכן, CLARITY משאילה את עצמה כשיטה רבת עוצמה להדמיה כמויות גדולות של מבני מוח עמוקים ואת הקשרים בין מבנים אלה ברזולוציה גבוהה.
השימוש ב- CLARITY משפר מאוד את הגישות לאוכלוסיות נוירונים הדמיה. טכניקה זו מיומנת במיוחד ביצירת כמויות גדולות של נתוני הדמיה. CLARITY עובד היטב עם צורות מרובות של פלואורסצנטיות מבוססת חלבון. פרוטוקול זה משתמש בגישה מבוססת lentiviral כדי לתייג תאים בדלילות עם EGFP ו tdTomato; עם זאת, אללס כתב מהונדס המביע tdTomato או EGFP לסמן תאים לשחזור שימשו באופן שגרתי. חשוב לבחור פלואורופור שהוא גם יציב בתמונה וגם בהיר (למשל, EGFP או tdTomato). בנוסף, שימוש במקדם חזק כדי לבטא את הפלורופור מניב ניגודיות מעולה ואיכות תמונה. החסרונות של טכניקה זו מתעוררים כמו ניתוח נכון של כמות גדולה זו של נתונים יכול להיות גם עבודה- וגם זמן אינטנסיבי. מיקרוסקופים מיוחדים יכולים לעזור לשפר את התפוקה ולהפחית את עומס העבודה. עם זאת, בנייה, בעלות ו/או הפעלת מיקרוסקופים מתקדמים הם לעתים קרובות עלות-אוסרת עבור מעבדות רבות. עבודה זו מציגה תפוקה גבוהה, מהירה יחסית, שיטה פשוטה לדמיין כמויות גדולות של רקמה עצבית ברזולוציה גבוהה באמצעות ניקוי רקמת CLARITY של חלקים גדולים, בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית סטנדרטית. פרוטוקול זה מתאר גישה זו בשלבים הבאים: 1) ניתוח והכנת הרקמה העצבית, 2) ניקוי הרקמה, 3) הרכבת הרקמה, 4) הדמיה של הפרוסות המוכנות, ו -5) עיבוד תמונות פרוסה מלאות באמצעות שחזור וניתוח תוכנת הדמיה מיקרוסקופית(איור 2). מאמצים אלה גורמים לתמונות ברזולוציה גבוהה שניתן להשתמש בהן כדי לנתח אוכלוסיות של נוירונים, דפוסי חיבור עצביים, מורפולוגיה דנדריטית תלת-ממדית, שפע עמוד שדרה דנדריטי ומורפולוגיה, ודפוסי ביטוי מולקולריים בתוך רקמת מוח שלמה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 1&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide (No-Bis)</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoretic Tissue Clearing Solution</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2158-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel Solution Kit</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C1310X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case</td>
			<td>fisher</td>
			<td>MT21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044</td>
			<td>Wako</td>
			<td>925-41020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-CLARITY Polymerization System</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-CLARITY Tissue Clearing System II</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C30001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and quantification of intact neuronal dendrites via clarity tissue clearing

פעילות המוח, האותות האלקטרוכימיים המועברים בין נוירונים, נקבעת על ידי דפוסי הקישוריות של רשתות עצביות, ומהמורפולוגיה של תהליכים ותת-מבנים בתוך נוירונים אלה. ככזה, הרבה ממה שידוע על תפקוד המוח התעורר לצד התפתחויות בטכנולוגיות הדמיה המאפשרות תובנה נוספת על האופן שבו נוירונים מאורגנים ומחוברים במוח. שיפורים בניקוי רקמות אפשרו הדמיה ברזולוציה גבוהה של פרוסות מוח עבות, להקל על שחזור מורפולוגי ניתוחים של מבנים עצביים, כגון ארבורים דנדריטים וקוצים. במקביל, ההתקדמות בתוכנת עיבוד תמונה מספקת שיטות לניתוח מהיר של ערכות נתונים גדולות להדמיה. עבודה זו מציגה שיטה מהירה יחסית של עיבוד, הדמיה וניתוח פרוסות עבות של רקמה עצבית מסומנת ברזולוציה גבוהה באמצעות ניקוי רקמות CLARITY, מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח תמונה. פרוטוקול זה יאפשר את המאמצים להבנת דפוסי הקישוריות והמורפולוגיות העצביות המאפיינות מוחות בריאים, ואת השינויים במאפיינים אלה המתעוררים במצבי מוח חולים.

לאחר רכישת התמונה, מורפולוגיית התא הייצוגי נותחה באמצעות סטטיסטיקה מוטבעת וסיווג סקריפטים בתוך תוכנת הניתוח. הנתונים שנאספו (איור 6A) משקפים שלנויר 2 יש מבנה דנדריטי גדול יותר עם צפיפות גבוהה יותר של קוצים. ככלל, הנתונים מראים כי נוירון 2 יש מבנה דנדריטי מורכב יותר לעומת נוי?...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing at JoVE.com

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

מורפולוגיה דנדריטית עצבית לעתים קרובות עומדת בבסיס התפקוד. ואכן, תהליכי מחלה רבים המשפיעים על התפתחות הנוירונים באים לידי ביטוי עם פנוטיפ מורפולוגי. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה ורבת עוצמה לניתוח ארבורים דנדריטיים שלמים ואת קוציהם הקשורים.

הדמיה וכימות של דנדריטים עצביים שלמים באמצעות ניקוי רקמות CLARITY

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים לענות על שאלות חשובות לגבי דפוסים עצביים של קישוריות וארגון מרחבי העומד בבסיס התפקוד בתוך מעגל. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הדמיה של מורפולוגיות עצביות הממוקמות עמוק בתוך רקמה תלת ממדית שלמה. שיטה זו היא פשוטה ולכן ניתן לשחזר בקלות.לנסיינים בפעם הראשונה צריך להיות נוח לבצע טכניקה זו. זה הכרחי יש דגימת רקמה ברורה על מנת לקבל נתונים באיכות גבוהה. ההדגמה החזותית של בהירות רקמות מתאימה וטכניקות סליקה תאפשר תוצאות ניתנות לשחזור בקלות.בתור התחלה, הניחו את רקמת המוח השקועה בהידרוג'ל באינקובטור ואקום למשך שלוש שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם מינוס 90 קילופסקל ואקום. השאר את החלק העליון של הצינור ללא יצירה כדי לאפשר לוואקום להיווצר כראוי. לשטוף את הרקמה עם PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם רועד עדין.מניחים את דגימת הרקמה הפולימרית בתא האלקטרופורזה, תוך מעקב אחר כיוון הרקמה בתוך התא. מלאו את התא והמאגר במאגר במאגר ה-SDS האלקטרופורזי שסופק. הפעל את המדגם ב 70 וולט, אמפר אחד, ו 35 מעלות צלזיוס עם זרם קבוע במשך כשעתיים למיליליטר של רקמה.בדוק את המדגם מעת לעת עבור ניקוי מספיק של רקמת המוח על ידי הסרתו מהתא והחלפתה באותו כיוון. לאחר המדגם סיים ניקוי, לשטוף אותו PBS לילה בטמפרטורת החדר, החלפת PBS עם PBS טרי לעתים קרובות ככל האפשר. לאחר השטיפה הסופית ב- PBS, לשטוף את הרקמה במשך חמש דקות במים deionized בטמפרטורת החדר שלוש פעמים.הרקמה תהפוך אטומה ועשויה להתרחב. לדגור את הרקמה בתמיסת התאמת אינדקס שבירה במשך ארבע שעות לפחות בטמפרטורת החדר. במהלך הדגירה, לבנות חדר דיור מתאים כדי לדמיין את המדגם.התחל על ידי שימוש במגלשת זכוכית כבסיס להרכבה, ואז הניח מרווחי גומי או פלסטיק ואבטח אותם עם דבק סופר, ודא שאין חורים. מניחים את הרקמה הצלולה בתא הרכבה מלא מראש בתמיסת התאמת אינדקס שבירה. להרכיב את הרקמה בבטחה על ידי הנחת כיסוי זכוכית על גבי ואיטום אותו עם לק.תמונה רקמה זו על ידי הוספת טיפה של אינדקס שבירה התאמת פתרון הרכבה ישירות על גבי הזכוכית. כדי לבנות תא הדמיית רקמות גדול עבור רקמות בעובי של יותר מחמישה מילימטר, השתמש צלחת זכוכית 10 ס"מ עם קיר גבוה. מניחים צינור חרוט 50 מיליליטר במרכז, מוודא כי הקוטר של הצינור הוא גדול מספיק כדי לקבל את הקנה של העדשה האובייקטיבית בשימוש.הפוך 3% agarose במים ויוצקים אותו בחלל שבין צלחת הזכוכית ואת הצינור חרוטי, ולאחר מכן לאפשר לו להתקרר במשך שעה אחת. זה יהווה טבעת של ארוז מוצק. לדבוק היטב את הרקמה לתחתית התא באמצעות דבק סופר ולמלא את התא עם פתרון התאמת אינדקס שבירה, אשר עשוי להתחיל פילמור אלא אם כן נשמר מהאוויר מאוחסן בארבע מעלות צלזיוס.השג את התמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. הפעל את כל ציוד ההדמיה הרלוונטי. הנח את הדגימה על הבמה.גש בזהירות למדיית הטבילה במטרה וצור טור מדיה רציף. באמצעות אפיפלואורסצנטיות, למצוא שדה הדמיה מתאים. התחל על-ידי הגדרת הגדרות הרזולוציה ומהירות הסריקה.אם הדמיה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, סגור באופן מלא את חור הסיכה כדי להשיג את החלק האופטי הקטן ביותר ולכן את רזולוציית Z הטובה ביותר. הגדל בהדרגה את עוצמת הלייזר או את רווח החיישן עד לקבלת תמונה מתאימה עם יחס אות לרעש גבוה. אם אתם משתמשים בהדמיה סטנדרטית של EGFP או tdTomato בשני צבעים, קבעו את הגדרות אוסף האורים.הגדר את הפרמטרים מחסנית Z בהתבסס על נקודות ההתחלה והסיום שנצפו של הרקמה. הגדר את גודל השלב בהתבסס על רזולוציית Z הרצויה. גדלי שלבים קטנים יותר יניבו רזולוציית Z גדולה יותר, אך עלולים להוביל להלבנה לדוגמה.כאשר אתה מרוצה מהגדרות רכישת התמונה, השג את התמונה. ודא שהתמונה כוללת יחס אות לרעש גבוה ומציגה גבולות ברורים של מבנים. לאחר רכישת התמונה, מורפולוגיית התא הייצוגי נותחה באמצעות סטטיסטיקה מוטבעת וסיווג סקריפטים בתוך תוכנת הניתוח.הנתונים שנאספו משקפים כי נוירון 2 יש מבנה גדול יותר דנדריטי עם צפיפות גבוהה יותר של קוצים לעומת נוירון 1. כדי לבסס תוצאה זו, בוצע ניתוח שול סטנדרטי, המאשר כי נוירון 2 מורכב יותר מבחינה דנדרית מאשר נוירון 1 כפי שמציין המספר המוגבר של צמתים שול ב 50 עד 100 מיקרומטר מן הסומה. נוירון 1 מכיל חלק גדול יותר של קוצים עם צורות דמויות פילופודיה יותר והוא תת-סוג של עמוד שדרה לא בוגר.קוצים עם ראשים מוגדרים, הנקראים קוצים פטריות, ככל הנראה מכילים סינפסות מפותחות ובוגרות יותר. לכן, נוירון 2 הוא בוגר יותר עם צפיפות גבוהה יותר של קוצים בוגרים. לאחר ניקוי, גושי הרקמה יכולים להיות מוכתמים באמצעות אימונוהיסטוכימיה מסורתית.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

אפיון היסטולוגית שלם של Microdevices מוח מושתלים-ורקמה סובבת

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

הדמית סיבי serotonergic בחוט שדרת עכבר שימוש CLARITY / טכניקה מעוקבת

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

סליקה אופטית של מערכת העצבים המרכזית עכבר שימוש CLARITY הפסיבי

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

דגירה ממושכת של רקמות חריפות עצביות עבור Electrophysiology ו-הדמית סידן

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

הרומן פסיבית ניקוי שיטות לייצור מהיר של שקיפות אופטית כל רקמה CNS

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy

ניטור הישרדות עצביים באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות האורך

Standard cytotoxicity assays, which require the collection of lysates or fixed cells at multiple time points, have limited sensitivity and capacity to ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

שיטת ניקוי רקמות הידרופובית לרקמת מוח חולדה

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

הכנת מלנוגאסטר דרוזופילה למבוגרים להדמיית מוח שלמה במהלך תגובות התנהגות וגירויים

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

חיסון של רטינות הר שלם עם שיטת ניקוי רקמת בהירות

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...