Name: imaging and quantification of intact neuronal dendrites via clarity tissue clearing
Uploaded: 2021-04-20T15:00:00
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Vorremmo ringraziare il nucleo virale NRDDC presso l'Istituto neurologico Jan e Dan Duncan per la produzione di AAV e lentivirus utilizzati in questi esperimenti. Inoltre, vorremmo ringraziare il Baylor College of Medicine Center for Comparative Medicine per l'allevamento dei topi e la manutenzione generale dei topi utilizzati. Vorremmo ringraziare l'American Heart Association per il loro sostegno con il numero di premio 20PRE35040011 e BRASS: Baylor Research Advocates for Student Scientists per il loro supporto (PJH). Infine, vorremmo ringraziare Logos per aver fornito al nostro laboratorio il sistema di pulizia dei tessuti elettroforetici Logos X-Clarity.

Il seguente protocollo segue tutte le linee guida per la cura degli animali per il Baylor College of Medicine.
1. Dissezione e preparazione dei tessuti
<ol><li>Eutanasia del topo con un sovradosaggio di isoflurano mettendo il topo in un contenitore chiuso con un asciugamano imbevuto di isoflurano (o con altri mezzi approvati IUCAC).</li>
	<li>Perfondere l'animale transcardicamente utilizzando un ago da 25 G con 10 ml di PBS ghiacciato, seguito da 10 ml di PFA al 4%.</li>
	<li>Sezionare la re...

<ol>
	<li>Abbott, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mind+of+a+mouse.">The Mind of a mouse.</a> Cell. 182 (6), 1372-1376 (2020).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex.">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), (2015).</li><li>Winnubst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+1,000+projection+neurons+reveals+new+cell+types+and+organization+of+long-range+connectivity+in+the+mouse+brain.">Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain.</a> Cell. 179 (1), 268-281 (2019).</li><li>Araya, R., Vogels, T. P., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+spine+neck+changes+are+correlated+with+synaptic+strength.">Activity-dependent dendritic spine neck changes are correlated with synaptic strength.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (28), (2014).</li><li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+dendritic+spines.">Structural plasticity of dendritic spines.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).</li><li>Mart&#237;nez-Cerde&#241;o, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrite+and+spine+modifications+in+autism+and+related+neurodevelopmental+disorders+in+patients+and+animal+models.">Dendrite and spine modifications in autism and related neurodevelopmental disorders in patients and animal models.</a> Developmental Neurobiology. 77 (4), 393-404 (2017).</li><li>Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+and+imaging+technologies+for+circuit-based+neuroanatomy.">Molecular genetics and imaging technologies for circuit-based neuroanatomy.</a> Nature. 461 (7266), 900-907 (2009).</li><li>Kim, E. H., Chin, G., Rong, G., Poskanzer, K. E., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probes+for+neurobiological+sensing+and+imaging.">Optical probes for neurobiological sensing and imaging.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (5), 1023-1032 (2018).</li><li>Weissman, T. A., Pan, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainbow:+New+resources+and+emerging+biological+applications+for+multicolor+genetic+labeling+and+analysis.">Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis.</a> Genetics. 199 (2), 293-306 (2014).</li><li>Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+vectors+in+neuroscience+research.">Adeno-associated viral vectors in neuroscience research.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 69-82 (2020).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+diversity+in+development+and+disease.">Motor neuron diversity in development and disease.</a> Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).</li><li>Ledda, F., Paratcha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+dendritic+arbor+patterning.">Mechanisms regulating dendritic arbor patterning.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (24), 4511-4537 (2017).</li><li>Falougy, H. E., Filova, B., Ostatnikova, D., Bacova, Z., Bakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+morphology+alterations+in+autism+and+possible+role+of+oxytocin.">Neuronal morphology alterations in autism and possible role of oxytocin.</a> Endocrine Regulations. 53 (1), 46-54 (2019).</li></ol>

Prima dell'avvento delle tecniche contemporanee di pulizia dei tessuti, lo studio della morfologia neuronale consisteva nel sezionamento, nell'imaging e nella ricostruzione di sezioni molto sottili adiacenti. L'uso della pulizia del tessuto elettroforetico in combinazione con l'imaging confocale fornisce una visione libera della morfologia neuronale completa. Dagli alberi dendritici intatti, fino al più piccolo bouton sinaptico, l'imaging e la quantificazione della morfologia neuronale non sono mai stati più fattibili....

Comprendere l'organizzazione spaziale, i modelli di connettività e la morfologia di strutture biologiche tridimensionali complesse è essenziale per delineare le funzioni di cellule e tessuti specifici. Ciò è particolarmente vero nelle neuroscienze, in cui è stato dedicato un enorme sforzo alla costruzione di mappe neuroanatomiche ad alta risoluzione del sistema nervoso centrale1,2. Un attento esame dei neuroni che compongono queste mappe produce varie morfologie, con connessioni e posizioni che riflettono la funzione di questi diversi insiemi di neuroni3,4. Inoltre, lo studio delle strutture subcellulari, in particolare delle spine dendritiche, può informare la maturità delle sinapsi, riflettendo così i processi di sviluppo e gli stati di malattia neurologica5,6,7. Pertanto, gli approcci che migliorano la risoluzione e la produttività dell'imaging sono essenziali per comprendere meglio la funzione cerebrale a tutte le scale.
Recenti progressi hanno ampliato il toolkit molecolare e genetico per marcare e manipolare popolazioni di neuroni. Lo sviluppo di nuovi marcatori fluorescenti, combinato con nuovi metodi di introduzione di questi marcatori nei neuroni, consente l'etichettatura differenziale di popolazioni di neuroni interagenti all'interno dello stesso animale o campione di cervello8,9,10,11. Poiché la luce è dispersa da lipidi opachi e dato l'alto contenuto lipidico del tessuto cerebrale, l'imaging delle popolazioni neuronali è stato principalmente limitato a sezioni sottili o si è affidato a tecniche avanzate di microscropia (ad esempio, microscopia confocale, multi-fotone e a foglio di luce) per l'immagine di strutture profonde. Tuttavia, questi sforzi sono stati notevolmente rafforzati dai progressi nelle tecniche di pulizia dei tessuti. Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/immunostaining/insitu hybridization-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) è una di queste tecniche, in cui i tessuti di interesse vengono infusi con monomeri di idrogel (acrilammide e bis-acrilammide) e quindi lavati con detergenti12. I monomeri di idrogel si ibridano per creare uno scaffold idrogel 3D stabile che è otticamente trasparente e permeabile alle etichette delle macromolecole. Gli acidi nucleici e le proteine sono mantenuti all'interno della matrice ibridata, mentre i lipidi vengono rimossi dai lavaggi detergenti (Figura 1). Ciò si traduce in un tessuto stabile che è abbastanza rigido da mantenere la forma e l'orientamento originali delle cellule e delle molecole non lipidiche, mentre otticamente abbastanza trasparente da immaginare facilmente strutture profonde ad alta risoluzione. Questo mantenimento della struttura e dell'orientamento dei tessuti consente l'imaging di fette spesse, preservando così le connessioni cellula-cellula e le relazioni spaziali. Inoltre, poiché la posizione e la disponibilità di proteine e acidi nucleici viene mantenuta durante il processo di compensazione, i tessuti eliminati sono in grado di contenere marcatori basati sull'espressione, nonché etichette esogene. Pertanto, CLARITY si presta come un metodo potente per l'imaging di grandi quantità di strutture cerebrali profonde e le connessioni tra queste strutture ad alta risoluzione.
L'uso di CLARITY migliora notevolmente gli approcci all'imaging delle popolazioni neuronali. Questa tecnica è particolarmente abile nel generare grandi quantità di dati di imaging. CLARITY funziona bene con più forme di fluorescenza a base di proteine. Questo protocollo utilizza un approccio basato sul lentivirale per etichettare scarsamente le cellule con EGFP e tdTomato; tuttavia, gli alleli reporter transgenici che esprimono tdTomato o EGFP per etichettare le cellule per la ricostruzione sono stati utilizzati di routine. È importante scegliere un fluoroforo che sia fotostali e luminoso (ad esempio, EGFP o tdTomato). Inoltre, l'utilizzo di un forte promotore per esprimere il fluoroforo produce un contrasto e una qualità dell'immagine superiori. Gli svantaggi di questa tecnica derivano dal fatto che analizzare correttamente questa grande quantità di dati può richiedere sia lavoro che tempo. Microscopi specializzati possono aiutare a migliorare la produttività e ridurre il carico di lavoro. Tuttavia, la costruzione, la proprietà e / o l'uso di microscopi avanzati sono spesso proibitivi per molti laboratori. Questo lavoro presenta un metodo ad alto rendimento, relativamente rapido e semplice per visualizzare grandi quantità di tessuto neurale ad alta risoluzione utilizzando la pulizia dei tessuti CLARITY di grandi sezioni, combinata con la microscopia confocale standard. Questo protocollo descrive questo approccio attraverso i seguenti passaggi: 1) sezionare e preparare il tessuto neurale, 2) eliminare il tessuto, 3) montare il tessuto, 4) imaging delle fette preparate e 5) elaborare immagini di fette complete utilizzando la ricostruzione e l'analisi del software di visualizzazione al microscopio (Figura 2). Questi sforzi si traducono in immagini ad alta risoluzione che possono essere utilizzate per analizzare popolazioni di neuroni, modelli di connessione neuronale, morfologia dendritica 3D, abbondanza e morfologia della colonna vertebrale dendritica e modelli di espressione molecolare all'interno del tessuto cerebrale intatto.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 1&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide (No-Bis)</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoretic Tissue Clearing Solution</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2158-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel Solution Kit</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C1310X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case</td>
			<td>fisher</td>
			<td>MT21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044</td>
			<td>Wako</td>
			<td>925-41020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-CLARITY Polymerization System</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-CLARITY Tissue Clearing System II</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C30001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and quantification of intact neuronal dendrites via clarity tissue clearing

L'attività cerebrale, i segnali elettrochimici passati tra i neuroni, è determinata dai modelli di connettività delle reti neuronali e dalla morfologia dei processi e delle sottostrutture all'interno di questi neuroni. Come tale, gran parte di ciò che è noto sulla funzione cerebrale è sorto insieme agli sviluppi nelle tecnologie di imaging che consentono ulteriori informazioni su come i neuroni sono organizzati e collegati nel cervello. I miglioramenti nella pulizia dei tessuti hanno permesso l'imaging ad alta risoluzione di spesse fette di cervello, facilitando la ricostruzione morfologica e le analisi delle sottostrutture neuronali, come i pergole dendritiche e le spine. In parallelo, i progressi nel software di elaborazione delle immagini forniscono metodi per analizzare rapidamente set di dati di imaging di grandi dimensioni. Questo lavoro presenta un metodo relativamente rapido di elaborazione, visualizzazione e analisi di spesse fette di tessuto neurale etichettato ad alta risoluzione utilizzando la pulizia dei tessuti CLARITY, la microscopia confocale e l'analisi delle immagini. Questo protocollo faciliterà gli sforzi verso la comprensione dei modelli di connettività e delle morfologie neuronali che caratterizzano i cervelli sani e i cambiamenti in queste caratteristiche che sorgono negli stati cerebrali patologici.

Dopo l'acquisizione dell'immagine, la morfologia cellulare rappresentativa è stata analizzata utilizzando statistiche incorporate e classificando gli script all'interno del software di analisi. I dati raccolti (Figura 6A) riflettono che il neurone 2 ha una struttura dendritica più grande con una maggiore densità di spine. Nel complesso, i dati suggeriscono che il neurone 2 ha una struttura dendritica più complessa rispetto al neurone 1. Per corroborare questo risultato, è stata eseguita...

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Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

La morfologia dendritica neuronale è spesso alla base della funzione. In effetti, molti processi patologici che influenzano lo sviluppo dei neuroni si manifestano con un fenotipo morfologico. Questo protocollo descrive un metodo semplice e potente per analizzare i pergole dendritiche intatte e le loro spine associate.

Imaging e quantificazione di dendriti neuronali intatti tramite CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

Questo protocollo consentirà ai ricercatori di rispondere a domande importanti sui modelli neuronali di connettività e organizzazione spaziale che sono alla base della funzione all'interno di un circuito. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la visualizzazione di morfologie neuronali situate in profondità all'interno di tessuti tridimensionali intatti. Questo metodo è semplice e quindi facilmente riproducibile.Gli sperimentatori per la prima volta dovrebbero essere a proprio agio nell'eseguire questa tecnica. È imperativo avere un campione di tessuto chiaro per ottenere dati di alta qualità. La dimostrazione visiva di un'appropriata chiarezza dei tessuti e delle tecniche di compensazione consentirà risultati facilmente riproducibili.Per iniziare, posizionare il tessuto cerebrale immerso nell'idrogel in un incubatore a vuoto per tre ore a 37 gradi Celsius con meno 90 kilopascal di vuoto. Lasciare la parte superiore del tubo svitata per consentire al vuoto di formarsi correttamente. Lavare il tessuto con PBS per 10 minuti a temperatura ambiente con un leggero scuotimento.Posizionare il campione di tessuto polimerizzato nella camera di elettroforesi, tenendo traccia dell'orientamento del tessuto all'interno della camera. Riempire la camera e il serbatoio con il buffer SDS per elettroforesi in dotazione. Eseguire il campione a 70 volt, un ampere e 35 gradi Celsius con corrente costante per circa due ore per millilitro di tessuto.Controllare periodicamente il campione per una sufficiente pulizia del tessuto cerebrale rimuovendolo dalla camera e sostituendolo nello stesso orientamento. Dopo che il campione ha terminato la pulizia, lavarlo in PBS durante la notte a temperatura ambiente, sostituendo il PBS con PBS fresco il più spesso possibile. Dopo il lavaggio finale in PBS, lavare il tessuto per cinque minuti in acqua deionizzata a temperatura ambiente tre volte.Il tessuto diventerà opaco e potrebbe espandersi. Incubare il tessuto nella soluzione corrispondente all'indice di rifrazione per almeno quattro ore a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, costruire una camera di alloggiamento adatta per l'immagine del campione.Inizia usando una diapositiva di vetro come base per il montaggio, quindi posa i distanziali in gomma o plastica e fissali con super colla, assicurandoti che non ci siano fori. Posizionare il tessuto trasparente nella camera di montaggio preriempita con la soluzione corrispondente all'indice di rifrazione. Montare saldamente il tessuto posizionando una copertura di vetro sulla parte superiore e sigillandola con lo smalto per unghie.Immagina questo tessuto aggiungendo una goccia di soluzione di montaggio corrispondente all'indice di rifrazione direttamente sulla parte superiore del vetro. Per costruire una grande camera di imaging tissutale per tessuti con uno spessore superiore a cinque millimetri, utilizzare un piatto di vetro di 10 centimetri con una parete alta. Posizionare un tubo conico da 50 millilitro al centro, assicurandosi che il diametro del tubo sia abbastanza grande da accettare la canna della lente dell'obiettivo utilizzato.Fare il 3% di agarose in acqua e versarlo nello spazio tra il piatto di vetro e il tubo conico, quindi lasciarlo raffreddare per un'ora. Questo formerà un anello di agarose solido. Aderire saldamente il tessuto sul fondo della camera usando super colla e riempire la camera con una soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione, che può iniziare a polimerizzare a meno che non venga preservata dall'aria e conservata a quattro gradi Celsius.Acquisire l'immagine utilizzando un microscopio confocale. Accendere tutte le apparecchiature di imaging pertinenti. Posizionare il campione sul palco.Avvicinati con attenzione ai media di immersione con l'obiettivo e forma una colonna continua di media. Usando l'epifluorescenza, trova un campo di imaging appropriato. Inizia impostando le impostazioni di risoluzione e velocità di scansione.Se si utilizza un microscopio confocale, chiudere completamente il foro stenopeico per ottenere la sezione ottica più piccola e quindi la migliore risoluzione Z. Aumentare gradualmente la potenza del laser o il guadagno del sensore fino a ottenere un'immagine adatta con un elevato rapporto segnale-rumore. Se si utilizza l'imaging a due colori EGFP o tdTomato standard, impostare le impostazioni di raccolta della luce.Impostare i parametri Z-stack in base ai punti di inizio e fine osservati del tessuto. Impostare la dimensione del passo in base alla risoluzione Z desiderata. Le dimensioni dei gradini più piccole produrranno una maggiore risoluzione Z, ma potrebbero portare allo sbiancamento del campione.Quando sei soddisfatto delle impostazioni di acquisizione dell'immagine, acquisisci l'immagine. Assicurarsi che l'immagine abbia un elevato rapporto segnale/rumore e mostri confini distinti delle strutture. Dopo l'acquisizione dell'immagine, la morfologia cellulare rappresentativa è stata analizzata utilizzando statistiche incorporate e classificando gli script all'interno del software di analisi.I dati raccolti riflettono che il neurone 2 ha una struttura più grande di quella dendritica con una maggiore densità di spine rispetto al neurone 1. Per corroborare questo risultato, è stata eseguita un'analisi standard di Scholl, che afferma che il neurone 2 è più dendricomente complesso del neurone 1, come indicato dall'aumento del numero di intersezioni di Scholl a 50-100 micrometri dal soma. Il neurone 1 contiene una percentuale maggiore di spine con forme più simili a filopodi ed è un sottotipo di colonna vertebrale immatura.Le spine con teste definite, chiamate spine di funghi, probabilmente contengono sinapsi più sviluppate e mature. Pertanto, il neurone 2 è più maturo con una maggiore densità di spine mature. Dopo la pulizia, i pezzi di tessuto possono essere colorati usando l'immunoistochimica tradizionale.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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