Name: imaging and quantification of intact neuronal dendrites via clarity tissue clearing
Uploaded: 2021-04-20T15:00:00
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Gostaríamos de agradecer ao núcleo viral NRDDC no Jan e Dan Duncan Neurological Institute por produzir os AAVs e lentivírus usados nesses experimentos. Além disso, gostaríamos de agradecer ao Baylor College of Medicine Center for Comparative Medicine pela criação de ratos e manutenção geral dos camundongos utilizados. Gostaríamos de agradecer à American Heart Association por seu apoio sob o prêmio número 20PRE35040011, e BRASS: Baylor Research Advocates for Student Scientists por seu apoio (PJH). Finalmente, gostaríamos de agradecer à Logos por fornecer ao nosso laboratório o sistema de limpeza de tecidos eletroforéticos Logos X-Clarity.

O protocolo a seguir segue todas as diretrizes de cuidados com animais para o Baylor College of Medicine.
1. Dissecção e preparação de tecidos
<ol><li>Eutanize o rato com uma overdose de isoflurane colocando o rato em um recipiente fechado com uma toalha encharcada em isoflurane (ou por outros meios aprovados pelo IUCAC).</li>
	<li>Perfumar o animal transcardialmente usando uma agulha de 25 G com 10 mL de PBS gelado, seguido por 10 mL de 4% pfa.</li>
	<li>Dissecar a região cerebral (ou ...

<ol>
	<li>Abbott, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mind+of+a+mouse.">The Mind of a mouse.</a> Cell. 182 (6), 1372-1376 (2020).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex.">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), (2015).</li><li>Winnubst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+1,000+projection+neurons+reveals+new+cell+types+and+organization+of+long-range+connectivity+in+the+mouse+brain.">Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain.</a> Cell. 179 (1), 268-281 (2019).</li><li>Araya, R., Vogels, T. P., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+spine+neck+changes+are+correlated+with+synaptic+strength.">Activity-dependent dendritic spine neck changes are correlated with synaptic strength.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (28), (2014).</li><li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+dendritic+spines.">Structural plasticity of dendritic spines.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).</li><li>Mart&#237;nez-Cerde&#241;o, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrite+and+spine+modifications+in+autism+and+related+neurodevelopmental+disorders+in+patients+and+animal+models.">Dendrite and spine modifications in autism and related neurodevelopmental disorders in patients and animal models.</a> Developmental Neurobiology. 77 (4), 393-404 (2017).</li><li>Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+and+imaging+technologies+for+circuit-based+neuroanatomy.">Molecular genetics and imaging technologies for circuit-based neuroanatomy.</a> Nature. 461 (7266), 900-907 (2009).</li><li>Kim, E. H., Chin, G., Rong, G., Poskanzer, K. E., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probes+for+neurobiological+sensing+and+imaging.">Optical probes for neurobiological sensing and imaging.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (5), 1023-1032 (2018).</li><li>Weissman, T. A., Pan, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainbow:+New+resources+and+emerging+biological+applications+for+multicolor+genetic+labeling+and+analysis.">Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis.</a> Genetics. 199 (2), 293-306 (2014).</li><li>Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+vectors+in+neuroscience+research.">Adeno-associated viral vectors in neuroscience research.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 69-82 (2020).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+diversity+in+development+and+disease.">Motor neuron diversity in development and disease.</a> Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).</li><li>Ledda, F., Paratcha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+dendritic+arbor+patterning.">Mechanisms regulating dendritic arbor patterning.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (24), 4511-4537 (2017).</li><li>Falougy, H. E., Filova, B., Ostatnikova, D., Bacova, Z., Bakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+morphology+alterations+in+autism+and+possible+role+of+oxytocin.">Neuronal morphology alterations in autism and possible role of oxytocin.</a> Endocrine Regulations. 53 (1), 46-54 (2019).</li></ol>

Antes do advento das técnicas contemporâneas de limpeza de tecidos, o estudo da morfologia neuronal consistia em seção intensiva de tempo, imagem e reconstrução de seções muito finas adjacentes. O uso de limpeza de tecido eletroforético em combinação com imagens confocal fornece uma visão desobstruída da morfologia neuronal completa. De árvores dendríticas intactas, até o menor ataque sináptico, a imagem e a morfologia neuronal quantificada nunca foram tão viáveis.
A prepara...

Compreender a organização espacial, padrões de conectividade e morfologia de estruturas biológicas tridimensionais complexas é essencial para delinear as funções de células e tecidos específicos. Isso é especialmente verdadeiro na neurociência, na qual um tremendo esforço tem sido dedicado à construção de mapas neuroanatomômicos de alta resolução do sistema nervoso central1,2. O exame minucial dos neurônios que compõem esses mapas produz morfologias variadas, com conexões e locais que refletem a função desses diversos conjuntos de neurônios3,4. Além disso, a investigação de estruturas subcelulares, especialmente colunas dendríticas, pode informar a maturidade das sinapses, refletindo assim processos de desenvolvimento e estados de doenças neurológicas5,6,7. Assim, abordagens que melhoram a resolução e o throughput de imagem são essenciais para uma melhor compreensão da função cerebral em todas as escalas.
Os recentes avanços expandiram o kit de ferramentas moleculares e genéticas para marcar e manipular populações de neurônios. O desenvolvimento de novos marcadores fluorescentes, combinados com novos métodos de introdução desses marcadores em neurônios, permite rotulagem diferencial de populações de neurônios interagindo dentro da mesma amostra animal ou cerebral8,9,10,11. Como a luz é dispersa por lipídios opacos, e dado o alto teor lipídeca do tecido cerebral, as populações neuronais de imagem foram limitadas principalmente a seções finas ou se basearam em técnicas avançadas de microscroba (por exemplo, confocal, multifótons e microscopia de folha de luz) para estruturas profundas de imagem. No entanto, esses esforços têm sido muito reforçados pelos avanços nas técnicas de limpeza de tecidos. Imagem rígida hibridada de lipídida/imunostaining/in situ hybridization-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) é uma dessas técnicas, na qual tecidos de interesse são infundidos com monômeros de hidrogel (acrilamida e bis-acrilamida) e depois lavados com detergentes12. Os monômeros de hidrogel hibridizam-se para criar um andaime de hidrogel 3D estável que seja opticamente transparente e permeável aos rótulos de macromolécula. Os ácidos e proteínas nucleicos são mantidos dentro da matriz hibridizada, enquanto os lipídios são removidos pelas lavagens de detergente(Figura 1). Isso resulta em um tecido estável que é rígido o suficiente para manter a forma e orientação originais das células e moléculas não lipídicas, enquanto opticamente transparente o suficiente para facilmente imaginar estruturas profundas em alta resolução. Essa manutenção da estrutura e orientação tecidual permite a imagem de fatias grossas, preservando assim conexões célula-célula e relações espaciais. Além disso, como a localização e a disponibilidade de proteínas e ácidos nucleicos são mantidas durante o processo de compensação, os tecidos limpos são capazes de conter marcadores baseados em expressão, bem como rótulos exógenos. Assim, a CLARITY se presta como um método potente para a imagem de grandes quantidades de estruturas cerebrais profundas e as conexões entre essas estruturas em alta resolução.
O uso da CLARITY melhora muito as abordagens para as populações neuronais de imagem. Esta técnica é especialmente adepta à geração de grandes quantidades de dados de imagem. A CLARIDADE funciona bem com múltiplas formas de fluorescência à base de proteínas. Este protocolo utiliza uma abordagem baseada em lentiviral para células de rótulos escassos com EGFP e tdTomato; no entanto, alelos repórteres transgênicos expressando tdTomato ou EGFP para rotular células para reconstrução têm sido usados rotineiramente. É importante escolher um fluoróforo que seja foto-estável e brilhante (por exemplo, EGFP ou tdTomato). Além disso, usar um promotor forte para expressar o fluorohore produz contraste superior e qualidade de imagem. As desvantagens dessa técnica surgem como uma análise adequada dessa grande quantidade de dados pode ser tanto trabalhoso quanto tempo-intensivo. Microscópios especializados podem ajudar a melhorar o throughput e diminuir a carga de trabalho. No entanto, construir, possuir e/ou operar microscópios avançados são muitas vezes proibitivos de custos para muitos laboratórios. Este trabalho apresenta um método de alta produtividade, relativamente rápido e simples de visualizar grandes quantidades de tecido neural em alta resolução usando clareira de tecido DE GRANDE seções, combinada com microscopia confocal padrão. Este protocolo descreve essa abordagem através das seguintes etapas: 1) dissecação e preparação do tecido neural, 2) limpeza do tecido, 3) montagem do tecido, 4) imagens das fatias preparadas e 5) processamento de imagens completas de fatias utilizando reconstrução e análise de software de visualização de microscopia(Figura 2). Esses esforços resultam em imagens de alta resolução que podem ser usadas para analisar populações de neurônios, padrões de conexão neuronal, morfologia dendrítica 3D, abundância e morfologia da coluna dendrítica e padrões de expressão molecular dentro do tecido cerebral intacto.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 1&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide (No-Bis)</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoretic Tissue Clearing Solution</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2158-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel Solution Kit</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C1310X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case</td>
			<td>fisher</td>
			<td>MT21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044</td>
			<td>Wako</td>
			<td>925-41020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-CLARITY Polymerization System</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-CLARITY Tissue Clearing System II</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C30001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and quantification of intact neuronal dendrites via clarity tissue clearing

A atividade cerebral, os sinais eletroquímicos passados entre os neurônios, é determinada pelos padrões de conectividade das redes neuronais, e pela morfologia dos processos e subestruturas dentro desses neurônios. Como tal, muito do que se sabe sobre a função cerebral surgiu ao lado de desenvolvimentos em tecnologias de imagem que permitem uma visão mais aprofundada sobre como os neurônios são organizados e conectados no cérebro. Melhorias na limpeza tecidual permitiram imagens de alta resolução de fatias cerebrais grossas, facilitando a reconstrução morfológica e análises de subestruturas neuronais, como arbóreos dendráticos e espinhas. Em conjunto, os avanços no software de processamento de imagens fornecem métodos de análise rápida de grandes conjuntos de dados de imagens. Este trabalho apresenta um método relativamente rápido de processamento, visualização e análise de fatias grossas de tecido neural rotulado em alta resolução usando clareira de tecido CLARITY, microscopia confocal e análise de imagem. Este protocolo facilitará os esforços para entender os padrões de conectividade e morfologias neuronais que caracterizam cérebros saudáveis, e as mudanças nessas características que surgem em estados cerebrais doentes.

Após a aquisição de imagens, a morfologia celular representativa foi analisada utilizando estatísticas incorporadas e classificando scripts dentro do software de análise. Os dados coletados (Figura 6A) refletem que o neurônio 2 tem uma estrutura dendrítica maior com maior densidade de espinhas. Como um todo, os dados sugerem que o neurônio 2 tem uma estrutura dendrítica mais complexa em comparação com o neurônio 1. Para comprovar esse resultado, foi realizada a análise padrão d...

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Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

A morfologia dendrítica neuronal muitas vezes está por trás da função. De fato, muitos processos de doenças que afetam o desenvolvimento de neurônios se manifestam com um fenótipo morfológico. Este protocolo descreve um método simples e poderoso para analisar arbores dendríticas intactas e suas espinhas associadas.

Imagem e quantificação de dendritos neuronais intactos via clareza de tecido

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

Este protocolo permitirá que os pesquisadores respondam a perguntas importantes sobre padrões neuronais de conectividade e organização espacial que fundamentam a função dentro de um circuito. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a visualização de morfologias neuronais localizadas profundas dentro do tecido tridimensional intacto. Este método é simples e, portanto, facilmente reproduzível.Os experimentadores iniciantes devem estar confortáveis em executar esta técnica. É imprescindível ter uma amostra de tecido claro para obter dados de alta qualidade. A demonstração visual de técnicas adequadas de clareza tecidual e de compensação permitirá resultados facilmente reprodutíveis.Para começar, coloque o tecido cerebral submerso de hidrogel em uma incubadora de vácuo por três horas a 37 graus Celsius com menos 90 quilopascal de vácuo. Deixe a parte superior do tubo desparafusada para permitir que o vácuo se forme corretamente. Lave o tecido com PBS por 10 minutos em temperatura ambiente com agitação suave.Coloque a amostra de tecido polimerizado na câmara de eletroforese, acompanhando a orientação do tecido dentro da câmara. Encha a câmara e o reservatório com o tampão SDS de eletroforese fornecido. Execute a amostra a 70 volts, um ampere e 35 graus Celsius com corrente constante por cerca de duas horas por mililitro de tecido.Verifique periodicamente a amostra quanto a limpeza do tecido cerebral, removendo-a da câmara e substituindo-a na mesma orientação. Depois que a amostra terminar de limpar, lave-a em PBS durante a noite à temperatura ambiente, substituindo o PBS por PBS fresco o mais frequentemente possível. Após a lavagem final na PBS, lave o tecido por cinco minutos em água deionizada à temperatura ambiente três vezes.O tecido ficará opaco e pode se expandir. Incubar o tecido na solução de correspondência de índices de refração por pelo menos quatro horas em temperatura ambiente. Durante a incubação, construa uma câmara de habitação adequada para a imagem da amostra.Comece usando um slide de vidro como base para montagem, em seguida, deite borracha ou espaçadores plásticos e fixe-os com super cola, certificando-se de que não há nenhum furo. Coloque o tecido claro na câmara de montagem pré-preenchido com solução de correspondência de índice refrativo. Montar o tecido com segurança colocando uma mancha de vidro em cima e selando-o com esmalte.Imagem deste tecido adicionando uma gota de índice de refração combinando solução de montagem diretamente em cima do vidro. Para construir uma grande câmara de imagem tecidual para tecidos com mais de cinco milímetros de espessura, use uma antena de vidro de 10 centímetros com uma parede alta. Coloque um tubo cônico de 50 mililitros no centro, certificando-se de que o diâmetro do tubo é grande o suficiente para aceitar o barril da lente objetiva utilizada.Faça 3% de agarose na água e despeje-o no espaço entre o prato de vidro e o tubo cônico, em seguida, deixe esfriar por uma hora. Isso formará um anel de agarose sólida. Adere firmemente o tecido ao fundo da câmara usando super cola e encha a câmara com solução de correspondência de índice refrativo, que pode começar a polimerizar a menos que seja preservada do ar e armazenada a quatro graus Celsius.Adquira a imagem usando um microscópio confocal. Ligue todos os equipamentos de imagem relevantes. Coloque a amostra no palco.Aproxime cuidadosamente os meios de comunicação de imersão com o objetivo e forme uma coluna contínua de mídia. Usando epifluorescência, encontre um campo de imagem apropriado. Comece definindo as configurações de resolução e digitalização de velocidade.Se a imagem usar um microscópio confocal, feche totalmente o pinhole para obter a menor seção óptica e, portanto, a melhor resolução Z. Aumente gradualmente a potência do laser ou o ganho do sensor até que uma imagem adequada seja obtida com uma alta relação sinal-ruído. Se utilizar imagens padrão de EGFP ou tdTomato de duas cores, defina as configurações da coleta de luz.Defina os parâmetros de pilha Z com base nos pontos de partida e extremidade observados do tecido. Defina o tamanho da etapa com base na resolução Z desejada. Tamanhos de passo menores produzirão uma resolução Z maior, mas podem levar ao branqueamento amostral.Quando estiver satisfeito com as configurações de aquisição de imagens, adquira a imagem. Certifique-se de que a imagem tem uma alta relação sinal-ruído e mostra limites distintos de estruturas. Após a aquisição de imagens, a morfologia celular representativa foi analisada utilizando estatísticas incorporadas e classificando scripts dentro do software de análise.Os dados coletados refletem que o Neurônio 2 tem estrutura maior que a dendrítica com maior densidade de espinhas em comparação com o Neurônio 1. Para comprovar esse resultado, foi realizada a análise padrão de Scholl, que afirma que o Neurônio 2 é mais dendriticamente complexo que o Neurônio 1, conforme denotado pelo aumento do número de intersecções de Scholl a 50 a 100 micrômetros da soma. O neurônio 1 contém uma proporção maior de espinhas com formas mais filopodia e é um subtipo imaturo da coluna vertebral.Espinhos com cabeças definidas, chamadas espinhos de cogumelo, provavelmente contêm sinapses mais desenvolvidas e maduras. Assim, o Neurônio 2 é mais maduro com maior densidade de espinhas maduras. Após a limpeza, os pedaços de tecido podem ser manchados usando a imunohistoquímica tradicional.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Caracterização histológica intacta de Microdevices Brain-implantados e tecido circundante

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Neurociência

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imagiologia Fibras Serotoninérgicos na medula espinhal mouse usando o CLARIDADE / Técnica CUBIC

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Clearing óptica do Sistema Nervoso Central Rato Usando a claridade passiva

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

A incubação prolongada de aguda Neuronal Tissue de Eletrofisiologia e cálcio-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Passivo novo métodos de compensação para a produção rápida de transparência óptica no tecido inteiro do CNS

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy

Monitoramento de sobrevivência Neuronal através de microscopia de fluorescência Longitudinal

Standard cytotoxicity assays, which require the collection of lysates or fixed cells at multiple time points, have limited sensitivity and capacity to ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Um método de limpeza de tecido hidrofóbico para tecido cerebral de rato

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

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Preparando melanogaster de Drosophila adulto para imagem cerebral inteira durante respostas comportamentais e estímulos

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

Imunostaining de Retinas de Monte Inteiro com o Método de Limpeza tecidual CLARITY

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...