Name: imaging and quantification of intact neuronal dendrites via clarity tissue clearing
Uploaded: 2021-04-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing at JoVE.com

Jan ve Dan Duncan Nöroloji Enstitüsü'ndeki viral çekirdek NRDDC'ye bu deneylerde kullanılan AAV'leri ve lentivirüsleri ürettikleri için teşekkür ederiz. Ayrıca, Baylor College of Medicine Center for Comparative Medicine'a fare hayvancılığı ve kullanılan farelerin genel bakımı için teşekkür ederiz. Amerikan Kalp Derneği'ne 20PRE35040011 ödül numarası altında verdikleri destek için ve BRASS: Baylor Research Advocates for Student Scientists (PJH) için teşekkür ederiz. Son olarak, logos'a laboratuvarımıza Logos X-Clarity elektroforetik doku temizleme sistemini sağladığı için teşekkür ederiz.

Aşağıdaki protokol, Baylor Tıp Fakültesi için tüm hayvan bakım yönergelerini takip eder.
1. Diseksiyon ve doku hazırlama
<ol><li>Fareyi, izoflurane batırılmış bir havlu ile kapalı bir kaba yerleştirerek (veya diğer IUCAC onaylı yollarla) aşırı dozda izofluran ile ötenazi yaptırın.</li>
	<li>Hayvanı transkardiyöz olarak 10 mL buz gibi PBS ile 25 G iğne kullanarak ve ardından% 4 PFA'nın 10 mL'sini geçirin.</li>
	<li>İlgi çekici beyin bölgesini (veya dokuyu) par...

<ol>
	<li>Abbott, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mind+of+a+mouse.">The Mind of a mouse.</a> Cell. 182 (6), 1372-1376 (2020).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex.">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), (2015).</li><li>Winnubst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+1,000+projection+neurons+reveals+new+cell+types+and+organization+of+long-range+connectivity+in+the+mouse+brain.">Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain.</a> Cell. 179 (1), 268-281 (2019).</li><li>Araya, R., Vogels, T. P., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+spine+neck+changes+are+correlated+with+synaptic+strength.">Activity-dependent dendritic spine neck changes are correlated with synaptic strength.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (28), (2014).</li><li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+dendritic+spines.">Structural plasticity of dendritic spines.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).</li><li>Mart&#237;nez-Cerde&#241;o, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrite+and+spine+modifications+in+autism+and+related+neurodevelopmental+disorders+in+patients+and+animal+models.">Dendrite and spine modifications in autism and related neurodevelopmental disorders in patients and animal models.</a> Developmental Neurobiology. 77 (4), 393-404 (2017).</li><li>Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+and+imaging+technologies+for+circuit-based+neuroanatomy.">Molecular genetics and imaging technologies for circuit-based neuroanatomy.</a> Nature. 461 (7266), 900-907 (2009).</li><li>Kim, E. H., Chin, G., Rong, G., Poskanzer, K. E., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probes+for+neurobiological+sensing+and+imaging.">Optical probes for neurobiological sensing and imaging.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (5), 1023-1032 (2018).</li><li>Weissman, T. A., Pan, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainbow:+New+resources+and+emerging+biological+applications+for+multicolor+genetic+labeling+and+analysis.">Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis.</a> Genetics. 199 (2), 293-306 (2014).</li><li>Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+vectors+in+neuroscience+research.">Adeno-associated viral vectors in neuroscience research.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 69-82 (2020).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+diversity+in+development+and+disease.">Motor neuron diversity in development and disease.</a> Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).</li><li>Ledda, F., Paratcha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+dendritic+arbor+patterning.">Mechanisms regulating dendritic arbor patterning.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (24), 4511-4537 (2017).</li><li>Falougy, H. E., Filova, B., Ostatnikova, D., Bacova, Z., Bakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+morphology+alterations+in+autism+and+possible+role+of+oxytocin.">Neuronal morphology alterations in autism and possible role of oxytocin.</a> Endocrine Regulations. 53 (1), 46-54 (2019).</li></ol>

Çağdaş doku temizleme tekniklerinin ortaya çıkmasından önce, nöronal morfolojinin incelenmesi zaman yoğun kesitleme, görüntüleme ve bitişik çok ince bölümlerin yeniden yapılandırılmasından oluşuyordu. Konfokal görüntüleme ile birlikte elektroforetik doku temizlemenin kullanılması, tam nöronal morfolojinin engelsiz bir görünümünü sağlar. Bozulmamış dendritik ağaçlardan, en küçük sinaptik bouton'a kadar, nöronal morfolojiyi görüntülemek ve ölçmek hiç bu kadar mümkün olmamı?...

Karmaşık üç boyutlu biyolojik yapıların mekansal organizasyonun, bağlantı kalıplarının ve morfolojisinin anlaşılması, belirli hücrelerin ve dokuların işlevlerini sınırlandırmak için gereklidir. Bu, özellikle merkezi sinir sisteminin yüksek çözünürlüklü nöroanatomik haritalarını oluşturmaya adanmış muazzam çabanın bulunduğu nörobilimde geçerlidir1,2. Bu haritaları oluşturan nöronların yakından incelenmesi, bu çeşitli nöron setlerinin işlevini yansıtan bağlantılar ve konumlar ile çeşitli morfolojiler verir3,4. Ayrıca, subselüler yapıların, özellikle dendritik dikenlerin araştırılması, sinapsların olgunluğunu bilgilendirebilir, böylece gelişimsel süreçleri ve nörolojik hastalık durumlarını yansıtabilir5,6,7. Bu nedenle, görüntüleme çözünürlüğünü ve verimini artıran yaklaşımlar, beyin fonksiyonlarını her ölçekte daha iyi anlamak için gereklidir.
Son gelişmeler, nöron popülasyonlarını işaretlemek ve manipüle etmek için moleküler ve genetik araç setini genişletti. Yeni floresan belirteçlerin geliştirilmesi, bu belirteçleri nöronlara sokmanın yeni yöntemleriyle birlikte, aynı hayvan veya beyin örneği 8 ,9,10,11içindeki etkileşime giren nöron popülasyonlarının diferansiyel etiketlenerek etiketlenerek. Işık opak lipitler tarafından dağıldığı için ve beyin dokusunun yüksek lipid içeriği göz önüne alındığında, görüntüleme nöronal popülasyonları öncelikle ince bölümlerle sınırlıdır veya derin yapıları görüntülemek için gelişmiş mikroskropsi tekniklerine (örneğin, konfokal, çoklu foton ve ışık tabakası mikroskopisi) güvenmiştir. Bununla birlikte, bu çabalar doku temizleme tekniklerindeki gelişmelerle büyük ölçüde desteklenmiştir. Berrak Lipid-exchanged Akrilamid-hibrid Sert Görüntüleme / immünostaining /yerinde melezleme uyumlu Doku-hYdrogel (CLARITY), ilgi çekici dokuların hidrojel monomerler (akrilamid ve bis-akrilamid) ile aşılanması ve daha sonra deterjanlarla yıkanması12. Hidrojel monomerler, optik olarak şeffaf ve makromolekül etiketlere geçirgen kararlı bir 3D hidrojel iskele oluşturmak için melezleşir. Nükleik asitler ve proteinler melezleştirilmiş matris içinde tutulurken, lipitler deterjan yıkamaları ile çıkarılır (Şekil 1). Bu, hücrelerin ve lipid olmayan moleküllerin orijinal şeklini ve yönünü koruyacak kadar sert, optik olarak ise derin yapıları yüksek çözünürlükte kolayca görüntüleyece kadar optik olarak şeffaf olan kararlı bir doku ile sonuçlanır. Doku yapısının ve oryantasyonunun bu şekilde korunması, kalın dilimlerin görüntülenmesini sağlar, böylece hücreden hücreye bağlantıları ve mekansal ilişkileri korur. Ayrıca, temizleme işlemi sırasında proteinlerin ve nükleik asitlerin yeri ve mevcudiyeti korunduğu için, temizlenmiş dokular ekspresyon bazlı belirteçlerin yanı sıra eksojen etiketleri de tutabilir. Böylece CLARITY, büyük miktarda derin beyin yapılarını ve bu yapılar arasındaki bağlantıları yüksek çözünürlükte görüntülemek için güçlü bir yöntem olarak kendini ödünç verir.
CLARITY kullanımı, nöronal popülasyonları görüntüleme yaklaşımlarını büyük ölçüde geliştirir. Bu teknik özellikle büyük miktarda görüntüleme verisi oluşturmada ustadır. CLARITY, birden fazla protein bazlı floresan formuyla iyi çalışır. Bu protokol, EGFP ve tdTomato ile seyrek etiket hücrelerine lentiviral tabanlı bir yaklaşım kullanır; bununla birlikte, tdTomato veya EGFP'yi rekonstrüksiyon için hücreleri etiketlemek için ifade eden transgenik muhabir alelleri rutin olarak kullanılmıştır. Hem fotoğrafa kararlı hem de parlak bir florofor seçmek önemlidir (örneğin, EGFP veya tdTomato). Ayrıca, floroforu ifade etmek için güçlü bir promotör kullanmak üstün kontrast ve görüntü kalitesi verir. Bu tekniğin dezavantajları, bu büyük miktarda verinin düzgün bir şekilde analiz edilmesi hem emek hem de zaman yoğun olabileceği için ortaya çıkar. Özel mikroskoplar verimi artırmaya ve iş yükünü azaltmaya yardımcı olabilir. Bununla birlikte, gelişmiş mikroskopların inşası, sahibi ve/veya işletilmeleri birçok laboratuvar için genellikle maliyet-yasaklayıcıdır. Bu çalışma, standart konfokal mikroskopi ile birlikte büyük bölümlerin CLARITY doku temizlemesini kullanarak yüksek çözünürlükte büyük miktarlarda sinir dokusunu görselleştirmek için yüksek verim, nispeten hızlı ve basit bir yöntem sunar. Bu protokol bu yaklaşımı aşağıdaki adımlarla açıklar: 1) sinir dokusunun parçalanması ve hazırlanması, 2) dokunun temizlenmesi, 3) dokunun montajı, 4) hazırlanan dilimlerin görüntülenmesi ve 5) mikroskopi görselleştirme yazılımı rekonstrüksiyonu ve analizi kullanılarak tam dilim görüntülerin işlenmesi (Şekil 2). Bu çabalar, nöron popülasyonlarını, nöronal bağlantı modellerini, 3D dendritik morfolojiyi, dendritik omurga bolluğunu ve morfolojisini ve sağlam beyin dokusu içindeki moleküler ifade kalıplarını analiz etmek için kullanılabilecek yüksek çözünürlüklü görüntülerle sonuçlanır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 1&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide (No-Bis)</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoretic Tissue Clearing Solution</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2158-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel Solution Kit</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C1310X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case</td>
			<td>fisher</td>
			<td>MT21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044</td>
			<td>Wako</td>
			<td>925-41020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-CLARITY Polymerization System</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-CLARITY Tissue Clearing System II</td>
			<td>Logos</td>
			<td>C30001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and quantification of intact neuronal dendrites via clarity tissue clearing

Beyin aktivitesi, nöronlar arasında geçen elektrokimyasal sinyaller, nöronal ağların bağlantı kalıpları ve bu nöronlar içindeki süreçlerin ve alt yapıların morfolojisi tarafından belirlenir. Bu nedenle, beyin fonksiyonu hakkında bilinenlerin çoğu, nöronların beyinde nasıl organize olduğu ve bağlandığı hakkında daha fazla fikir veren görüntüleme teknolojilerindeki gelişmelerin yanı sıra ortaya çıkmıştır. Doku temizlemedeki gelişmeler, kalın beyin dilimlerinin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine, morfolojik rekonstrüksiyonun ve dendritik çardaklar ve dikenler gibi nöronal alt yapıların analiz edilmesine izin sağlamaktadır. Birlikte, görüntü işleme yazılımındaki gelişmeler, büyük görüntüleme veri kümelerini hızlı bir şekilde analiz etme yöntemleri sağlar. Bu çalışma, CLARITY doku temizleme, konfokal mikroskopi ve görüntü analizi kullanarak etiketli sinir dokusunun kalın dilimlerini yüksek çözünürlükte işlemek, görselleştirmek ve analiz etmek için nispeten hızlı bir yöntem sunar. Bu protokol, sağlıklı beyinleri karakterize eden bağlantı kalıplarını ve nöronal morfolojileri ve hastalıklı beyin durumlarında ortaya çıkan bu özelliklerdeki değişiklikleri anlama çabalarını kolaylaştıracaktır.

Görüntü alındıktan sonra, temsili hücre morfolojisi gömülü istatistikler kullanılarak ve analiz yazılımı içindeki komut dosyalarını sınıflandırarak analiz edildi. Toplanan veriler (Şekil 6A) nöron 2'nin daha yüksek omurga yoğunluğuna sahip daha büyük bir dendritik yapıya sahip olduğunu yansıtmaktadır. Bir bütün olarak, veriler nöron 2'nin nöron 1'e kıyasla daha karmaşık bir dendritik yapıya sahip olduğunu göstermektedir. Bu sonucu doğrulamak için, n?...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing at JoVE.com

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

Nöronal dendritik morfoloji genellikle fonksiyon alttan. Gerçekten de, nöronların gelişimini etkileyen birçok hastalık süreci morfolojik bir fenotip ile kendini gösterir. Bu protokol, bozulmamış dendritik çardakları ve ilişkili dikenlerini analiz etmek için basit ve güçlü bir yöntemi açıklar.

CLARITY Doku Temizleme Yoluyla Bozulmamış Nöronal Dendritlerin Görüntülenmesi ve Nicelleştirilmesi

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

Bu protokol, araştırmacıların nöronal bağlantı kalıpları ve bir devre içinde işlevin temelini alan mekansal organizasyon hakkında önemli soruları yanıtlamasına izin verecektir. Bu tekniğin temel avantajı, bozulmamış üç boyutlu dokunun derinliklerinde bulunan nöronal morfolojilerin görselleştirilmesini mümkün hale getirmedir. Bu yöntem basittir ve böylece kolayca tekrarlanabilir.İlk kez deney yapanlar bu tekniği yaparken rahat olmalıdır. Yüksek kaliteli veri elde etmek için net bir doku örneğine sahip olmak zorunludur. Uygun doku netliği ve temizleme tekniklerinin görsel gösterimi kolayca tekrarlanabilir sonuçlar sağlayacaktır.Başlamak için, hidrojel batırılmış beyin dokusunu eksi 90 kilopaskal vakumla 37 santigrat derecede üç saat boyunca bir vakum inkübatörüne yerleştirin. Vakumun düzgün oluşmasını sağlamak için tüp üstünü sökülmüş olarak bırakın. Pbs ile dokuyu oda sıcaklığında 10 dakika hafif sallayarak yıkayın.Polimerize doku örneğini, oda içindeki dokunun yönünü takip derek elektroforeis odasına yerleştirin. Hazneyi ve hazneyi birlikte verilen elektroforez SDS tamponu ile doldurun. Örneği 70 volt, bir amper ve 35 santigrat derecede, mililitre doku başına yaklaşık iki saat boyunca sabit akımla çalıştırın.Örneği odadan çıkarıp aynı yönde değiştirerek beyin dokusunun yeterli temizlenmesi için periyodik olarak kontrol edin. Numune temizlemeyi bitirdikten sonra, PBS'yi oda sıcaklığında bir gece boyunca PBS'de yıkayın ve PBS'yi mümkün olduğunca sık taze PBS ile değiştirin. PBS'deki son yıkamayı takiben, dokuyu oda sıcaklığında beş dakika boyunca deiyonize suda üç kez yıkayın.Doku opak hale gelecek ve genişleyebilir. Refraktif indeks eşleştirme çözeltislerindeki dokuyu oda sıcaklığında en az dört saat kuluçkaya yatırın. Kuluçka sırasında, numuneyi görüntülemek için uygun bir muhafaza odası inşa edin.Montaj için bir taban olarak cam bir slayt kullanarak başlayın, ardından kauçuk veya plastik ara parçaları yatırın ve herhangi bir delik olmadığından emin olarak süper tutkalla sabitleyin. Şeffaf dokuyu, kırılma indisi eşleştirme çözeltisi ile önceden doldurulmuş montaj odasına yerleştirin. Üzerine cam bir kapak kılıfı yerleştirip oje ile kapatarak dokuyu güvenli bir şekilde monte edin.Bu dokuyu, doğrudan camın üzerine bir damla kırma indeksi eşleştirme montaj çözeltisi ekleyerek görüntüleyin. Beş milimetreden fazla kalınlıkta dokular için büyük bir doku görüntüleme odası oluşturmak için, yüksek duvarlı 10 santimetrelik bir cam tabak kullanın. Tüpün çapının kullanılan objektif lensin namlusunun kabul edecek kadar büyük olduğundan emin olarak merkeze 50 mililitrelik bir konik tüp yerleştirin.Suda% 3 agarose yapın ve cam tabak ile konik tüp arasındaki boşluğa dökün, ardından bir saat soğumasını bekleyin. Bu katı agarose halkası oluşturacak. Dokuyu süper tutkal kullanarak odanın dibine güvenli bir şekilde yapıştırın ve odayı havadan korunmadığı ve dört santigrat derecede depolanmadığı sürece polimerize olmaya başlayabilecek kırılma indeksi eşleştirme çözeltisi ile doldurun.Konfokal mikroskop kullanarak görüntüyü alın. İlgili tüm görüntüleme ekipmanlarını açın. Örneği sahne alanına yerleştirin.Daldırma ortamına hedefle dikkatlice yaklaşın ve sürekli bir medya sütunu oluşturur. Epifluoresansı kullanarak uygun bir görüntüleme alanı bulun. Çözünürlük ve tarama hızı ayarlarını ayarlayarak başlayın.Konfokal mikroskop kullanarak görüntüleme yapıyorsanız, en küçük optik bölümü ve dolayısıyla en iyi Z çözünürlüğünü elde etmek için iğne deliğini tamamen kapatın. Yüksek sinyal-gürültü oranına sahip uygun bir görüntü elde edilene kadar lazer gücünü veya sensör kazancını kademeli olarak artırın. Standart EGFP veya tdTomato iki renkli görüntüleme kullanıyorsanız, ışık toplama ayarlarını yapın.Z-stack parametrelerini dokunun gözlemlenen başlangıç ve bitiş noktalarına göre ayarlayın. Adım boyutunu istediğiniz Z çözünürlüğe göre ayarlayın. Daha küçük adım boyutları daha fazla Z çözünürlüğü sağlar, ancak örnek ağartmaya neden olabilir.Görüntü alma ayarlarından memnun olduğunuzda, görüntüyü alın. Görüntünün yüksek sinyal-gürültü oranına sahip olduğundan ve yapıların farklı sınırlarını gösterdiğinden emin olun. Görüntü alındıktan sonra, temsili hücre morfolojisi gömülü istatistikler kullanılarak ve analiz yazılımı içindeki komut dosyalarını sınıflandırarak analiz edildi.Toplanan veriler, Neuron 2'nin Nöron 1'e kıyasla daha yüksek omurga yoğunluğuna sahip dendritik yapıdan daha büyük olduğunu yansıtmaktadır. Bu sonucu doğrulamak için, Neuron 2'nin, somadan 50 ila 100 mikrometredeki Scholl kavşaklarının sayısının artmasıyla belirtildiği gibi Nöron 1'den daha dendirik olarak daha karmaşık olduğunu doğrulayan standart Scholl analizi yapıldı. Nöron 1, daha filopodia benzeri şekillere sahip daha büyük bir omurga oranı içerir ve olgunlaşmamış bir omurga alt tipidir.Mantar dikeni olarak adlandırılan tanımlanmış kafalara sahip dikenler muhtemelen daha gelişmiş ve olgun sinapslar içerir. Böylece, Neuron 2 daha olgun dikenlerin daha yüksek yoğunluğu ile daha olgundur. Temizlendikten sonra, doku parçaları geleneksel immünhistokimya kullanılarak boyanabilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Beyin-implante Microdevices ve Çevresi Doku Bozulmamış Histolojik Karakterizasyonu

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Kullanımı Netlik Fare Omurilik içinde Serotonerjik Elyaf Görüntüleme / KÜBİK Tekniği

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Pasif kullanımı Netlik Fare Merkezi Sinir Sistemi Optik Takas

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Elektrofizyoloji ve Kalsiyum-görüntüleme için akut nöronal Doku Uzamış İnkübasyon

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Roman pasif optik şeffaflık bütün sinir dokusunda hızlı üretim için yöntemleri Temizleme

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy

Boyuna floresans mikroskobu ile nöronal hayatta kalma izleme

Standard cytotoxicity assays, which require the collection of lysates or fixed cells at multiple time points, have limited sensitivity and capacity to ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Sıçan Beyin Dokusu için Hidrofobik Doku Temizleme Yöntemi

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Davranış ve Uyaran Yanıtları Sırasında Yetişkin Drosophila melanogaster'ı Tüm Beyin Görüntülemeye Hazırlama

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

CLARITY Doku Temizleme Yöntemi ile Tüm Mount Retinaların İmmünasyonunun İmmünasyon

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...