Name: profiling of h3k4me3 modification in plants using cleavage under targets and tagmentation
Uploaded: 2022-04-22T13:00:00
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这项工作得到了国家自然科学基金（NSFC，31900395，31971985，31901430）和中央大学基础研究基金海南崖州湾种子实验室（JBGS，B21HJ0403），中国海南省自然科学基金（320LH002）和JCIC-MCP项目的资助。

1. 准备转座酶和储备溶液（第1天）
注意：在这一部分中，寡核苷酸适配器与Tn5转座酶复合以产生活性转座酶。
<ol><li>使用退火缓冲液（10 mM Tris pH 8.0，50 mM NaCl，1 mM EDTA）将引物（引物A，引物B和引物C）稀释至100μM浓度（引物的顺序信息参见 表 1，工作溶液配方参见 表2 ）。储存在-20°C直至使用。</li>
	<li>在PCR管中设置以下两个反应：反...

<ol>
	<li>Abascal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+ENCODE.">Perspectives on ENCODE.</a> Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+chromatin+profiling+of+H3K4me3+modification+in+cotton+using+CUT&amp;Tag.">Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&amp;Tag.</a> Plant Methods. 16, 120 (2020).</li><li>Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+low-cost+chromatin+profiling+with+CUT&amp;Tag.">Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&amp;Tag.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).</li><li>Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+CUT&amp;Tag+profiles+histone+modifications+and+transcription+factors+in+complex+tissues.">Single-cell CUT&amp;Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues.</a> Nature Biotechnology. , (2021).</li><li>Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+extraction+of+cotton+(Gossypium+spp.)+genomic+DNA+suitable+for+RFLP+or+PCR+analysis.">A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).</li><li>Haring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation:+optimization,+quantitative+analysis+and+data+normalization.">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> Plant Methods. 3 (1), 11 (2007).</li><li>Ouyang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+low-input+profiling+of+histone+marks+in+plants+using+nucleus+CUT&amp;Tag.">Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&amp;Tag.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 634679 (2021).</li><li>Swift, J., Coruzzi, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+matter+of+time+-+How+transient+transcription+factor+interactions+create+dynamic+gene+regulatory+networks.">A matter of time - How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+a+method+for+assaying+chromatin+accessibility+genome-wide.">ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).</li></ol>

在这里，我们描述了CUT&Tag，这是一种以高分辨率和极低背景生成DNA文库的技术，与染色质免疫沉淀（ChIP）相比，使用少量细胞，程序简化。我们在棉花叶片中成功分析H3K4me3表明，CUT&Tag最初是为动物细胞设计的，也可以用于植物细胞。通常用于ChIP测定8 的Tris缓冲系统和用于动物CUT&Tag的HEPES缓冲系统都适用于使用植物核的CUT&Tag4，9。完...

转录因子结合DNA位点和与组蛋白修饰标记相关的开放染色质在调节基因表达方面起着关键的功能作用，是表观遗传学研究的主要焦点1。传统上，染色质免疫沉淀测定（ChIP）与深度测序（ChIP-seq）相结合已被用于全基因组鉴定特定染色质组蛋白修饰或具有特定蛋白质的DNA靶标，并在表观遗传学领域被广泛采用2。靶标下的切割和标记（CUT&Tag）技术最初由Henikoff实验室开发，用于捕获整个基因组中与蛋白质相关的DNA片段5。与 ChIP 相比，CUT&Tagcan 使用少量细胞和简化的程序以高分辨率和极低背景生成 DNA 文库3。迄今为止，已经建立了使用CUT&Tag分析具有特定组蛋白修饰的染色质区域的方法在动物细胞中4，5。具体而言，单细胞CUT&Tag（scCUT&Tag）也已成功开发用于人体组织和细胞6。然而，由于细胞壁和次级代谢物的复杂性，CUT&Tag对植物组织来说在技术上仍然具有挑战性。 
此前，我们报道了一种 CUT&Tag 方案，该方案使用从同种异体四倍体棉叶中分离出的完整核4。为了证明使用植物组织进行细胞核分离和DNA捕获的效率，本文介绍了分析程序。主要步骤包括完整细胞核分离、与抗体 原位 孵育染色质修饰、转座酶孵育、适配器整合和 DNA 文库制备。故障排除的重点是用于植物核分离和质量控制的CUT&Tag库准备。 
在这项研究中，我们提出了一个针对植物的改进的CUT&Tag策略。我们不仅为棉花叶片中的H3K4me3分析提供了分步方案，而且还为植物细胞核分离提供了优化的方法，包括选择洗涤剂浓度以进行适当细胞裂解的策略和过滤细胞核的策略。此更新的协议中还包含带有关键注释的详细步骤。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H3K4me3</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>07-473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal rabbit IgG</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>12-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digitonin (~50% (TLC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141</td>
			<td>Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 1 M MgCl2 stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539133-1SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride (KCl)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 1 M KCl stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 5 M NaCl stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spermidine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 2 M spermidine stock solution, store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 20% Triton X-100 stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&#38;Tag</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>S602/S603</td>
			<td>Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruePrep Amplify Enzyme</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>ABI9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>MIULAB</td>
			<td>HS-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One&#160; spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling of h3k4me3 modification in plants using cleavage under targets and tagmentation

染色水平上的表观基因组调控，包括DNA和组蛋白修饰，转录因子的行为以及非编码RNA及其招募的蛋白质，导致基因表达的时间和空间控制。靶标下裂解（CUT&Tag）是一种酶系留方法，其中特异性染色质蛋白首先通过其特异性抗体识别，然后抗体系留蛋白A-转座酶（pA-Tn5）融合蛋白，该蛋白通过镁离子的活化 原位 裂解靶染色质。在这里，我们提供我们之前发表的CUT&Tag方案，使用从异体四倍体棉叶中分离出的完整细胞核进行修饰。这种循序渐进的方案可用于植物的表观基因组学研究。此外，还对植物核分离进行了实质性修改，并提出了批评性意见。

图 1 描述了 CUT&Tag 工作流程。 图2 显示了完整细胞核的DAPI染色。“原子核分离”步骤的目标是获得足够量的完整原子核，以进行随后的CUT&Tag反应。 图3 显示了琼脂糖凝胶对PCR产物的电泳。设置实验时需要并行IgG阴性对照。与IgG对照组相比，用H3K4me3抗体样品提取的大部分DNA片段范围为约280至500个碱基对。 图4</strong...

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Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

靶标下裂解（CUT&Tag）是一种有效的染色质表观基因组分析策略。该协议提出了一种改进的CUT&Tag策略，用于分析植物中的组蛋白修饰。

在靶标和标记下使用裂解分析植物中的H3K4me3修饰

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...

该实验的总体目标是在整个基因组中鉴定与蛋白质相关的DNA片段，这反映了染色质的状态。为了实现这一目标，进行了三次特殊行动。首先，从植物细胞中分离出完整的细胞核。其次，染色质的修饰被特异性抗体原位识别。第三，抗体拴系蛋白A-转座酶融合蛋白Tn5转座酶，在镁离子的活化下原位裂解染色质。然后将DNA片段和染色质修饰结合位点与适配器整合，并准备好进行DNA制备。聚合酶链反应富集增强了生成测序。细胞水平上的表观基因组学调控，包括DNA和组蛋白修饰，转录因子的行为以及与其募集蛋白的非编码RNA，导致基因表达的时间和空间控制。Henikoff实验室开发的CUT&Tag技术是一种酶系留方法，用于高效染色质表观基因组学分析。在这里，我们使用棉叶作为实验材料，并使用组蛋白H3赖氨酸-4三甲基化的抗体进行染色质分析作为示例。我们为工厂的CUT&Tag性能提供了一个改进的协议和视频。对于使用CUT&Tag的每种样品制备，收集克棉花叶组织。将叶片用液氮研磨成细粉，并转移到含有25 mL冷冻核隔离缓冲液A的50 mL猎鹰管中，将缓冲溶液轻轻混合，并将管在冰上孵育5分钟，轻轻摇晃以均匀分散物料。然后以500相对离心力或rcf，在4摄氏度下旋转5分钟，形成细胞沉淀。倾析上清液，沉淀用20mL冷冻核分离缓冲液B重悬，补充0.5%Triton。将管轻轻倒置以完全重悬沉沉淀。然后将所得的细胞裂解物用两个筛子的组合过滤，在顶部使用500目筛子除去较大的组织碎片。在底部使用1000目筛子来收集原子核。筛子的适当网孔尺寸的选择取决于植物核的大小。在筛子的背面使用无菌滤纸来吸收部分裂解物和小细胞碎片。将含有细胞核的裂解物转移到新鲜的1.5毫升离心管中，并在300 rcf下旋转4分钟，在4摄氏度下收集细胞核。离心后，使用移液器吸头尽可能多地去除上清液。用量为800微升，加入核洗涤缓冲液。并将管轻轻倒置以重悬原子核。管子在300 rcf下再次旋转，在4摄氏度下旋转四分钟。在总共三次洗涤后，将所得的细胞核在新鲜的1.5毫升离心管中混合，并以300 rcf旋转，在4摄氏度下旋转4分钟。使用移液器吸头尽可能多地去除剩余的缓冲液。下一步是抗体的孵育。将50微升细胞核的等分试样重悬于1毫升抗体缓冲液中，并补充有EDTA，BSA，蛋白酶抑制剂混合物在洋地黄素中。将150微升的等分试样置于新鲜的1.5毫升管中进行一次反应，向每个管中加入两微升抗体。在该测定中，添加抗体后建立了抗组蛋白-H3-赖氨酸-4-三甲基化抗体和免疫球蛋白G阴性对照组的两个生物重复。将溶液轻轻混合，并将管子放在水平振荡器上，以12rpm在4摄氏度下杂交过夜。第二天早上，取出管子，使用800微升免疫沉淀洗涤缓冲液洗涤细胞核。将管轻轻倒置以进行混合，并在室温下以12rpm将其放在水平振荡器上五分钟。洗涤后，管子在4摄氏度下以300 rcf旋转四分钟。离心后，使用移液器吸头除去上清液。重复了三次洗涤。第三次洗涤后，将管子在四摄氏度下旋转300 rcf两分钟，并使用移液器吸头尽可能多地去除剩余的缓冲液。制备用于孵育的Tn5转座酶混合物。将一微升转座酶加入到每150微升转座酶培养缓冲液中。我们建议根据反应次数首先制备转座酶溶液混合物。然后向每个管中加入150微升的等分试样。将溶液轻轻混合，并在室温下以12rpm的水平振荡器放置两小时。每10至15分钟轻轻混合一次管子。孵育后，使用800微升免疫沉淀洗涤缓冲液在室温下洗涤细胞核三次，以除去未结合的Tn5转座酶。第三次洗涤后，将管子在4摄氏度下以300 rcf旋转两分钟，并使用移液器吸头除去剩余的缓冲液。对于标记步骤，向反应管中加入300微升的标记缓冲液。将溶液充分混合，在37摄氏度下孵育一小时。孵育后，加入10微升0.5摩尔/升EDTA在30微升10%SDS下测定反应。接下来加入300微升DNA提取缓冲液。进行不规则的DNA提取。DNA片段溶解在25微升无菌水中。24微升用于NGS文库构建中的PCR扩增。该图显示了带有DAPI成像的完整细胞核染色剂，在显微镜下获得足够数量的完整且相对干净的细胞核是CUT&Tag的关键步骤。PCR后，转移两微升，并在1.5%琼脂糖凝胶上检查DNA的大小。该图显示与免疫球蛋白基因阴性对照相比。来自组蛋白H3赖氨酸4三甲基化样品的大部分DNA片段应为280至500个碱基对。DNA片段可以被纯化，然后通过高通量测序进行分析。该图显示了抗组蛋白H3赖氨酸4三甲基化抗体与免疫球蛋白G阴性对照组的结果生成测序。与ChIP-seq相比，该技术使用少量细胞以高分辨率和极低背景生成DNA文库，并且程序简化。CUT&Tag是一种新方法，仍在进行中。

Research

JoVE Journal

Biology

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科研

生物学

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