Name: profiling of h3k4me3 modification in plants using cleavage under targets and tagmentation
Uploaded: 2022-04-22T13:00:00
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Este trabalho foi apoiado financeiramente em parte por subsídios da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430), e fundos de pesquisa fundamental para as Universidades Centrais, Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (320LH002) e projeto JCIC-MCP.

1. Prepare soluções de transposase e estoque (Dia 1)
NOTA: Nesta parte, os adaptadores de oligonucleotídeos são complexos com transposase Tn5 para fazer transposase ativa.
<ol><li>Primers diluídos (primer A, primer B e primer C) a 100 μM de concentração usando o buffer de renascimento (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) (consulte a Tabela 1 para obter informações sequenciais de primers e Tabela 2 para as receitas para soluç...

<ol>
	<li>Abascal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+ENCODE.">Perspectives on ENCODE.</a> Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+chromatin+profiling+of+H3K4me3+modification+in+cotton+using+CUT&amp;Tag.">Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&amp;Tag.</a> Plant Methods. 16, 120 (2020).</li><li>Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+low-cost+chromatin+profiling+with+CUT&amp;Tag.">Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&amp;Tag.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).</li><li>Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+CUT&amp;Tag+profiles+histone+modifications+and+transcription+factors+in+complex+tissues.">Single-cell CUT&amp;Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues.</a> Nature Biotechnology. , (2021).</li><li>Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+extraction+of+cotton+(Gossypium+spp.)+genomic+DNA+suitable+for+RFLP+or+PCR+analysis.">A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).</li><li>Haring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation:+optimization,+quantitative+analysis+and+data+normalization.">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> Plant Methods. 3 (1), 11 (2007).</li><li>Ouyang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+low-input+profiling+of+histone+marks+in+plants+using+nucleus+CUT&amp;Tag.">Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&amp;Tag.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 634679 (2021).</li><li>Swift, J., Coruzzi, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+matter+of+time+-+How+transient+transcription+factor+interactions+create+dynamic+gene+regulatory+networks.">A matter of time - How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+a+method+for+assaying+chromatin+accessibility+genome-wide.">ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).</li></ol>

Aqui, descrevemos a CUT&Tag, uma tecnologia para gerar bibliotecas de DNA em alta resolução e fundo excepcionalmente baixo usando um pequeno número de células com um procedimento simplificado em comparação com a imunoprecipitação de cromatina (ChIP). Nosso sucesso com o perfil H3K4me3 em folhas de algodão sugere que a CUT&Tag, que foi projetada pela primeira vez para células animais, também pode ser usada para células vegetais. Tanto o sistema tampão Tris comumente usado para o ensaio ChIP8...

Os locais de DNA de ligação do fator de transcrição e a cromatina aberta associadas às marcas de modificação de histona servem papéis funcionais críticos na regulação da expressão genética e são os principais focos da pesquisa epigenética1. Convencionalmente, o ensaio de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) juntamente com sequenciamento profundo (ChIP-seq) tem sido usado para a identificação em todo o genoma de modificação de histona cromatina específica ou alvos de DNA com proteínas específicas, e é amplamente adotado no campo da epigenética2. O decote sob alvos e a tecnologia de tagmentação (CUT&Tag) foi originalmente desenvolvido pelo Laboratório Henikoff para capturar os fragmentos de DNA afiliados à proteína em todo o genoma5. Quando comparado ao ChIP, a CUT&Tagcan gera bibliotecas de DNA em alta resolução e fundo excepcionalmente baixo usando um pequeno número de células com um procedimento simplificado3. Até o momento, foram estabelecidos métodos para análise de regiões de cromatina com modificações específicas de histona utilizando CUT&Tag em células animais4,5. Especificamente, cut&tag de célula única (scCUT&Tag) também foi desenvolvido com sucesso para tecidos humanos e células6. No entanto, devido à complexidade da parede celular e metabólitos secundários, a CUT&Tag ainda é tecnicamente desafiadora para tecidos vegetais.
Anteriormente, relatamos um protocolo CUT&Tag usando núcleos intactos isolados de folhas de algodão allotetraploid4. Para demonstrar a eficiência do isolamento dos núcleos e da captura de DNA utilizando tecido vegetal, o procedimento de criação de perfil é apresentado aqui. Os principais passos incluem isolamento de núcleos intactos, incubação in situ com o anticorpo para modificação de cromatina, incubação transposase, integração adaptadora e preparação da biblioteca de DNA. A solução de problemas se concentra na preparação da biblioteca CUT&Tag para o isolamento dos núcleos da planta e controle de qualidade.
Neste estudo, apresentamos uma estratégia refinada da CUT&Tag para plantas. Não só fornecemos um protocolo passo-a-passo para o perfil H3K4me3 em folhas de algodão, mas também fornecemos uma metodologia otimizada para o isolamento dos núcleos vegetais, incluindo a estratégia de seleção da concentração de detergente para a lise celular adequada e a estratégia de filtragem dos núcleos. Passos detalhados com comentários críticos também estão incluídos neste protocolo atualizado.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H3K4me3</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>07-473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal rabbit IgG</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>12-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digitonin (~50% (TLC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141</td>
			<td>Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 1 M MgCl2 stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539133-1SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride (KCl)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 1 M KCl stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 5 M NaCl stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spermidine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 2 M spermidine stock solution, store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 20% Triton X-100 stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&#38;Tag</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>S602/S603</td>
			<td>Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruePrep Amplify Enzyme</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>ABI9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>MIULAB</td>
			<td>HS-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One&#160; spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling of h3k4me3 modification in plants using cleavage under targets and tagmentation

Regulação epigenômica no nível cromático, incluindo modificações de DNA e histona, comportamentos de fatores de transcrição e RNAs não codificantes com suas proteínas recrutadas, levam ao controle temporal e espacial da expressão genética. O decote sob alvos e tagmentação (CUT&Tag) é um método de enzimática em que a proteína específica da cromatina é primeiro reconhecida por seu anticorpo específico, e então o anticorpo amarra uma proteína de fusão A-transposase (pA-Tn5), que corta a cromatina alvo in situ pela ativação de íons de magnésio. Aqui, fornecemos nosso protocolo CUT&Tag publicado anteriormente usando núcleos intactos isolados de folhas de algodão allortetraploid com modificação. Este protocolo passo a passo pode ser usado para pesquisa epigenômica em plantas. Além disso, modificações substanciais para o isolamento dos núcleos vegetais são fornecidas com comentários críticos.

A Figura 1 retrata o fluxo de trabalho CUT&Tag. A Figura 2 mostra a coloração da DAPI dos núcleos intactos. O objetivo do passo do "isolamento dos núcleos" foi obter os núcleos intactos em uma quantidade suficiente para a reação subsequente da CUT&Tag. A Figura 3 mostra a eletroforese de gel agarose dos produtos PCR. O controle negativo do IgG é necessário em paralelo ao configurar o experimento. Em comparação com o grupo...

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Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

O decote sob metas e tagmentação (CUT&Tag) é uma estratégia eficiente de perfil epigenômico de cromatina eficiente. Este protocolo apresenta uma estratégia refinada da CUT&Tag para o perfil das modificações de histonas nas plantas.

Perfil da modificação H3K4me3 em plantas usando decote sob alvos e tagmentação

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...

O objetivo geral do experimento foi identificar fragmentos de DNA afiliados à proteína em todo o genoma, o que refletiu o status da cromatina. Para atingir esse objetivo, foram realizadas três operações especiais. Em primeiro lugar, os núcleos intactos das células vegetais foram isolados.Em segundo lugar, as modificações na cromatina foram reconhecidas por um anticorpo específico in situ. Em terceiro lugar, o anticorpo amarrando uma proteína de fusão de transposase, transposase Tn5, cutucar a cromatina in situ sob a ativação de íons de magnésio. Os fragmentos de DNA e os locais de ligação da modificação da cromatina foram então integrados com adaptadores e prontos para a preparação do DNA.O enriquecimento de reação em cadeia de polimerase melhorou o sequenciamento da geração. A regulação epigenômica no nível cromático, incluindo modificações de DNA e histona, comportamentos de fatores de transcrição e RNAs não codificantes com suas proteínas recrutadas, levam ao controle temporal e espacial da expressão genética. A tecnologia CUT&Tag desenvolvida pela Henikoff Lab é um método de tethering de enzimas para perfil epigenômico de cromatina com alta eficiência.Aqui empregamos as folhas de algodão como materiais experimentais, e para realizar o perfil de cromatina usando anticorpo de Histone H3 Lysine-4 Trimetilação como exemplo. Fornecemos um protocolo refinado com vídeo para desempenho da CUT&Tag em plantas. Para cada preparação amostral utilizando CUT&Tag, foram coletados gramas de tecido de folha de algodão.A folha foi moída em um pó fino com nitrogênio líquido, e transferida para um tubo falcão de 50 mL contendo 25 mL de tampão de isolamento nuclear refrigerado A.A solução tampão foi misturada suavemente, e o tubo foi incubado no gelo por cinco minutos com suave agitação para dispersar o material uniformemente. Foi então girado a 500 relativas da força centrífuga ou rcf, a 4 graus Celsius, por cinco minutos, para formar a pelota celular. O supernante foi decantado e a pelota foi resuspended com 20 mL de tampão de isolamento nuclear refrigerado B, complementado com 0,5% Triton.O tubo foi invertido suavemente para resuspensar a pelota completamente. O liseto celular resultante foi então filtrado com uma combinação de duas peneiras, uma peneira de 500 malhas foi usada em cima para remover os detritos de tecido maiores. E uma peneira de 1000 malhas foi usada na parte inferior para coletar os núcleos.A escolha do tamanho adequado da malha das peneiras depende do tamanho dos núcleos das plantas. O papel filtro estéril foi usado na parte de trás da peneira para absorver parte do lise e pequenos detritos celulares. O lysate contendo os núcleos foi transferido para um tubo de centrífuga fresco de 1,5 mililitros, e girou a 300 rcf por quatro minutos, a 4 graus Celsius graus Celsius para coletar os núcleos.Após a centrifugação, uma ponta de pipeta foi usada para remover o máximo possível do supernante. Uma quantidade de 800 microliters, um tampão de lavagem nuclear foi adicionado. E o tubo foi invertido suavemente para resuspensar os núcleos.O tubo foi girado novamente a 300 rcf, por quatro minutos a 4 graus Celsius. Após um total de três lavagens, os núcleos resultantes foram combinados em um tubo de centrífugas fresco de 1,5 mililitros, e girados a 300 rcf, por quatro minutos a 4 graus Celsius. Uma ponta de pipeta foi usada para remover o máximo possível do buffer restante.O passo seguinte foi a incubação do anticorpo. Uma alíquota de 50 microliters de núcleos foi resuspended em 1 mililitro de tampão de anticorpos suplementado com EDTA, BSA, coquetel inibidor de protease em digitonina. Uma alíquota de 150 microlitres da suspensão dos núcleos foi colocada em um tubo fresco de 1,5 mililitro para uma reação, dois microliters de anticorpos foram adicionados a cada tubo.Neste ensaio, duas réplicas biológicas para o anticorpo anti-histone-H3-Lysine-4-Trimethylation e grupos de controle negativos de imunoglobulina G foram criadas após a adição de anticorpos. A solução foi misturada suavemente, e os tubos foram deixados em um agitador horizontal para hibridização durante a noite a quatro graus Celsius em 12 rpm. Na manhã seguinte, os tubos foram retirados e os núcleos foram lavados usando 800 microliters de tampão de lavagem de imuno precipitação.O tubo foi invertido suavemente para mistura e foi deixado no agitador horizontal por cinco minutos à temperatura ambiente em 12 rpm. Após a lavagem, o tubo foi girado a 300 rcf por quatro minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, o supernatante foi removido usando uma ponta de pipeta.Isso se repetiu para um total de três lavagens. Após a terceira lavagem, o tubo foi girado a 300 rcf por dois minutos a quatro graus Celsius, e uma ponta de pipeta foi usada para remover o buffer restante o máximo possível. Para preparar a mistura de transposase Tn5 para incubação.Um microliter de transposase foi adicionado a cada 150 microlitres do buffer de incubação transposase. Recomendamos preparar o mix de solução transposase primeiro de acordo com o número de reações. E, em seguida, adicionar uma alíquota de 150 microliters a cada tubo.A solução foi misturada suavemente e deixada em um agitador horizontal à temperatura ambiente em 12 rpm por duas horas. Os tubos foram misturados suavemente a cada 10 a 15 minutos. Após a incubação, os núcleos foram lavados três vezes usando 800 microliters de tampão de lavagem de imuno precipitação à temperatura ambiente para remover a transposase Tn5 não ligada.Após a terceira lavagem, o tubo foi girado a 300 rcf por dois minutos a quatro graus Celsius, e uma ponta de pipeta foi usada para remover o tampão restante. Para a etapa de tagmentação, 300 microliters de tampão de tagmentação foram adicionados ao tubo de reação. A solução foi bem misturada e incubada a 37 graus Celsius por uma hora.Após a incubação foram adicionados 10 microliters de 0,5 mol por litro EDTA a 30 microliters de 10% SDS para determinar a reação. Os próximos 300 microliters de tampão de extração de DNA foram adicionados. Foi realizada extração irregular de DNA.Os fragmentos de DNA foram dissolvidos em 25 microlitres de água estéril. Foram utilizados 24 microliters para amplificação de PCR na construção de bibliotecas NGS. Esta figura mostra a mancha de núcleos intactos com DAPI em imagem, sob um microscópio obter uma quantidade adequada de núcleos intactos e relativamente limpos é o passo crítico para a CUT&Tag.Após a PCR, dois microlitres foram transferidos e o tamanho do DNA foi verificado em gel de 1,5%. Este número mostra que se compara com o controle negativo do gene da imunoglobulina. A maior parte dos fragmentos de DNA da amostra de Lysina 4 De Lysina 4 de Histone h3 deve variar de 280 a 500 pares de base.Os fragmentos de DNA podem ser purificados e, em seguida, perfilados por sequenciamento de alto rendimento. Este número mostra o sequenciamento de geração de resultados para o anticorpo anti-histone H3 Lysine 4 Trimetilação comparar com os grupos de controle negativos da imunoglobulina G. Esta tecnologia gera as bibliotecas de DNA em alta resolução e fundo excepcionalmente baixo usando um pequeno número de células com um procedimento simplificado em comparação com chip-seq.CUT&Tag é um novo método e ainda está em andamento.

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