Name: developing 3d organized human cardiac tissue within a microfluidic platform
Uploaded: 2021-06-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform at JoVE.com

نود أن نشكر جائزة NSF CAREER #1653193، وجائزة المحقق الجديد للجنة أريزونا للبحوث الطبية الحيوية (ABRC) (ADHS18-198872)، وجائزة مؤسسة فلين لتوفير مصادر التمويل لهذا المشروع. تم الحصول على خط hiPSC ، SCVI20 ، من جوزيف سي وو ، دكتوراه في الطب ، دكتوراه في معهد ستانفورد لأمراض القلب والأوعية الدموية بتمويل من NIH R24 HL117756. تم الحصول على خط hiPSC ، IMR90-4 ، من معهد WiCell للأبحاث55،56.

تنفيذ جميع معالجة الخلية وإعداد الكاشف داخل خزانة السلامة البيولوجية. تأكد من أن جميع الأسطح والمواد والمعدات التي تتلامس مع الخلايا معقمة (أي الرش بالإيثانول بنسبة 70٪). يجب استزراع الخلايا فيحاضنة رطبة تبلغ 37 درجة مئوية، 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. يتم تنفيذ جميع ثقافة hiPSC والتمايز في ...

تشكيل نموذج الأنسجة القلبية البشرية في المختبر مع تعزيز التفاعلات الخلية الخلية وهيكل 3D المحاكاة الحيوية أمر حتمي للبحوث الأساسية القلب والأوعية الدموية والتطبيقات السريريةالمقابلة 1. يشرح هذا البروتوكول الموجز تطوير أنسجة القلب غير المثيلية البشرية ثلاثية الأبعاد د?...

وقد تم استكشاف نهج هندسة الأنسجة على نطاق واسع، في السنوات الأخيرة، لمرافقة في النتائج السريرية في الجسم الحي في الطب التجديدي والنمذجة المرض1،2. وقد تم التركيز بشكل خاص على نمذجة الأنسجة القلبية في المختبر بسبب الصعوبات الكامنة في مصادر الأنسجة القلبية الأولية البشرية وإنتاج بدائل ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في المختبر ، مما يحد من الفهم الأساسي للآليات المعقدة لأمراض القلب والأوعية الدموية (CVDs)1،3. وقد شملت النماذج التقليدية في كثير من الأحيان 2D مقايسات ثقافة أحادية الطبقة. ومع ذلك ، فإن أهمية زراعة خلايا القلب داخل بيئة ثلاثية الأبعاد لمحاكاة كل من المناظر الطبيعية الأصلية للقلب والتفاعلات الخلوية المعقدة قد تميزت على نطاق واسع4،5. بالإضافة إلى ذلك، شملت معظم النماذج المنتجة حتى الآن ثقافة أحادية من CMs تختلف عن الخلايا الجذعية. ومع ذلك ، يتكون القلب من أنواع خلايا متعددة6 داخل بنية ثلاثية الأبعاد معقدة7، مما يبرر الحاجة الماسة لتحسين تعقيد تكوين الأنسجة داخل نماذج المختبر ثلاثية الأبعاد لمحاكاة المكونات الخلوية للقلب العضلي الأصلي بشكل أفضل.
حتى الآن، تم استكشاف العديد من النهج المختلفة لإنتاج نماذج 3D المحاكاة الحيوية من عضلة القلب8. وتتراوح هذه النهج من الاجهزة التجريبية التي تسمح لحساب في الوقت الحقيقي من القوة المتولدة، من CMs أحادية الثقافة المصنفة على أفلام رقيقة (تعتبر الأفلام رقيقة العضلات (MTFs))9،إلى الخلايا القلبية المشاركة في الثقافة 3D المصفوفات هيدروجيل علقت بين cantilevers قائمة بذاتها (تعتبر أنسجة القلب المهندسة (EHTs))10. وقد ركزت نهج أخرى على تنفيذ تقنيات micromolding لتقليد أنيسوتروبي عضلة القلب, من CMs أحادية الثقافة في هيدروجيل 3D علقت بين microposts جاحظ في التصحيح الأنسجة11, إلى CMs أحادية الثقافة المصنفة بين microgrooves البادئة12,13. ولذلك، فإن من المناسب استخدام هذه التقنية التي تتماشى مع التطبيق المقصود والمسألة البيولوجية المقابلة له، هناك مزايا وعيوب متأصلة لكل من هذه الأساليب.
القدرة على تعزيز نضوج CMs المستمدة من الخلايا الجذعية أمر ضروري للهندسة المختبرية الناجحة للأنسجة عضلة القلب الشبيهة بالبالغين وترجمة النتائج اللاحقة إلى التفسيرات السريرية. وتحقيقا لهذه الغاية، تم استكشاف أساليب لنضوج CMs على نطاق واسع، سواء في 2D و3D 14،15،16. على سبيل المثال، التحفيز الكهربائي المدمج في EHTs، المحاذاة القسرية لل CMs مع تضاريس السطح، إشارات الإشارات، عوامل النمو من الثقافة المشتركة، و / أو ظروف الهيدروجيل ثلاثي الأبعاد، وما إلى ذلك، كلها تؤدي إلى تغيير لصالح نضوج CM في واحد على الأقل من ما يلي: مورفولوجيا الخلايا، مناولة الكالسيوم، بنية الساركوميري، التعبير الجيني، أو القوة الانقباشية.
ومن بين هذه النماذج، تحتفظ النهج التي تستخدم منصات microfluidic بمزايا معينة في الطبيعة، مثل التحكم في التدرجات، ومحدودية إدخال الخلايا، والحد الأدنى من الكواشف اللازمة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تتولد العديد من التكرارات البيولوجية في وقت واحد باستخدام منصات microfluidic، مما يخدم لتشريح أفضل الآلية البيولوجية من الفائدة وزيادة حجم العينة التجريبية لصالح السلطة الإحصائية17،18،19. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام التصوير الضوئي في عملية تصنيع الجهاز microfluidic يمكن من إنشاء ميزات دقيقة (مثل الطبوغرافيات) على مستوى الدقيقة والنانو ، والتي تعمل كعظة تلسكوبية لتعزيز البنية الخلوية المحيطة وهندسة الأنسجة على المستوىالكلي18و20و21و22 للتطبيقات المختلفة في تجديد الأنسجة ونمذجة الأمراض.
أظهرنا سابقا تطوير نموذج جديد للأنسجة القلبية ثلاثية الأبعاد على الشريحة يتضمن تضاريس سطحية ، في شكل أعمدة بيضاوية فطرية ، لمحاذاة خلايا القلب المشاركة في زراعة الهيدروجيل في نسيج متداخل وغير متماثل20. بعد 14 يوما من الثقافة ، تكون الأنسجة التي تشكلت داخل الجهاز microfluidic أكثر نضجا في النمط الظاهري ، وملف التعبير الجيني ، وخصائص التعامل مع الكالسيوم ، والاستجابة الصيدلانية بالمقارنة مع الضوابط أحادية الطبقة و3D isotropic23. يحدد البروتوكول الموضح هنا طريقة إنشاء هذا النسق ثلاثي الأبعاد المشترك، والمنسق (أي anisotropic) أنسجة القلب البشرية داخل الجهاز microfluidic باستخدام CMs المشتقة من hiPSC. على وجه التحديد، ونحن نشرح أساليب لتمييز وتنقية hiPSCs نحو CMs، ومكملات hCFs مع CMs لإنتاج السكان الثقافة المشتركة المنشأة، وإدراج السكان الخلية مغلفة داخل هيدروجيل الكولاجين في الأجهزة microfluidic، والتحليل اللاحق للأنسجة 3D شيدت من خلال المقايسات الإنقباعي والمناعة. الأنسجة الدقيقة المهندسة ثلاثية الأبعاد الناتجة مناسبة لمختلف التطبيقات ، بما في ذلك دراسات البيولوجيا الأساسية ، والنمذجة القلبية الوعائية ، والاختبارات الصيدلانية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.65 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm Biopsy punch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95039-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm Biopsy punch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95039-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18x18mm coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-308</td>
			<td>The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>101176-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well flat botttom tissue-culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 minus insulin</td>
			<td>LifeTech</td>
			<td>A1895602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 plus insulin</td>
			<td>LifeTech</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10188-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47747-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21600069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>can also be made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45001-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM3</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10172-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFR-Matrigel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47743-718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10152-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC-Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>BD354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0536-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTCS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440299-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (150x15mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (60x15mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3532-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MT10040CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 minus glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45001-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafers (100mm)</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>1196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium lactate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4263-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 2075</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y111074 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 Developer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>NC9901158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Elastomer</td>
			<td>Essex Brownell</td>
			<td>DC-184-1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVG620 Aligner</td>
			<td>EVG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner PDC-32G</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver Z1 microscope</td>
			<td>Nikon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

developing 3d organized human cardiac tissue within a microfluidic platform

السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم لا يزال كما أمراض القلب والأوعية الدموية (CVD). ومع ذلك ، فإن نمذجة التعقيد الفسيولوجي والبيولوجي لعضلات القلب ، عضلة القلب ، من الصعب تحقيقها في المختبر. أساسا، تكمن العقبات في الحاجة إلى خلايا القلب البشرية (CMs) التي هي إما الكبار أو تظهر الأنماط الظاهرية مثل الكبار ويمكن تكرار بنجاح تعقيد عضلة القلب الخلوية والهندسة المعمارية المعقدة 3D. لسوء الحظ ، بسبب المخاوف الأخلاقية وعدم وجود أنسجة القلب البشرية الأولية المشتقة من المريض ، إلى جانب الحد الأدنى من انتشار CMs ، كان الحصول على CMs البشرية القابلة للحياة خطوة محدودة لهندسة أنسجة القلب. وتحقيقا لهذه الغاية، تحولت معظم البحوث نحو التمايز القلبي للخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة من قبل الإنسان (hiPSCs) كمصدر رئيسي ل CMs البشرية، مما أدى إلى دمج hiPSC-CMs على نطاق واسع ضمن المقايسات المختبرية لنمذجة الأنسجة القلبية.
هنا في هذا العمل، ونحن نثبت بروتوكول لتطوير 3D ناضجة الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة القلبية البشرية داخل جهاز microfluidic. نحن نشرح ونوضح بصريا إنتاج نموذج أنسجة القلب ثلاثية الأبعاد في المختبر على رقاقة من CMs المشتقة من hiPSC. نحن نصف في المقام الأول بروتوكول تنقية لتحديد ل CMs، والثقافة المشتركة للخلايا مع نسبة محددة عن طريق خلط CMs مع CFs الإنسان (hCFs)، وتعليق هذه الثقافة المشتركة داخل الهيدروجيل القائم على الكولاجين. كما أننا نثبت حقن الهيدروجيل المحمل بالخلايا داخل جهازنا الدقيق الدقيق المحدد جيدا ، المضمن مع الأعمدة البيضاوية المتداخلة التي تعمل كتدبير سطحي للحث على درجة عالية من محاذاة الخلايا المحيطة ومصفوفة الهيدروجيل ، تحاكي بنية عضلة القلب الأصلية. ونحن نتصور أن النموذج المقترح 3D الأنسجة القلبية غير المثيلة على رقاقة مناسبة لدراسات البيولوجيا الأساسية, نمذجة الأمراض, ومن خلال استخدامه كأداة فحص, اختبار الأدوية.

للحصول على مجموعة عالية من أجهزة CMs من hiPSCs ، يتم استخدام نسخة معدلة تتضمن مزيجا من بروتوكول تمايز ليان33 وخطوات تنقية Tohyama34 (راجع الشكل 1A للجدول الزمني التجريبي). وhiPSCs تحتاج إلى أن تكون مستعمرة مثل، ~ 85٪ التقاء، وانتشرت بالتساوي في جميع أنحاء الثقافة...

Watch this Scientific Journal Video about Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform at JoVE.com

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

الهدف من هذا البروتوكول هو شرح وإظهار تطوير نموذج ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) للفلوريد الدقيق لأنسجة القلب البشرية المنحازة للغاية ، والمكونة من خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية التي تشارك في استزراعها مع الخلايا الليفية القلبية (CFs) داخل هيدروجيل حيوي قائم على الكولاجين ، للتطبيقات في هندسة أنسجة القلب ، وفحص الأدوية ، ونمذجة الأمراض.

تطوير أنسجة القلب البشرية المنظمة ثلاثية الأبعاد ضمن منصة ميكروفلويديك

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

ولا تزال أمراض القلب والأوعية الدموية السبب الأول للوفاة في جميع أنحاء العالم. تعتمد النماذج التقليدية في المختبر على ثقافة الطبقة الأحادية. ومع ذلك ، فإن القلب ، وتحديدا عضلة القلب أو عضلة القلب ، معقد في تركيبته ثلاثية الأبعاد والخليوية.لذلك ، من المهم تحسين تعقيد تكوين الأنسجة داخل النماذج المختبرية لمحاكاة كل من المكونات الخلوية وبنية عضلة القلب بشكل أفضل. هنا في هذا العمل، ونحن نثبت بروتوكول لتطوير الخلايا الجذعية الناضجة 3D المستمدة من الأنسجة القلبية البشرية داخل جهاز microfluidic رواية. يتضمن هذا الجهاز قناة نسيج رئيسي ثلاثي الأبعاد مع أعمدة صغيرة بيضاوية فطرية تحفز درجات عالية من محاذاة خلايا القلب المغلفة الهيدروجيل المحيطة.ويحيط القناة الرئيسية من قبل قنوات وسائل الإعلام مع منافذ الحقن التي تمكن من نشر المواد الغذائية في جميع أنحاء الأنسجة. نظرا للرعاية المطلوبة في التعامل مع الأجهزة الدقيقة ، فإن التمثيل البصري لهذا البروتوكول مفيد لإنشاء أنسجة القلب ثلاثية الأبعاد بشكل صحيح داخل جهاز ميكروفلويدي مع أعمدة صغيرة مضمنة لتعزيز محاذاة الأنسجة. ينفصم الورم الليفي القلب البشري، أولا إخراج قارورة من الحاضنة.وضع داخل خزانة السلامة الحيوية والبدء في يستنشق وسائل الإعلام المستهلكة من القارورة. ثم تأخذ ثلاثة MLs من برنامج تلفزيوني 1X لغسل القارورة. إغلاق الغطاء ودوامة القارورة بحيث يتم المغلفة بشكل صحيح أسفل في برنامج تلفزيوني.يستنشق برنامج تلفزيوني. تأخذ ثلاثة MLs من 37 درجة تريبسين وإضافة إلى قارورة. ثم إمالة القارورة ودوامة بحيث يتم المغلفة تماما الجزء السفلي.ثم ضع في الحاضنة لمدة أربع إلى ست دقائق. تحييد التريبسين مع تشويه الأعضاء التناسلية الأنثوية3 عن طريق اتخاذ ثلاثة MLs وإضافة ذلك إلى قارورة. Pipette الحل صعودا وهبوطا لطرد أي الخلايا التي تبقى على الجزء الخلفي من القارورة.جمع تعليق الخلية في أنبوب فالكون 15 مل. خذ 10 ميكرولترات من تعليق الخلية والاستغناء عنها في مقياس الدم لحساب الخلايا بالمجهر. الطرد المركزي تعليق الخلية في 250 G لمدة أربع دقائق.بعد الطرد المركزي، يستنشق supernatant الحرص على عدم تعكير صفو بيليه الخلية. Resuspend بيليه الخلية مع تشويه الأعضاء التناسلية الأنثوية الطازجة3 لجعل المطلوب 75 مليون خلية لكل تعليق ML. إعادة تشغيل الخلايا، ثم تعيين أنبوب أسفل مع غطاء المجهزة فضفاضة.لتفكيك خلايا القلب، أخرج الطبق من الحاضنة ونسخ وسائل الإعلام. خذ ستة MLs من برنامج تلفزيوني وغسل الآبار بحيث يكون هناك ML واحد من برنامج تلفزيوني في كل بئر. يستنشق برنامج تلفزيوني ، مع الحرص على عدم تعكير صفو الخلايا المرفقة لوحة.إضافة ستة MLs من trypLE اكسبرس الدافئة بحيث يكون هناك ML واحد في كل بئر من لوحة بئر ستة. احتضان الخلايا مع trypLE لمدة 10 دقائق. بعد 10 دقائق، قم بتحييد المحاولة باستخدام ستة مل من RPMI بالإضافة إلى B27 بالإضافة إلى الأنسولين بحيث تضيف مل واحد من RMPI إلى كل بئر.استخدام واحد ماصة ML لجمع الحل والانفجار ضد ظهور الآبار لضمان رفع جميع الخلايا قبالة. جمع تعليق الخلية في أنبوب فالكون 15 مل. طرد مركزي الأنبوب في 300 G لمدة ثلاث دقائق.بعد الطرد المركزي، يستنشق وسائل الإعلام و trypLE. هذه الخطوة مهمة لغسل خلايا القلب الحساسة. هذه الخطوة تضمن أن يذهب كل trypLE في تشكيل الأنسجة القلبية 3D.Resuspend بيليه الخلية في خمسة MLs من RPMI بالإضافة إلى B27 بالإضافة إلى الأنسولين. استخدام ماصة ML واحد ماصة الحل صعودا وهبوطا لضمان تعليق الخلية متجانسة. خذ 10 ميكرولترات من تعليق الخلية للعد مع مقياس الدم.طرد الخلايا في 300 G لمدة ثلاث دقائق. يستنشق وسائل الإعلام بعد الطرد المركزي للمرة الثانية. إضافة الكمية المناسبة من RPMI بالإضافة إلى B27 بالإضافة إلى الأنسولين لتحقيق 75 مليون خلية لكل تعليق ML، ثم إعادة الإنفاق.لإعداد محلول الكولاجين للتغليف، لديك كل الكواشف على صندوق الثلج في غطاء محرك السيارة. ثم تأخذ 75 ميكرولتر من الكولاجين الأسهم. الكولاجين لزج جدا ، امتصاص ببطء مع ماصة ، ثم الاستغناء في أنبوب الطرد الدقيق على الجليد.خذ 13.85 ميكرولتر من RPMI وأضف إلى الكولاجين في أنبوب فالكون. ثم تأخذ 10 ميكرولتر من الفينول الأحمر وإضافة إلى الخليط على الجليد وإعادة الإنفاق. وأخيرا، تأخذ 1.15 ميكرولتر من NaOH طبيعي واحد وإضافة إلى تعليق لتحييد.ثم تأخذ 200 ميكرولتر ماصة تلميح وإعادة تعليق. الخطوة التالية هي تغليف الخلايا داخل ميتروجيل الكولاجين. ثم تأخذ aliquot من ثمانية ميكرولتر من CMs وإضافة إلى أنبوب فالكون الطازجة على الجليد.ثم تأخذ اثنين من ميكرولتر من CS وإضافة إلى خليط الخلية. Resuspend تعليق الخلية والاستيلاء على 5.6 ميكرولتر من تعليق الخلية ووضعها في أنبوب فالكون الطازجة. ثم الاستيلاء على الكولاجين التي قمت بإعدادها للتو، واتخاذ أربعة ميكرولتر من الكولاجين، ثم تأخذ 2.4 ميكرولتر من المتروجيل.ماصة الخليط صعودا وهبوطا لضمان توزيع متجانسة للتعليق هيدروجيل الخلية. بمجرد إعداد حقن الجل ، يمكنك إدخاله في الأجهزة. خذ نصيحة جديدة وا resuspend.خذ طبق بيتري من الأجهزة، وأدخل الطرف في منفذ الحقن، وحقن ببطء وثبات. سترى قناة الجهاز تملأ مع تعليق هيدروجيل الخلية. بمجرد تعبئة المنفذ الآخر، توقف عن الحقن وأزل الطرف.بعد الحقن، قم بقلب الأجهزة بالملاقط ووضعها داخل طبق بيتري الأكبر مع الماء في الحاضنة لمدة تسع دقائق. بعد تسع دقائق، أخرج الأجهزة من الحاضنة وانقلب منتصبا، ثم ضعها مرة أخرى في الحاضنة لمدة تسع دقائق أخرى لإكمال بلمرة الهيدروجيل. الآن حان الوقت لإضافة وسائل الإعلام.لذا، خذ RMPI زائد B27 وأدخل الطرف في منفذ الوسائط وابدأ بالدفع ببطء. ثم قم بذلك على منفذ الوسائط المقابل. قد تجد أن وسائل الإعلام لا يتم حقن، حتى تتمكن من وضع قطرة من وسائل الإعلام على رأس الميناء ومن ثم اتخاذ ماصة واستخدام الضغط السلبي لسحب وسائل الإعلام من خلال من الجانب الآخر.لذلك سترى وسائل الإعلام يبدأ في الحصول على سحبها من خلال القناة. وبمجرد إضافة وسائل الإعلام إلى جميع القنوات الإعلامية، سيتم إعادة الأجهزة إلى الحاضنة عند 37 درجة. يظهر الجهاز microfluidic في الزاوية اليسرى العليا.تظهر هذه الصورة في الأيام الأولى والسابعة وال14 للثقافة. بعد 14 يوما من الثقافة ، يجب أن تتكثف الخلايا في هياكل عالية المحاذاة تتشكل حول الأعمدة الدقيقة. تظهر آثار اليوم 14 هنا في C من الانكماش التلقائي ، وكذلك الصور المناعية للأنسجة الملطخة بال أكتين وعلامة القلب.ما ينبغي أن ينظر إليه هو ألياف أكتين الانحياز للغاية التي تشكل بعد 14 يوما في الثقافة، فضلا عن ساركوميرس ناضجة المخططة موازية وتقاطعات الفجوة المترجمة. خلال هذا الإجراء، من المهم جدا الحفاظ على جميع المواد في درجات حرارة منخفضة على الجليد أثناء حقن هيدروجيل الخلية لمنع البلمرة المبكرة. يجب التعامل مع الأجهزة الدقيقة مع الرعاية ، سواء أثناء التصنيع ، والحقن ، وزراعة الأنسجة الممتدة.يجب أن تكون حقن الخلايا عملية ثابتة لضمان ملء القناة بأكملها أثناء تنفيذها بسرعة لمنع البلمرة المبكرة أو جفاف الهيدروجيل قبل إضافة الوسائط.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

عالية الإنتاجية مولد بروتين تعبير باستخدام منصة ميكروفلويديك

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

هندسة الأنسجة ل3D الإنسان<em&gt; في المختبر</em&gt; نظام ورم اختبار

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

الضغط خلية باعتبارها قوية، ميكروفلويديك بين الخلايا توصيل منصة

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

رقاقة متعدد الجهاز - A منصة ميكروفلويديك لفترة طويلة Coculture متعدد الأنسجة

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

ومنصة ميكروفلويديك لعزل وحيدة الخلية عالية الإنتاجية والثقافة

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

منصة ميكروفلويديك مع تعدد كشف الالكترونية لتتبع المكانية من الجسيمات

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

إنشاء الأنسجة القلبية عرض التكامل الميكانيكي للكروية باستخدام بيوبرينتينغ 3D

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

تجميع وتتبع التنمية المجتمعية الميكروبية داخل منصة ميكرويل صفيف

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

ديسيلولاريزيشن مماثلة لانسجة القلب الجنين والكبار Explants كمثل 3D منهاجي في المختبر الدراسات

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

منصة موائع جزيئية "التصوير الطولي" في ايليجانس كاينورهابديتيس

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...