Name: developing 3d organized human cardiac tissue within a microfluidic platform
Uploaded: 2021-06-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform at JoVE.com

我们要感谢NSF职业奖#1653193，亚利桑那州生物医学研究委员会（ABRC）新调查员奖（ADHS18-198872），以及弗林基金会奖为该项目提供资金来源。HIPSC线SCVI20来自由NIH R24 HL117756资助的斯坦福心血管研究所博士吴约瑟。HIPSC线，IMR90-4，是从威塞尔研究所55，56获得。

在生物安全柜内执行所有细胞处理和试剂准备。确保与细胞接触的所有表面、材料和设备均无菌（即喷洒70%乙醇）。细胞应在加湿的 37 °C、5% CO2 孵化器中培养。所有hiPSC文化和分化均在6井板中执行。
1. 微流体设备创建（大致持续时间：1 周）
<ol><li>
光刻 注：使用CAD文件设计的面膜（作为 补充文件1提供），包含微流体通道的设计。将设?...

形成具有增强细胞相互作用和仿生3D结构的体外人体心脏组织模型，对于基本的心血管研究和相应的临床应用至关重要。此概述的协议解释了微流体设备中 3D 人类不运动性心脏组织的发展，使用干细胞衍生 CMs 与连接 CFs 共同培养，这些 CMs 封装在胶原蛋白水凝胶中，以模拟原生心肌的复杂细胞组成和结构。这个特定的协议是高度可重复的，因为设备的特殊结构已经优化和?...

组织工程方法已广泛探索，近年来，伴随着体内临床发现再生医学和疾病建模1，2。由于在采购人类原发性心脏组织和产生生理相关体外代孕方面存在固有困难，因此特别强调体外心脏组织建模，这限制了对心血管疾病（CVDs）1、3复杂机制的基本理解。传统模型通常涉及 2D 单层文化测定。然而，在3D环境中培养心脏细胞，模仿心肌原生景观和复杂的细胞相互作用的重要性，已被广泛定性为4，5。此外，迄今为止生产的大多数模型都包括了与干细胞不同的CMs的单一培养。然而，心脏是由多个细胞类型6在复杂的3D架构7，保证迫切需要改善组织成分的复杂性在3D体外模型，以更好地模仿细胞成分的原生心肌。
迄今为止，已经探索了许多不同的方法来生产模因8的生物仿生3D模型。这些方法的范围从允许实时计算生成力的实验设置，从在薄膜（被认为是肌肉薄膜 （MTFs）9上播种的单培养 CMs，到悬浮在自立的钳子（被视为工程心脏组织 （EHTs）10中的 3D 水凝胶基质中的共同培养心脏细胞。其他方法则侧重于实施微模技术，以模仿心肌厌食症，从11号组织贴片中悬浮在突出微柱中的3D水凝胶中的单培养CMs，到在缩化微沟12、13中播种的单培养CMs。因此，利用与预期应用和相应的生物学问题相一致的技术，每种方法都有内在的优点和缺点。
增强干细胞衍生 CMs 成熟度的能力对于成功进行成人心肌组织体外工程以及将后续发现转化为临床解释至关重要。为此，在2D和3D14、15、16方面，对成熟CMs的方法进行了广泛的探索。例如，EHT中所包含的电刺激、CM与地表地形、信号提示、共同培养的生长因子和/或3D水凝胶条件等的强制对齐，都导致至少在以下一种情况下有利于CM成熟的变化：细胞形态、钙处理、肉瘤结构、基因表达或收缩力。
在这些模型中，利用微流体平台的方法在性质上保留了某些优势，例如控制梯度、有限的细胞输入和最少必要的试剂。此外，许多生物复制品可以立即产生使用微流体平台，有助于更好地解剖生物利益机制，增加实验样本量，有利于统计力17，18，19。此外，在微流体设备制造过程中使用光刻技术，在微观和纳米层面创建精确的特征（如地形图），作为中微线索，增强周围的细胞结构和宏观级组织结构18、20、21、22，用于组织再生和疾病建模的不同应用。
我们以前曾证明开发一种新的3D心脏组织片上模型，结合表面地形，以天生椭圆形微柱的形式，将水凝胶封装共同培养的心脏细胞对齐成一个相互连接的，不亚素组织20。经过14天的培养，与单层和3D同位素控制23相比，微流体装置内形成的组织在表型、基因表达特征、钙处理特性和药物反应等方面更加成熟。此处描述的协议概述了使用hiPSC衍生的 CMs 在微流体设备中创建这种 3D 共培养、对齐（即不运动）人类心脏组织的方法。 具体来说，我们解释区分和净化高浓缩丙基对CMs的方法，补充HCF与CMs产生一个既定的共同培养群体，将细胞群封装在胶原水凝胶中到微流体设备中，以及随后通过收缩和免疫荧光检测分析3D构造组织。由此产生的3D工程微组织适用于各种应用，包括基础生物学研究、CVD建模和药物测试。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.65 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm Biopsy punch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95039-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm Biopsy punch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95039-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18x18mm coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-308</td>
			<td>The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>101176-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well flat botttom tissue-culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 minus insulin</td>
			<td>LifeTech</td>
			<td>A1895602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 plus insulin</td>
			<td>LifeTech</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10188-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47747-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21600069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>can also be made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45001-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM3</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10172-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFR-Matrigel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47743-718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10152-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC-Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>BD354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0536-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTCS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440299-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (150x15mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (60x15mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3532-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MT10040CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 minus glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45001-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafers (100mm)</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>1196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium lactate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4263-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 2075</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y111074 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 Developer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>NC9901158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Elastomer</td>
			<td>Essex Brownell</td>
			<td>DC-184-1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVG620 Aligner</td>
			<td>EVG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner PDC-32G</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver Z1 microscope</td>
			<td>Nikon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

developing 3d organized human cardiac tissue within a microfluidic platform

全世界的主要死因是心血管疾病（CVD）。然而，建模心脏肌肉的生理和生物学复杂性，心肌，是出了名的难以 完成体外。 主要，障碍在于需要人类心肌细胞（CMs），这些细胞要么是成人的，要么是显示成人样的表型，并且能够成功地复制心肌的细胞复杂性和复杂的3D结构。不幸的是，由于伦理问题和缺乏可用的原发性患者衍生人类心脏组织，加上CS的微小增殖，可行的人类CMs的采购一直是心脏组织工程的一个限制步骤。为此，大多数研究已经过渡到人类诱导多能干细胞（hiPSC）作为人类CMs的主要来源的心脏分化，导致 在体外 测定中广泛纳入HIPSC-CMs，用于心脏组织建模。
在这项工作中，我们演示了在微流体设备中开发3D成熟干细胞衍生人类心脏组织的方案。我们特别解释和视觉上演示了从hiPSC衍生的CMs中产生的3D 体外 不运动心脏组织芯片模型的生产。我们主要描述为 CMs 选择的纯化协议，通过将 CMs 与人类 CF （hCF） 混合来共同培养具有定义比率的细胞，以及暂停胶原蛋白水凝胶中的这种共同培养。我们进一步演示了在我们定义明确的微流体装置中注入细胞载水凝胶，内嵌交错椭圆微柱，作为表面地形，诱导周围细胞和水凝胶基质的高度对齐，模仿原生心肌的结构。我们设想，拟议的3D非同向心脏组织芯片模型适用于基础生物学研究，疾病建模，并通过它作为筛选工具，药物测试。

为了从高PSC获得高度纯化的CMs群，使用了涉及连分化协议33和富山净化步骤34组合的修改版本（参照图1A表示实验时间线）。hiPSC 需要像殖民地一样，约 85% 的汇合，并在通过 3-4 天后，在 CM 分化（图 1B）的开始，均匀地传播到整个文化中。具体来说，在第 0 天，hiPSC 殖民地应具有多能转录因子的高表达性，包括 SOX2 ?...

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Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

本协议的目的是解释和演示高度对齐的人类心脏组织的三维（3D）微流体模型的发展，该模型由干细胞衍生心肌细胞组成，与心脏成纤维细胞（CFs）在生物仿真、胶原蛋白基水凝胶中共同培养，用于心脏组织工程、药物筛查和疾病建模。

在微流体平台内开发 3D 组织人类心脏组织

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

心血管疾病仍然是全世界头号死因。传统的体外模型依赖于单层文化。然而，心脏，特别是心肌或心肌，其3D异位和细胞组成是复杂的。因此，改善体外模型内组织成分的复杂性，以更好地模拟细胞成分和心肌结构至关重要。在这项工作中，我们演示了在新型微流体装置中开发3D成熟干细胞衍生人类心脏组织的方案。该设备结合了一个3D主组织通道与与生俱来的椭圆微柱，诱导周围水凝胶封装心脏细胞的高度对齐。主通道的两侧是带注射端口的介质通道，使营养物质在整个组织中扩散。由于处理微流体设备需要小心，此协议的视觉表示有助于在微流体设备内正确建立 3D 心脏组织，并嵌入微柱以增强组织对齐。要分离人类心脏成纤维细胞，首先从孵化器取出烧瓶。放入生物安全柜内，开始从烧瓶中吸气。然后采取三个ML的PBS 1X洗烧瓶。关闭盖子并旋转烧瓶，以便底部正确涂上 PBS。吸气 PBS。服用三个 37 度试穿素的 Mls， 并添加到烧瓶中。然后倾斜烧瓶和漩涡，使底部完全涂层。然后放入孵化器四到六分钟。通过服用三个 Mls 并将它添加到烧瓶中， 用 Fgm3 中和肌素。将溶液上下移出，以去掉留在烧瓶背面的任何细胞。将细胞悬架收集到 15 ML 猎鹰管中。取10微升的细胞悬浮，并在血细胞仪中分配，用显微镜数细胞。将细胞悬浮在250 G下悬架4分钟。离心后，吸气超自然者小心不要干扰细胞颗粒。用新鲜的 FGM3 补充细胞颗粒，使每个 ML 悬架产生所需的 7500 万个细胞。重新安装细胞，然后用松散安装的盖子将管子放下。要分离心肌细胞，请将盘子从孵化器中取出，并吸气介质。取六个 PBS 的 MLs 并清洗油井，以便每口井中有一个 PBS 的 ML。吸气 PBS，小心不要打扰连接到板上的细胞。添加六个 MLs 的加热尝试快车， 以便有一个 Ml 在六个井板的每口井。用试管孵化细胞10分钟。10 分钟后，用 6 毫升的 RPMI 加 B27 加胰岛素中和 trypLE，以便您在每个井中添加一个 ML 的 RMPI。使用一个ML移液器收集溶液，并将其爆炸到井的背面，以确保所有细胞被解除。将细胞悬架收集到 15 ML 猎鹰管中。在300G下将管子离心三分钟。离心后，吸气媒体和试用。这一步对于洗涤敏感的心肌细胞很重要。此步骤确保所有尝试在 3D 心脏组织形成中消失。将细胞颗粒在 RPMI 加 B27 加胰岛素的五个 MLs 中恢复。使用单ML移液器上下移液，以确保细胞悬架均匀。使用血细胞计计数时，取 10 微升的细胞悬架。将细胞在300G下离心三分钟。第二次离心后向媒体发号限供。添加适量的RPMI加B27加胰岛素，实现每个ML悬浮7500万个细胞，然后恢复。要准备用于封装的胶原蛋白溶液，请将所有试剂放在引擎盖中的冰盒上。然后服用75微升的库存胶原蛋白。胶原蛋白非常粘稠，所以慢慢吸收移液器，然后在冰上的微中微管中分配。服用 13.85 微升 RPMI，加入猎鹰管中的胶原蛋白。然后服用10微升酚红色，加入冰上的混合物，然后再补充。最后，取1.15微升的一个正常的NaOH，并添加到悬架中和。然后采取200微升移液器尖端，并恢复悬架。下一步是将胶原蛋白都市体中的细胞封装起来。然后取8微升的CMs，并添加到冰上一个新的猎鹰管。然后取两微升CS，并添加到该细胞混合物中。恢复细胞悬架，抓住细胞悬架的5.6微升，放入一个新的猎鹰管。然后抓住你刚刚准备的胶原蛋白，取四微升胶原蛋白，然后取2.4微升的麦德龙。将混合物上下起伏，以确保细胞水凝胶悬架的均匀分布。准备好凝胶注射后，您可以插入设备。采取一个新的提示，并重新发送。拿培养皿的设备，插入注射端口的尖端，缓慢而稳定地注射。当设备通道充满细胞水凝胶悬架时，您将看到。填充其他端口后，停止注注并移除尖端。注射后，用钳子翻转设备，放在更大的培养皿内，在孵化器中注水九分钟。九分钟后，将设备从孵化器中取出并直立翻转，然后放回孵化器中 9 分钟，完成水凝胶聚合。现在是时候添加媒体了。因此，将 RMPI 加 B27 放入媒体端口，然后开始缓慢推动。然后在相反的媒体端口上这样做。您可能会发现媒体没有注射，因此您可以在端口顶部放置一滴介质，然后取出移液器，使用负压力将介质从另一侧拉过。因此，你会看到媒体开始通过渠道拉。一旦媒体被添加到所有媒体频道，设备将被放回37度的孵化器中。微流体设备显示在左上角。第一天、第七天和第十四天展示了这张图片。经过14天的培养后，细胞应凝结成围绕微柱形成的高度对齐结构。第14天的痕迹显示在自发收缩的C中，以及作用性染色和心脏标记染色组织的免疫荧光图像。应该看到的是高度对齐的在文化中形成的14天后形成的纤维，以及平行条纹成熟的肉瘤和局部的缝隙交汇点。在此过程中，在细胞水凝胶注射期间，必须保持所有材料在冰上保持低温，以防止过早聚合。在制造、注射和扩展组织培养过程中，应小心处理微流体设备。细胞注射应该是一个稳定的过程，以确保整个通道已经充满，同时快速执行，以防止过早聚合或水凝胶干燥之前，媒体添加。

Research

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Bioengineering

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科研

生物工程

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一个人的3D组织工程<em&gt;在体外</em&gt;肿瘤测试系统

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

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