Name: developing 3d organized human cardiac tissue within a microfluidic platform
Uploaded: 2021-06-15T15:00:00
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Wir danken dem NSF CAREER Award #1653193, dem Arizona Biomedical Research Commission (ABRC) New Investigator Award (ADHS18-198872) und dem Flinn Foundation Award für die Bereitstellung von Finanzierungsquellen für dieses Projekt. Die hiPSC-Linie, SCVI20, wurde von Joseph C. Wu, MD, PhD am Stanford Cardiovascular Institute, finanziert durch NIH R24 HL117756, erworben. Die hiPSC-Linie, IMR90-4, wurde vom WiCell Research Institute55,56bezogen.

Führen Sie die gesamte Zellhandhabung und Reagenzienvorbereitung in einer Biosicherheitswerkbank durch. Stellen Sie sicher, dass alle Oberflächen, Materialien und Geräte, die mit Zellen in Kontakt kommen, steril sind (d. h. mit 70% Ethanol besprühen). Die Zellen sollten in einem befeuchteten 37 °C, 5% CO2 Inkubator kultiviert werden. Die gesamte hiPSC-Kultur und -Differenzierung erfolgt in 6-Well-Platten.
1. Erstellung mikrofluidischer Geräte (ungefähre Dauer: 1 Woche)
<ol>...

Die Bildung eines in vitro humanen Herzgewebemodells mit verbesserten Zell-Zell-Interaktionen und biomimetischer 3D-Struktur ist für die kardiovaskuläre Grundlagenforschung und entsprechende klinische Anwendungen unerlässlich1. Dieses skizzierte Protokoll erklärt die Entwicklung von 3D-humanem anisotropem Herzgewebe in einem mikrofluidischen Gerät unter Verwendung der Co-Kultur von Stammzell-abgeleiteten CMs mit verbindenden CFs, die in einem Kollagenhydrogel verkapselt sind, um die ...

Tissue Engineering-Ansätze wurden in den letzten Jahren umfassend erforscht, um klinische In-vivo-Befunde in der regenerativen Medizin und Krankheitsmodellierung zu begleiten1,2. Aufgrund der inhärenten Schwierigkeiten bei der Beschaffung von humanem primärem Herzgewebe und der Herstellung physiologisch relevanter In-vitro-Surrogate wurde insbesondere der In-vitro-Kardgewebemodellierung besondere Bedeutung beigemischt, was das grundlegende Verständnis der komplexen Mechanismen von Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVDs) einschränkt1,3. Traditionelle Modelle haben oft 2D-Monolayer-Kultur-Assays beinhaltet. Die Bedeutung der Kultivierung von Herzzellen in einer 3D-Umgebung, um sowohl die native Landschaft des Myokards als auch komplexe zelluläre Interaktionen nachzuahmen, wurde jedoch ausführlich charakterisiert4,5. Darüber hinaus enthielten die meisten bisher hergestellten Modelle eine Monokultur von CMs, die von Stammzellen differenziert wurden. Das Herz besteht jedoch aus mehreren Zelltypen6 innerhalb einer komplexen 3D-Architektur7,was die kritische Notwendigkeit rechtfertigt, die Komplexität der Gewebezusammensetzung in 3D-In-vitro-Modellen zu verbessern, um zelluläre Bestandteile des nativen Myokards besser nachzuahmen. 
Bis heute wurden viele verschiedene Ansätze erforscht, um biomimetische 3D-Modelle des Myokards8zu erstellen. Diese Ansätze reichen von experimentellen Setups, die die Echtzeitberechnung der erzeugten Kraft ermöglichen, von Monokultur-CMs, die auf dünnen Filmen gesät sind (als muskulöse dünne Schichten (MTFs))9,bis hin zu Co-Kultur-Herzzellen in 3D-Hydrogelmatrizen, die zwischen freistehenden Auslegern schweben (als künstliche Herzgewebe (EHTs))10. Andere Ansätze haben sich auf die Implementierung von Mikroformtechniken konzentriert, um die myokardiale Anisotropie nachzuahmen, von Monokultur-CMs in einem 3D-Hydrogel, das zwischen hervorstehenden Mikropfosten in einem Gewebepflaster11suspendiert ist, bis hin zu Monokultur-CMs, die zwischen eingerückten Mikrorillen gesät sind12,13. Es gibt inhärente Vor- und Nachteile für jede dieser Methoden, daher ist es wichtig, die Technik zu verwenden, die mit der beabsichtigten Anwendung und der entsprechenden biologischen Frage übereinstimmt.
Die Fähigkeit, die Reifung von aus Stammzellen gewonnenen CMs zu verbessern, ist für das erfolgreiche In-vitro-Engineering von adultem Myokardgewebe und die Translation der nachfolgenden Befunde in klinische Interpretationen unerlässlich. Zu diesem Zweck wurden Methoden zur Reifung von CMs umfassend erforscht, sowohl in 2D als auch in 3D14,15,16. Zum Beispiel führen elektrische Stimulation, die in EHTs integriert ist, erzwungene Ausrichtung von CMs mit der Oberflächentopographie, Signalsignale, Wachstumsfaktoren aus Co-Kultur und / oder 3D-Hydrogelbedingungen usw. zu einer Veränderung zugunsten der CM-Reifung in mindestens einer der folgenden: Zellmorphologie, Kalziumhandhabung, Sarkomerikstruktur, Genexpression oder kontraktile Kraft.
Von diesen Modellen behalten die Ansätze, die mikrofluidische Plattformen verwenden, bestimmte Vorteile in der Natur, wie die Kontrolle von Gradienten, begrenzten Zelleintrag und minimal notwendige Reagenzien. Darüber hinaus können viele biologische Replikate auf einmal mit mikrofluidischen Plattformen erzeugt werden, die dazu dienen, den biologischen Mechanismus von Interesse besser zu sezieren und die experimentelle Stichprobengröße zugunsten der statistischen Leistung zu erhöhen17,18,19. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung der Photolithographie im mikrofluidischen Geräteherstellungsprozess die Erstellung präziser Merkmale (z. B. Topographien) auf Mikro- und Nanoebene, die als mesoskopische Hinweise zur Verbesserung der umgebenden Zellstruktur und der Gewebearchitektur auf Makroebene dienen18,20 ,21,22 für verschiedene Anwendungen in der Geweberegeneration und Krankheitsmodellierung.
Wir haben bereits die Entwicklung eines neuartigen 3D-Herzgewebe-On-Chip-Modells demonstriert, das Oberflächentopographie in Form von angeborenen elliptischen Mikropfosten enthält, um hydrogelverkapselte co-kultivierte Herzzellen in ein miteinander verbundenes, anisotropes Gewebe auszurichten20. Nach 14 Tagen Kultur sind die im mikrofluidischen Gerät gebildeten Gewebe im Vergleich zu Monoschicht- und 3D-isotropen Kontrollen reifer in ihrem Phänotyp, Genexpressionsprofil, Kalziumhandhabungseigenschaften und pharmazeutischenReaktionen 23. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Methode zur Herstellung dieses 3D-kokultivierten, ausgerichteten (d.h. anisotropen) menschlichen Herzgewebes innerhalb des mikrofluidischen Geräts unter Verwendung von hiPSC-abgeleiteten CMs. Insbesondere erläutern wir die Methoden zur Differenzierung und Reinigung von hiPSCs in Richtung CMs, die Supplementierung von hCFs mit CMs zur Erzeugung einer etablierten Co-Kulturpopulation, das Einfügen der im Kollagenhydrogel verkapselten Zellpopulation in die mikrofluidischen Geräte und die anschließende Analyse der 3D-konstruierten Gewebe durch kontraktile und immunfluoreszierende Assays. Die resultierenden 3D-Mikrogewebe eignen sich für verschiedene Anwendungen, einschließlich grundlegender biologischer Studien, CVD-Modellierung und pharmazeutischer Tests.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.65 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm Biopsy punch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95039-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm Biopsy punch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95039-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18x18mm coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-308</td>
			<td>The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>101176-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well flat botttom tissue-culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 minus insulin</td>
			<td>LifeTech</td>
			<td>A1895602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 plus insulin</td>
			<td>LifeTech</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10188-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47747-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21600069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>can also be made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45001-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM3</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10172-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFR-Matrigel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47743-718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10152-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC-Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>BD354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0536-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTCS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440299-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (150x15mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (60x15mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3532-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MT10040CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 minus glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45001-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafers (100mm)</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>1196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium lactate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4263-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 2075</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y111074 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 Developer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>NC9901158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Elastomer</td>
			<td>Essex Brownell</td>
			<td>DC-184-1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVG620 Aligner</td>
			<td>EVG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner PDC-32G</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver Z1 microscope</td>
			<td>Nikon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

developing 3d organized human cardiac tissue within a microfluidic platform

Die weltweit häufigste Todesursache bleibt herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD). Die Modellierung der physiologischen und biologischen Komplexität des Herzmuskels, des Myokards, ist jedoch notorisch schwierig in vitro zu erreichen. Hindernisse liegen hauptsächlich in der Notwendigkeit menschlicher Kardiomyozyten (CMs), die entweder erwachsen sind oder erwachsene Phänotypen aufweisen und die zelluläre Komplexität und komplizierte 3D-Architektur des Myokards erfolgreich replizieren können. Leider war aufgrund ethischer Bedenken und des Mangels an primärem, vom Patienten abgeleitetem menschlichem Herzgewebe in Kombination mit der minimalen Proliferation von CMs die Beschaffung lebensfähiger menschlicher CMs ein limitierender Schritt für das Herzgewebe-Engineering. Zu diesem Zweck hat sich die meiste Forschung in Richtung kardialer Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) als primäre Quelle menschlicher CMs entwickelt, was zu einer breiten Einbeziehung von hiPSC-CMs in In-vitro-Assays für die Kardiengewebemodellierung führte.
Hier in dieser Arbeit demonstrieren wir ein Protokoll zur Entwicklung eines 3D-reifen Stammzell-abgeleiteten menschlichen Herzgewebes in einem mikrofluidischen Gerät. Wir erklären und demonstrieren insbesondere die Herstellung eines 3D-in-vitro-anisotropen Herzgewebe-on-a-Chip-Modells aus hiPSC-abgeleiteten CMs. Wir beschreiben in erster Linie ein Reinigungsprotokoll zur Auswahl für CMs, die Co-Kultur von Zellen mit einem definierten Verhältnis durch Mischen von CMs mit menschlichen CFs (hCFs) und die Suspension dieser Co-Kultur innerhalb des kollagenbasierten Hydrogels. Wir demonstrieren außerdem die Injektion des zellbeladenen Hydrogels in unser gut definiertes mikrofluidisches Gerät, eingebettet in versetzte elliptische Mikropfosten, die als Oberflächentopographie dienen, um ein hohes Maß an Ausrichtung der umgebenden Zellen und der Hydrogelmatrix zu induzieren und die Architektur des nativen Myokards nachzuahmen. Wir stellen uns vor, dass das vorgeschlagene anisotrope 3D-Kardiengewebe-on-Chip-Modell für grundlegende biologische Studien, Krankheitsmodellierung und durch seine Verwendung als Screening-Tool für pharmazeutische Tests geeignet ist.

Um eine hochgereinigte Population von CMs aus hiPSCs zu erhalten, wird eine modifizierte Version verwendet, die eine Kombination aus dem Lian-Differenzierungsprotokoll33 und den Tohyama-Reinigungsschritten34 beinhaltet (siehe Abbildung 1A für den experimentellen Zeitplan). Die hiPSCs müssen kolonieartig sein, ~85% konfluent und gleichmäßig in der Kultur gut 3-4 Tage nach der Passage zu Beginn der CM-Differenzierung verteilt sein (<strong cl...

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Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Entwicklung eines dreidimensionalen (3D) mikrofluidischen Modells von hoch ausgerichtetem menschlichem Herzgewebe zu erklären und zu demonstrieren, das aus Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten besteht, die mit Herzfibroblasten (CFs) in einem biomimetischen, kollagenbasierten Hydrogel in Kokulturiert sind, für Anwendungen in der Kardgewebeentwicklung, im Arzneimittelscreening und in der Krankheitsmodellierung.

Entwicklung von 3D-organisiertem menschlichem Herzgewebe innerhalb einer mikrofluidischen Plattform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind nach wie vor die häufigste Todesursache weltweit. Traditionelle In-vitro-Modelle basieren auf Monolayer-Kultur. Das Herz, insbesondere der Herzmuskel oder das Myokard, ist jedoch in seiner 3D-Anisotropie und zellulären Zusammensetzung komplex.Daher ist es wichtig, die Komplexität der Gewebezusammensetzung in In-vitro-Modellen zu verbessern, um sowohl die zellulären Bestandteile als auch die Struktur des Myokards besser nachzuahmen. Hier in dieser Arbeit demonstrieren wir ein Protokoll für die Entwicklung eines 3D-reifen Stammzell-abgeleiteten menschlichen Herzgewebes in einem neuartigen mikrofluidischen Gerät. Dieses Gerät enthält einen 3D-Hauptgewebekanal mit angeborenen elliptischen Mikropfosten, die einen hohen Grad der Ausrichtung der umgebenden Hydrogel-verkapselten Herzzellen induzieren.Der Hauptkanal wird von Medienkanälen mit Injektionsöffnungen flankiert, die eine Nährstoffdiffusion im gesamten Gewebe ermöglichen. Aufgrund der Sorgfalt, die bei der Handhabung der mikrofluidischen Geräte erforderlich ist, ist die visuelle Darstellung dieses Protokolls hilfreich, um 3D-Herzgewebe in einem mikrofluidischen Gerät mit eingebetteten Mikropfosten für eine verbesserte Gewebeausrichtung richtig zu etablieren. Um den menschlichen Herzfibroblasten zu dissoziieren, nehmen Sie zuerst den Kolben aus dem Inkubator heraus.In die Biosicherheitswerkbank legen und beginnen, die verbrauchten Medien aus dem Kolben abzusaugen. Nehmen Sie dann drei MLs PBS 1X, um den Kolben zu waschen. Schließen Sie die Kappe und schwenken Sie den Kolben, so dass der Boden ordnungsgemäß mit PBS beschichtet ist.Saugen Sie das PBS an. Nehmen Sie drei MLs 37-Grad-Trypsin und fügen Sie es in den Kolben. Dann kippen Sie den Kolben und schwenken Sie, so dass der Boden vollständig beschichtet ist.Dann für vier bis sechs Minuten in den Inkubator geben. Neutralisieren Sie das Trypsin mit FGM3, indem Sie drei MLs nehmen und in den Kolben geben. Pipetieren Sie die Lösung auf und ab, um alle Zellen zu verdrängen, die auf der Rückseite des Kolbens verbleiben.Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15 ML Falcon-Röhrchen. Nehmen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension und geben Sie sie in einem Hämozytometer ab, um die Zellen mit einem Mikroskop zu zählen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 250 G für vier Minuten.Nach der Zentrifugation saugen Sie den Überstand an, wobei Sie darauf achten, das Zellpellet nicht zu stören. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit frischem FGM3, um die gewünschten 75 Millionen Zellen pro ML-Suspension herzustellen. Setzen Sie die Zellen wieder auf und legen Sie das Röhrchen dann mit einer locker angebrachten Kappe ab.Um die Kardiomyozyten zu dissoziieren, nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und saugen Sie das Medium an. Nehmen Sie sechs ML PBS und waschen Sie die Brunnen, so dass sich in jedem Brunnen ein ML PBS befindet. Saugen Sie das PBS an und achten Sie darauf, die an der Platte befestigten Zellen nicht zu stören.Fügen Sie sechs ML erwärmtes trypLE Express hinzu, so dass sich in jeder Vertiefung einer Platte mit sechs Wellen ein ML befindet. Inkubieren Sie die Zellen mit dem trypLE für 10 Minuten. Neutralisieren Sie nach 10 Minuten das TrypLE mit sechs ML RPMI plus B27 plus Insulin, so dass Sie jedem Brunnen einen ML RMPI hinzufügen.Verwenden Sie eine ML-Pipette, um die Lösung zu sammeln und sie gegen die Rückseite der Vertiefungen zu sprengen, um sicherzustellen, dass alle Zellen abgehoben werden. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15 ML Falcon-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 G für drei Minuten.Nach der Zentrifugation das Medium und das TrypLE absaugen. Dieser Schritt ist wichtig, um die empfindlichen Kardiomyozyten zu waschen. Dieser Schritt stellt sicher, dass alle TrypLE bei der Bildung von 3D-Herzgewebe verschwunden sind.Resuspend das Zellpellet in fünf MLs RPMI plus B27 plus Insulin. Verwenden Sie eine ML-Pipette, um die Lösung nach oben und unten zu pipetten, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten. Nehmen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension zum Zählen mit dem Hämozytometer.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 G für drei Minuten. Saugen Sie die Medien nach der Zentrifugation zum zweiten Mal an. Fügen Sie die entsprechende Menge rpmI plus B27 plus Insulin hinzu, um 75 Millionen Zellen pro ML-Suspension zu erreichen, und resuspendieren Sie dann.Um die Kollagenlösung für die Verkapselung vorzubereiten, haben Sie alle Reagenzien auf einem Eiskasten in der Haube. Nehmen Sie dann 75 Mikroliter des Kollagens. Das Kollagen ist sehr viskos, also langsam mit der Pipette aufnehmen, dann in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis dosieren.Nehmen Sie 13,85 Mikroliter RPMI und fügen Sie das Kollagen in der Falcon-Röhre hinzu. Dann nehmen Sie 10 Mikroliter Phenolrot und fügen Sie der Mischung auf Eis hinzu und resuspend. Nehmen Sie schließlich 1,15 Mikroliter eines normalen NaOH und fügen Sie der Suspension hinzu, um sie zu neutralisieren.Nehmen Sie dann eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze und brauen Sie die Suspension wieder auf. Der nächste Schritt ist die Verkapselung der Zellen innerhalb des Kollagen-Metrogels. Dann nehmen Sie ein Aliquot von acht Mikrolitern CMs und fügen Sie es zu einem frischen Falcon-Rohr auf Eis hinzu.Nehmen Sie dann zwei Mikroliter CS und fügen Sie sie zu dieser Zellmischung hinzu. Resuspendieren Sie die Zellsuspension und greifen Sie 5,6 Mikroliter der Zellsuspension und geben Sie sie in ein frisches Falcon-Röhrchen. Dann schnappen Sie sich das Kollagen, das Sie gerade zubereitet haben, nehmen Sie vier Mikroliter des Kollagens und nehmen Sie dann 2,4 Mikroliter Metrogel.Pipetten Sie die Mischung auf und ab, um eine homogene Verteilung der Zellhydrogelsuspension zu gewährleisten. Sobald die Gelinjektion vorbereitet ist, können Sie sie in Geräte einführen. Nehmen Sie einen neuen Tipp und resuspendieren.Nehmen Sie die Petrischale der Geräte, führen Sie die Spitze in den Injektionsanschluss ein und injizieren Sie langsam und stetig. Sie werden sehen, wie sich der Gerätekanal mit der Zellhydrogelsuspension füllt. Sobald der andere Anschluss gefüllt ist, stoppen Sie die Injektion und entfernen Sie die Spitze.Nach der Injektion die Geräte mit einer Pinzette umdrehen und neun Minuten lang mit Wasser in die größere Petrischale legen. Nach neun Minuten nehmen Sie die Geräte aus dem Inkubator und drehen sie aufrecht und legen Sie sie dann für weitere neun Minuten in den Inkubator, um die Hydrogelpolymerisation abzuschließen. Jetzt ist es an der Zeit, die Medien hinzuzufügen.Nehmen Sie also RMPI plus B27 und stecken Sie die Spitze in den Medienanschluss und beginnen Sie langsam zu drücken. Tun Sie dies dann auf dem gegenüberliegenden Medienanschluss. Möglicherweise stellen Sie fest, dass das Medium nicht injiziert wird, sodass Sie einen Tropfen Medien auf den Anschluss legen und dann die Pipette nehmen und Unterdruck verwenden können, um das Medium von der anderen Seite durchzuziehen.Sie werden also sehen, wie die Medien beginnen, durch den Kanal gezogen zu werden. Sobald alle Medienkanäle mit Medien versehen wurden, werden die Geräte bei 37 Grad wieder in den Inkubator gestellt. Das mikrofluidische Gerät ist in der oberen linken Ecke dargestellt.Die Tage eins, sieben und 14 der Kultur werden dieses Bild gezeigt. Nach 14 Tagen Kultur sollten die Zellen zu stark ausgerichteten Strukturen kondensieren, die sich um die Mikropfosten bilden. Spuren des 14. Tages sind hier in C der spontanen Kontraktion sowie immunfluoreszierende Bilder von Aktin-gefärbtem und herzmarkergefärbtem Gewebe gezeigt.Zu sehen sind hoch ausgerichtete Aktinfasern, die sich nach 14 Tagen in Kultur bilden, sowie parallele streifenreife Sarkomere und lokalisierte Gap Junctions. Während dieses Verfahrens ist es wichtig, alle Materialien während der Zellhydrogelinjektion bei niedrigen Temperaturen auf Eis zu halten, um eine vorzeitige Polymerisation zu verhindern. Die mikrofluidischen Geräte sollten sowohl bei der Herstellung, Injektion als auch bei der erweiterten Gewebekultur mit Vorsicht behandelt werden.Die Zellinjektionen sollten ein stetiger Prozess sein, um sicherzustellen, dass sich der gesamte Kanal gefüllt hat, während sie schnell durchgeführt werden, um eine vorzeitige Polymerisation oder ein Austrocknen des Hydrogels vor der Medienzugabe zu verhindern.

Research

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Bioengineering

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