Name: developing 3d organized human cardiac tissue within a microfluidic platform
Uploaded: 2021-06-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform at JoVE.com

ברצוננו להודות #1653193 פרס NSF CAREER, פרס ועדת המחקר הביו-רפואי של אריזונה (ABRC) (ADHS18-198872), ופרס קרן פלין על מתן מקורות מימון לפרויקט זה. קו HIPSC, SCVI20, התקבל מג'וזף סי וו, MD, דוקטורט במכון הלב וכלי הדם של סטנפורד במימון NIH R24 HL117756. קו hiPSC, IMR90-4, התקבל ממכון המחקר WiCell55,56.

בצע את כל הטיפול בתאים והכנת ריאגנט בתוך קבינט Biosafety. ודא שכל המשטחים, החומרים והציוד שבאים במגע עם תאים הם סטריליים (כלומר, לרסס למטה עם 70% אתנול). תאים צריכים להיות בתרבית בחממה לחה 37 °C (60 °F), 5% CO2 חממה. כל תרבות ה-hiPSC והבידול מבוצעים בצלחות של 6 בארות.
1. יצירת מכשיר מיקרופלו...

היווצרות מודל רקמת לב אנושי במבחנה עם אינטראקציות משופרות בין תאי התא ומבנה 3D ביומימטי הוא הכרחי למחקר לב וכלי דם בסיסי ויישומים קליניים מתאימים1. פרוטוקול מתואר זה מסביר את הפיתוח של רקמת לב אניזוטרופית אנושית תלת מימדית בתוך מכשיר מיקרופלואידי, תוך שימוש בתרבות משותפת...

גישות הנדסת רקמות נחקרו בהרחבה, בשנים האחרונות, כדי ללוות ממצאים קליניים vivo ברפואה רגנרטיבית ומידול מחלות1,2. דגש משמעותי הושם במיוחד על מידול רקמת לב במבחנה בשל הקשיים הטבועים במיקור רקמת לב ראשונית אנושית והפקת תחליפים במבחנה רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, המגבילים את ההבנה הבסיסית של המנגנונים המורכבים של מחלות לב וכלי דם (CVDs)1,3. מודלים מסורתיים מעורבים לעתים קרובות 2D monolayer תרבות מבחנים. עם זאת, החשיבות של culturing תאי לב בתוך סביבה 3D לחקות הן את הנוף הטבעי של שריר הלב אינטראקציות הסלולר מורכב התאפיין בהרחבה4,5. בנוסף, רוב הדגמים שיוצרו עד כה כללו מונו-תרבות של CMs המובדלים מתאי גזע. עם זאת, הלב מורכב מסוגי תאים מרובים6 בתוך ארכיטקטורה 3D מורכב7, המצדיק את הצורך הקריטי לשפר את המורכבות של הרכב הרקמה בתוך מודלים 3D במבחנה כדי לחקות טוב יותר מרכיבים הסלולר של שריר הלב המקורי.
עד כה, גישות רבות ושונות נחקרו כדי לייצר מודלים ביומימטיים 3D של שריר הלב8. גישות אלה נעות בין הגדרות ניסיוניות המאפשרות חישוב בזמן אמת של כוח שנוצר, מן CMs מונו-תרבות זרע על סרטים דקים (נחשב סרטים דקים שרירים (MTFs))9, כדי co-culture תאי לב מטריצות הידרוג'ל 3D מושעה בין cantilevers העומדים חופשיים (נחשב רקמות לב מהונדסות (EHTs))10. גישות אחרות התמקדו ביישום טכניקות micromolding לחקות anisotropy שריר הלב, מן CMs מונו-תרבות הידרוג'ל 3D מושעה בין microposts בולטים במדבקת רקמה11, כדי מונו-תרבות CMs זרעים בין microgroovesמוסטים 12,13. ישנם יתרונות וחסרונות מובנים לכל אחת משיטות אלה, ולכן, זה רלוונטי לנצל את הטכניקה התואמת את היישום המיועד ואת השאלה הביולוגית המתאימה.
היכולת לשפר את ההבשלה של תאי גזע נגזר CMs חיוני להנדסת במבחנה מוצלחת של רקמת שריר הלב דמוי מבוגר ותרגום של ממצאים הבאים פרשנויות קליניות. למטרה זו, שיטות כדי בוגרת CMs נחקרו נרחב, הן 2D ו 3D14,15,16. לדוגמה, גירוי חשמלי המשולב ב- EHTs, יישור כפוי של CMs עם טופוגרפיה של פני השטח, רמזי איתות, גורמי גדילה מתרבות משותפת ו/או תנאי הידרוג'ל תלת-ממדיים וכו ', כולם מובילים לשינוי לטובת התבגרות CM לפחות באחת מהאפשרויות הבאות: מורפולוגיה של תאים, טיפול בסידן, מבנה סרקומרי, ביטוי גנים או כוח התכווצותי.
מבין מודלים אלה, הגישות המשתמשות בפלטפורמות מיקרופלואידיות שומרות על יתרונות מסוימים בטבע, כגון שליטה במעברי צבע, קלט תאים מוגבל וריאנטים מינימליים נחוצים. יתר על כן, משכפלים ביולוגיים רבים יכולים להיווצר בבת אחת באמצעות פלטפורמות microfluidic, המשרתים לנתח טוב יותר את המנגנון הביולוגי של עניין ולהגדיל את גודל המדגם הניסיוני לטובת כוח סטטיסטי17,18,19. בנוסף, שימוש בפוטוליטוגרפיה בתהליך ייצור המכשירים המיקרופלואידיים מאפשר יצירת תכונות מדויקות (למשל טופוגרפיות) ברמת המיקרו והננו, המשמשות כרמזים מזוסקופיים לשיפור המבנה התאי שמסביב וארכיטקטורת רקמות ברמת המאקרו18,20,21,22 עבור יישומים שונים בהתחדשות רקמות ומידול מחלות.
הדגמנו בעבר את הפיתוח של מודל חדש של רקמת לב תלת-ממדית על שבב המשלב טופוגרפיה של פני השטח, בצורה של מיקרופוסטים אליפטיים מולדים, כדי ליישר תאי לב מתורבתים הידרוג'ל-אנקפסולציה לתוך רקמה מחוברת, אניזוטרופית20. לאחר 14 ימים של תרבות, הרקמות שנוצרו בתוך המכשיר המיקרופלואידי בוגרות יותר בפנוטיפ שלהם, פרופיל ביטוי גנים, מאפייני טיפול בסידן ותגובה פרמצבטית בהשוואה לבקרות איזוטרופיות חד שכבתיות ותלת-ממדיות23. הפרוטוקול המתואר בזאת מתאר את השיטה ליצירת רקמת לב אנושית מתורבתת תלת-ממדית זו , המיושרת (כלומר, אניזוטרופית) בתוך המכשיר המיקרופלואידי באמצעות CMs שמקורם ב- hiPSC. באופן ספציפי, אנו מסבירים את השיטות כדי להבדיל ולטהר hiPSCs כלפי CMs, תוספת של hCFs עם CMs כדי לייצר אוכלוסיית תרבות משותפת הוקמה, החדרת אוכלוסיית התא עטוף בתוך הידרוג'ל קולגן לתוך התקנים microfluidic, וניתוח הבא של רקמות 3D בנוי באמצעות מבחנים התכווצות immunofluorescent. מיקרו-רקמות מהונדסות תלת-ממד וכתוצאה מכך מתאימות ליישומים שונים, כולל מחקרי ביולוגיה בסיסיים, מידול CVD ובדיקות פרמצבטיות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.65 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm Biopsy punch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95039-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm Biopsy punch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95039-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18x18mm coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-308</td>
			<td>The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>101176-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well flat botttom tissue-culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 minus insulin</td>
			<td>LifeTech</td>
			<td>A1895602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 plus insulin</td>
			<td>LifeTech</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10188-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47747-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21600069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>can also be made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45001-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM3</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10172-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFR-Matrigel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47743-718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10152-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC-Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>BD354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0536-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTCS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440299-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (150x15mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (60x15mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3532-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MT10040CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 minus glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45001-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafers (100mm)</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>1196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium lactate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4263-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 2075</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y111074 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 Developer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>NC9901158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Elastomer</td>
			<td>Essex Brownell</td>
			<td>DC-184-1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVG620 Aligner</td>
			<td>EVG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner PDC-32G</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver Z1 microscope</td>
			<td>Nikon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

developing 3d organized human cardiac tissue within a microfluidic platform

הגורם המוביל למוות ברחבי העולם נמשך כמו מחלות לב וכלי דם (CVD). עם זאת, דוגמנות המורכבות הפיזיולוגית והביולוגית של שריר הלב, שריר הלב, הוא ידוע לשמצה קשה להשיג במבחנה. בעיקר, מכשולים טמונים הצורך קרדיומיוציטים אנושיים (CMs) כי הם מבוגרים או להפגין פנוטיפים דמויי מבוגרים והוא יכול לשכפל בהצלחה את המורכבות התאית של שריר הלב וארכיטקטורה 3D מורכב. למרבה הצער, בשל חששות אתיים וחוסר זמין ראשוני נגזר רקמת לב אנושית, בשילוב עם התפשטות מינימלית של CMs, המקור של CMs אנושי קיימא כבר צעד מגביל עבור הנדסת רקמת לב. לשם כך, רוב המחקרים עברו לבידול לבבי של תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם (hiPSCs) כמקור העיקרי של CMs אנושיים, וכתוצאה מכך התאגדות רחבה של hiPSC-CMs בתוך מבחני חוץ למידול רקמת לב.
כאן בעבודה זו, אנו מדגימים פרוטוקול לפיתוח רקמת לב אנושית בוגרת תלת מימדית שמקורה בתאי גזע בתוך מכשיר מיקרופלואידי. אנו מסבירים באופן ספציפי ומדגימים ויזואלית את הייצור של מודל רקמת לב אניסוטרופית במבחנה במבחנה על שבב מ- CMs שמקורם ב- hiPSC. אנו מתארים בעיקר פרוטוקול טיהור לבחירה עבור CMs, תרבות משותפת של תאים עם יחס מוגדר באמצעות ערבוב CMs עם CFs אנושיים (hCFs), והשעיה של תרבות משותפת זו בתוך הידרוג'ל מבוסס קולגן. אנו מדגימים עוד יותר את ההזרקה של הידרוג'ל עמוס התאים בתוך המכשיר המיקרופלואידי המוגדר היטב שלנו, משובץ במיקרופוסטים אליפטיים מתנדנדים המשמשים כטופוגרפיה של פני השטח כדי לגרום ליישור גבוה של התאים שמסביב ומטריצת ההידרוגל, מחקה את הארכיטקטורה של שריר הלב המקומי. אנו צופים כי מודל הרקמה-על-שבב של הלב הדו-ממדי המוצע מתאים למחקרי ביולוגיה בסיסיים, דוגמנות מחלות, ובאמצעות השימוש בו ככלי סינון, בדיקות פרמצבטיות.

כדי להשיג אוכלוסייה מטוהרת מאוד של CMs מ- hiPSCs, נעשה שימוש בגירסה מותאמת הכוללת שילוב של פרוטוקול הבידול של ליאן33 ושלבי הטיהור של טוהיאמה34 (עיין באיור 1A עבור ציר זמן ניסיוני). HiPSCs צריך להיות כמו מושבה, ~ 85% confluent, להתפשט באופן שווה ברחבי התרבות היטב 3-4 ימ...

Watch this Scientific Journal Video about Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform at JoVE.com

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

מטרת פרוטוקול זה היא להסביר ולהדגים את התפתחותו של מודל מיקרופלואידי תלת מימדי (3D) של רקמת לב אנושית מיושרת מאוד, המורכבת מקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע במשותף עם פיברובלסטים לבביים (CFs) בתוך הידרוג'ל ביומימטי, מבוסס קולגן, ליישומים בהנדסת רקמת לב, הקרנת תרופות ומידול מחלות.

פיתוח רקמת לב אנושית מאורגנת תלת מימדית בתוך פלטפורמה מיקרופלואידית

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

מחלות לב וכלי דם נשאר הגורם מספר אחת למוות ברחבי העולם. מודלים מסורתיים במבחנה מסתמכים על תרבות המונולאייר. עם זאת, הלב, במיוחד שריר הלב או שריר הלב, הוא מורכב anisotropy 3D שלה הרכב הסלולר.לכן, זה קריטי כדי לשפר את המורכבות של הרכב הרקמה בתוך מודלים במבחנה כדי לחקות טוב יותר הן את המרכיבים הסלולר ואת המבנה של שריר הלב. כאן בעבודה זו, אנו מדגימים פרוטוקול לפיתוח רקמת לב אנושית בוגרת תלת מימדית שמקורה בתאי גזע בתוך מכשיר מיקרופלואידי חדשני. מכשיר זה משלב ערוץ רקמה ראשי תלת-ממדי עם מיקרופוסטים אליפטיים מולדים הגורמים למידות גבוהות של יישור של תאי הלב הסובבים את ההידרוגל.הערוץ הראשי מוקף בערוצי מדיה עם יציאות הזרקה המאפשרות דיפוזיה תזונתית בכל הרקמה. בשל הטיפול הנדרש בטיפול בהתקנים microfluidic, ייצוג חזותי של פרוטוקול זה מועיל כראוי להקים רקמת לב 3D בתוך מכשיר microfluidic עם microposts מוטבע עבור יישור רקמות משופרת. כדי לנתק את פיברובלסט הלב האנושי, ראשית להוציא את הבקבוק מן האינקובטור.שים בתוך ארון biosafety ולהתחיל לשאוף את התקשורת בילה מן הבקבוק. ואז לקחת שלושה MLs של PBS 1X לשטוף את הבקבוק. סגור את המכסה וסובב את הבקבוק כך שהחלק התחתון מצופה כראוי ב- PBS.לשאוף את PBS. קח שלושה MLs של 37 מעלות טריפסין ולהוסיף לבקבוק. ואז להטות את הבקבוק ואת מערבולת כך התחתון מצופה לחלוטין.ואז לשים באינקובטור במשך ארבע עד שש דקות. לנטרל את טריפסין עם FGM3 על ידי לקיחת שלושה MLs והוספת כי לבקבוק. פיפט הפתרון למעלה ולמטה כדי לעקור את כל התאים שנותרו בחלק האחורי של הבקבוק.לאסוף את השעיית התא בצינור פלקון 15 ML. קח 10 מיקרוליטרים של השעיית התא ולוותר על המוציטופ לספור את התאים עם מיקרוסקופ. צנטריפוגה השעיית התא ב250 G במשך ארבע דקות.לאחר צנטריפוגה, לשאוף את supernatant נזהר לא להפריע גלולה התא. Resuspend גלולת התא עם FGM3 טרי כדי להפוך הרצוי 75 מיליון תאים לכל השעיה ML. לשים מחדש את התאים, ולאחר מכן להגדיר את הצינור למטה עם כובע מצויד באופן רופף.כדי לנתק את הקרדיומיוציטים, הוציאו את הצלחת מהחממה ושאבו את התקשורת. קח שישה MLs של PBS ולשטוף את הבארות, כך שיש ML אחד של PBS בכל באר. לשאוף את PBS, נזהר לא להפריע לתאים המחוברים לצלחת.הוסף שישה MLs של טריפל אקספרס מחומם, כך שיש ML אחד בכל באר של צלחת שש היטב. דגירה התאים עם טריפל במשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, לנטרל את trypLE עם שישה MLs של RPMI בתוספת B27 בתוספת אינסולין, כך שאתה מוסיף ML אחד של RMPI לכל באר.השתמש אחד פיפטה ML כדי לאסוף את הפתרון ולפוצץ אותו על הגב של בארות כדי להבטיח את כל התאים הם הרים. לאסוף את השעיית התא בצינור פלקון 15 ML. צנטריפוגה הצינור ב300 G במשך שלוש דקות.לאחר צנטריפוגה, לשאוף את התקשורת ואת trypLE. שלב זה חשוב לשטוף את הקרדיומיוציטים הרגישים. שלב זה מבטיח כי כל טריפל נעלם היווצרות רקמת לב 3D.Resuspend גלולת התא בחמישה MLs של RPMI בתוספת B27 בתוספת אינסולין. השתמש פיפטה ML אחד פיפטה הפתרון למעלה ולמטה כדי להבטיח השעיית תא הומוגני. קח 10 מיקרוליטרים של השעיית התא לספירה עם המוציטרומטר.צנטריפוגה התאים ב300 G במשך שלוש דקות. לשאוף את התקשורת לאחר צנטריפוגה בפעם השנייה. הוסף את הכמות המתאימה של RPMI בתוספת B27 בתוספת אינסולין כדי להשיג 75 מיליון תאים לכל השעיה ML, ולאחר מכן resuspend.כדי להכין את פתרון הקולגן לאנקפסולציה, יש את כל ריאגנטים על קופסת קרח במכסה המנוע. ואז לקחת 75 מיקרוליטרים של קולגן המניות. הקולגן הוא צמיג מאוד, כל כך לאט ספיגה עם פיפטה, ואז לוותר על צינור microcentrifuge על קרח.קח 13.85 מיקרוליטרים של RPMI ולהוסיף קולגן בצינור פלקון. ואז לקחת 10 microliters של פנול אדום ולהוסיף לתערובת על קרח resuspend. לבסוף, לקחת 1.15 microliters של NaOH נורמלי אחד ולהוסיף את ההשעיה כדי לנטרל.ואז לקחת טיפ פיפטה 200 microliter ו resuspend ההשעיה. השלב הבא הוא אנקפסולציה של התאים בתוך metrogel קולגן. ואז לקחת aliquot של שמונה מיקרוליטרים של CMs ולהוסיף צינור פלקון טרי על קרח.ואז לקחת שני microliters של CS ולהוסיף לתערובת תאים. תחדש את השעיית התא ותתפוס 5.6 מיקרוליטרים של השעיית התא ותכניס צינור פלקון טרי. ואז לתפוס את הקולגן שהכנת זה עתה, לקחת ארבעה מיקרוליטרים של הקולגן, ואז לקחת 2.4 מיקרוליטרים של metrogel.פיפטה התערובת למעלה ולמטה כדי להבטיח הפצה הומוגנית של המתלה הידרוג'ל התא. לאחר הזרקת הג'ל מוכן, אתה יכול להכניס למכשירים. קח טיפ חדש ותתחדש.קח את צלחת פטרי של התקנים, להכניס את הקצה ביציאת ההזרקה, לאט ובהתמדה להזריק. אתה תראה כמו ערוץ המכשיר מתמלא עם המתלה הידרוג'ל התא. לאחר מילוי היציאה השנייה, להפסיק את ההזרקה ולהסיר את הקצה.לאחר ההזרקה, הופכים את המכשירים בפינצטה ומניחים בתוך צלחת הפטרי הגדולה יותר עם מים באינקובטור במשך תשע דקות. לאחר תשע דקות, מוציאים את המכשירים מהחממה והופכים זקוף, ואז מחזירים לאינקובטור לתשע דקות נוספות להשלמת פולמור הידרוג'ל. עכשיו הגיע הזמן להוסיף את המדיה.לכן, קח RMPI פלוס B27 והכנס את הקצה ליציאת המדיה והתחל לדחוף באיטיות. לאחר מכן עשה זאת ביציאת המדיה הנגדית. ייתכן שתגלה שהמדיה אינה מזריקה, כך שתוכל לשים טיפת מדיה על גבי היציאה ולאחר מכן לקחת את פיפטה ולהשתמש בלחץ שלילי כדי למשוך את המדיה דרך מהצד השני.אז אתה תראה כשהתקשורת תתחיל להימשך דרך הערוץ. לאחר הוספת המדיה לכל ערוצי התקשורת, המכשירים יוחזרו לחממה ב-37 מעלות. המכשיר המיקרופלואידי מוצג בפינה השמאלית העליונה.ימים 1, 7 ו-14 של תרבות מוצגים בתמונה זו. לאחר 14 ימים של תרבות, התאים צריכים להתעבות לתוך מבנים מיושר מאוד היוצרים סביב microposts. עקבות של היום 14 מוצגים כאן ב C של התכווצות ספונטנית, כמו גם תמונות immunofluorescent של רקמות מוכתמות actin סמן לב מוכתם.מה שצריך לראות הוא סיבי actin מיושר מאוד היוצרים לאחר 14 ימים בתרבות, כמו גם סרקומרים בוגרים מפוספסים מקבילים וצמתים פער מקומי. במהלך הליך זה, זה קריטי כדי לשמור על כל החומרים בטמפרטורות נמוכות על קרח במהלך הזרקת הידרוג'ל התא כדי למנוע פולמור מוקדם. המכשירים המיקרופלואידיים צריכים להיות מטופלים בזהירות, הן במהלך ייצור, הזרקה, ותרבות רקמות מורחבת.זריקות התא צריך להיות תהליך קבוע כדי להבטיח את הערוץ כולו מילא תוך ביצוע מהיר כדי למנוע פולמור מוקדם או הידרוג'ל מתייבש לפני תוספת מדיה.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

הנדסת רקמות של 3D אדם<em&gt; במבחנה</emמערכת מבחן גידול&gt;

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

צ&#39;יפ Multi-האיבר - פלטפורמת Microfluidic לCoculture Multi-רקמה לטווח ארוך

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

פלטפורמת microfluidic עם איתור Multiplexed אלקטרוני למערכות מעקב מרחבית של חלקיקים

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

יצירת רקמת הלב מציגה שילוב מכני של Spheroids באמצעות 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

העצרת ומעקב אחר פיתוח הקהילה מיקרוביאלית בתוך פלטפורמת מערך Microell

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

דומה Decellularization של רקמת הלב העוברי ומבוגרים Explants כמו פלטפורמות דמויי תלת-ממד עבור לימודי חוץ גופית

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

פלטפורמה Microfluidic הדמיה האורך ב Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...