Name: developing 3d organized human cardiac tissue within a microfluidic platform
Uploaded: 2021-06-15T15:00:00
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हम एनएसएफ कैरियर पुरस्कार #1653193, एरिजोना बायोमेडिकल रिसर्च कमीशन (एबीआरसी) नए अन्वेषक पुरस्कार (ADHS18-198872) और इस परियोजना के लिए धन स्रोत प्रदान करने के लिए Flinn फाउंडेशन पुरस्कार का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । HIPSC लाइन, SCVI20, जोसेफ सी वू, एमडी, स्टैनफोर्ड हृदय NIH R24 HL117756 द्वारा वित्त पोषित संस्थान में पीएचडी से प्राप्त किया गया था । एचआईपीएससी लाइन, IMR90-4, WiCell अनुसंधान संस्थान55, 56से प्राप्त किया गया था।

बायोसेफ्टी कैबिनेट के भीतर सभी सेल हैंडलिंग और रिएजेंट तैयारी करें। सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं के संपर्क में आने वाली सभी सतहें, सामग्री और उपकरण बाँझ हैं (यानी, 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें)। कोशिकाओं ?...

उन्नत सेल-सेल इंटरैक्शन और बायोमिमेटिक 3 डी संरचना के साथ इन विट्रो मानव हृदय ऊतक मॉडल का गठन बुनियादी हृदय अनुसंधान और इसी नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक है1। यह उल्लिखित प्रोटोकॉल एक ?...

ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण व्यापक रूप से पता लगाया गया है, हाल के वर्षों में, पुनर्योजी दवा और रोग मॉडलिंग1,2में वीवो नैदानिक निष्कर्षों में साथ । मानव प्राथमिक हृदय ऊतक सोर्सिंग और विट्रो सरोगेट्स में शारीरिक रूप से प्रासंगिक उत्पादन में अंतर्निहित कठिनाइयों के कारण इन विट्रो कार्डियक ऊतक मॉडलिंग पर विशेष जोर दिया गया है, हृदय रोगों (सीवीडी)1,3के जटिल तंत्र की मौलिक समझ को सीमित करता है। पारंपरिक मॉडलों में अक्सर 2D मोनोलेयर संस्कृति परख शामिल होती है। हालांकि, मायोकार्डियम और जटिल सेलुलर इंटरैक्शन के देशी परिदृश्य की नकल करने के लिए 3 डी वातावरण के भीतर हृदय कोशिकाओं को बनाने के महत्व को बड़े पैमाने पर4,5की विशेषता दी गई है। इसके अतिरिक्त, इस प्रकार अब तक उत्पादित अधिकांश मॉडलों में स्टेम सेल से विभेदित सीएम की मोनो-संस्कृति शामिल है। हालांकि, दिल में एक जटिल 3 डी आर्किटेक्चर7 के भीतर कई सेल प्रकार6शामिल हैं, जो देशी मायोकार्डियम के सेलुलर घटकों की बेहतर नकल करने के लिए 3 डी इन विट्रो मॉडल के भीतर ऊतक संरचना की जटिलता में सुधार करने की महत्वपूर्ण आवश्यकता को वारंट करते हैं।
आज तक, मायोकार्डियम 8 के बायोमिमेटिक 3डी मॉडल का उत्पादन करने के लिए कई अलग-अलगदृष्टिकोणोंका पता लगाया गया है। ये दृष्टिकोण प्रायोगिक सेटअप से लेकर होते हैं जो उत्पन्न बल की वास्तविक समय गणना के लिए अनुमति देते हैं, मोनो-कल्चर सीएमएस से पतली फिल्मों (डीम्ड मस्कुलर पतली फिल्मों (एमटीएफ))9पर वरीयता प्राप्त, 3 डी हाइड्रोगेल मैट्रिस में सह-संस्कृति हृदय कोशिकाओं को मुक्त-खड़े कैंटिलीवर्स (डीम्ड इंजीनियर हार्ट ऊतक (ईएचटी)10के बीच निलंबित कर दिया गया है। अन्य दृष्टिकोणों ने एक ऊतक पैच11में माइक्रोपोस्ट फैलाने के बीच निलंबित 3 डी हाइड्रोजेल में मोनो-कल्चर सीएम से मायोकार्डियल एनिसोट्रोपी की नकल करने के लिए माइक्रोमोल्डिंग तकनीकों को लागू करने पर ध्यान केंद्रित किया है, जो इंडेंट माइक्रोग्रूव्स12,13के बीच वरीयता प्राप्त मोनो-कल्चर सीएम को है। इन तरीकों में से प्रत्येक के लिए अंतर्निहित फायदे और नुकसान हैं, इसलिए, इच्छित आवेदन और संबंधित जैविक प्रश्न के साथ संरेखित तकनीक का उपयोग करना प्रासंगिक है।
स्टेम सेल-व्युत्पन्न सीएम की परिपक्वता को बढ़ाने की क्षमता वयस्क की तरह मायोकार्डियल ऊतक की इन विट्रो इंजीनियरिंग में सफल और नैदानिक व्याख्याओं के लिए बाद के निष्कर्षों के अनुवाद के लिए आवश्यक है । इस उद्देश्य के लिए, 2डी और 3 डी14, 15, 16दोनों में परिपक्व सीएम के तरीकों का व्यापक रूप से पता लगाया गया है। उदाहरण के लिए, ईएचटी में शामिल विद्युत उत्तेजना, सतह स्थलाकृति के साथ सीएम के जबरन संरेखण, संकेत संकेत, सह-संस्कृति से विकास कारक, और/या 3 डी हाइड्रोजेल स्थितियां, आदि, सभी निम्नलिखित में से कम से एक में सीएम परिपक्वता के पक्ष में परिवर्तन का कारण बनते हैं: सेल आकृति विज्ञान, कैल्शियम हैंडलिंग, सारकोमिक संरचना, जीन अभिव्यक्ति, या अनुबंध बल ।
इन मॉडलों में से, माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों का उपयोग करने वाले दृष्टिकोण प्रकृति में कुछ लाभों को बनाए रखते हैं, जैसे कि ग्रेडिएंट का नियंत्रण, सीमित सेल इनपुट, और न्यूनतम आवश्यक अभिकर्मक। इसके अलावा, माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों का उपयोग करके कई जैविक प्रतिकृतियां उत्पन्न की जा सकती हैं, जो ब्याज के जैविक तंत्र को बेहतर ढंग से विच्छेदन करने और सांख्यिकीयशक्ति17, 18,19के पक्ष में प्रयोगात्मक नमूना आकार को बढ़ाने के लिए सेवारत हैं। इसके अतिरिक्त, माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस फैब्रिकेशन प्रक्रिया में फोटोलिथोग्राफी का उपयोग करने से सूक्ष्म और नैनो-स्तर पर सटीक विशेषताओं (जैसे, स्थलाकृति) का निर्माण होता है, जो ऊतक उत्थान और रोग मॉडलिंग में विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए आसपास की सेलुलर संरचना और मैक्रो-स्तरीय ऊतक वास्तुकला18,20,21,22 को बढ़ाने के लिए मेसोस्कोपिक संकेतों के रूप में काम करते हैं।
हमने पहले एक उपन्यास 3 डी कार्डियक ऊतक ऑन-चिप मॉडल के विकास का प्रदर्शन किया जो सतह की स्थलाकृति को जन्मजात अंडाकार माइक्रोपोस्ट के रूप में शामिल करता है, हाइड्रोगेल-एन्कैप्सेटेड सह-संस्कारी हृदय कोशिकाओं को एक परस्पर, एनिसोट्रोपिक ऊतक20में संरेखित करने के लिए। संस्कृति के 14 दिनों के बाद, माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के भीतर बनने वाले ऊतक मोनोलेयर और 3 डी आइसोट्रोपिक नियंत्रण23की तुलना में अपने फेनोटाइप, जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल, कैल्शियम हैंडलिंग विशेषताओं और दवा प्रतिक्रिया में अधिक परिपक्व होते हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल में हाइप्ससी-व्युत्पन्न सीएम का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के भीतर इस 3 डी सह-संस्कारी, गठबंधन (यानी, एनिसोट्रोपिक) मानव हृदय ऊतक बनाने की विधि को रेखांकित किया गया है। विशेष रूप से, हम सीएम के प्रति एचआईपीसी को अलग करने और शुद्ध करने के तरीकों की व्याख्या करते हैं, एक स्थापित सह-संस्कृति आबादी का उत्पादन करने के लिए सीएम के साथ एचसीएफ की पूरकता, कोलेजन हाइड्रोगेल के भीतर माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में समझाया गया सेल आबादी का सम्मिलन, और अनुबंध और इम्यूनोफ्लोर्सेंट परख के माध्यम से 3 डी निर्मित ऊतकों का बाद में विश्लेषण। परिणामी 3डी इंजीनियर माइक्रो-ऊतक विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं, जिनमें मौलिक जीव विज्ञान अध्ययन, सीवीडी मॉडलिंग और दवा परीक्षण शामिल हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.65 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm Biopsy punch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95039-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm Biopsy punch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95039-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18x18mm coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-308</td>
			<td>The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>101176-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well flat botttom tissue-culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 minus insulin</td>
			<td>LifeTech</td>
			<td>A1895602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 plus insulin</td>
			<td>LifeTech</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10188-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47747-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21600069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>can also be made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45001-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM3</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10172-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFR-Matrigel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47743-718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10152-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC-Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>BD354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0536-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTCS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440299-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (150x15mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (60x15mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3532-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MT10040CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 minus glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45001-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafers (100mm)</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>1196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium lactate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4263-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 2075</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y111074 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 Developer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>NC9901158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Elastomer</td>
			<td>Essex Brownell</td>
			<td>DC-184-1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVG620 Aligner</td>
			<td>EVG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner PDC-32G</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver Z1 microscope</td>
			<td>Nikon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

developing 3d organized human cardiac tissue within a microfluidic platform

दुनिया भर में मौत का प्रमुख कारण हृदय रोग (सीवीडी) के रूप में बनी हुई है । हालांकि, दिल की मांसपेशियों की शारीरिक और जैविक जटिलता, मायोकार्डियम मॉडलिंग, विट्रो में पूरा करने के लिए बेहद मुश्किल है। मुख्य रूप से, बाधाएं मानव कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम) की आवश्यकता में होती हैं जो या तो वयस्क हैं या वयस्क की तरह फेनोटाइप प्रदर्शित करती हैं और मायोकार्डियम की सेलुलर जटिलता और जटिल 3 डी वास्तुकला को सफलतापूर्वक दोहरा सकती हैं। दुर्भाग्य से, नैतिक चिंताओं और उपलब्ध प्राथमिक रोगी व्युत्पन्न मानव हृदय ऊतक की कमी के कारण, सीएम के ंयूनतम प्रसार के साथ संयुक्त, व्यवहार्य मानव सीएम की सोर्सिंग हृदय ऊतक इंजीनियरिंग के लिए एक सीमित कदम रहा है । इस उद्देश्य के लिए, अधिकांश शोध मानव सीपीएम के प्राथमिक स्रोत के रूप में मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) के हृदय भेदभाव की ओर संक्रमण है, जिसके परिणामस्वरूप हृदय ऊतक मॉडलिंग के लिए विट्रो परख में के भीतर hiPSC-CMs के व्यापक समावेश में जिसके परिणामस्वरूप ।
यहां इस काम में, हम एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के भीतर 3 डी परिपक्व स्टेम सेल-व्युत्पन्न मानव हृदय ऊतक विकसित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं। हम विशेष रूप से समझाते हैं और नेत्रहीन एचआईपीएससी-व्युत्पन्न सीएम से 3 डी इन विट्रो एनिसोट्रोपिक कार्डियक टिश्यू-ऑन-ए-चिप मॉडल के उत्पादन को प्रदर्शित करते हैं। हम मुख्य रूप से सीएम के लिए चयन करने के लिए एक शुद्धि प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, मानव सीएफएस (एचसीएफ) के साथ सीएम को मिलाने के माध्यम से एक परिभाषित अनुपात के साथ कोशिकाओं की सह-संस्कृति, और कोलेजन-आधारित हाइड्रोगेल के भीतर इस सह-संस्कृति का निलंबन। हम आगे हमारे अच्छी तरह से परिभाषित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के भीतर सेल से लदे हाइड्रोगेल के इंजेक्शन को प्रदर्शित करते हैं, जो कंपित अंडाकार माइक्रोपोस्ट के साथ एम्बेडेड होते हैं जो आसपास की कोशिकाओं और हाइड्रोजेल मैट्रिक्स के संरेखण की उच्च डिग्री को प्रेरित करने के लिए सतह स्थलाकृति के रूप में काम करते हैं, जो देशी मायोकार्डियम की वास्तुकला की नकल करते हैं। हम कल्पना करते हैं कि प्रस्तावित 3डी एनिसोट्रोपिक कार्डियक टिश्यू-ऑन-चिप मॉडल मौलिक जीव विज्ञान अध्ययन, रोग मॉडलिंग और स्क्रीनिंग टूल, फार्मास्यूटिकल परीक्षण के रूप में इसके उपयोग के माध्यम से उपयुक्त है।

आईआईपीएससी से सीएम की अत्यधिक शुद्ध आबादी प्राप्त करने के लिए, लियन विभेदन प्रोटोकॉल33 और तोह्यामा शुद्धिकरण चरण34 के संयोजन से जुड़े एक संशोधित संस्करण का उपयोग किया जाता है (प्रायोग?...

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Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य कार्डियक इंजीनियरिंग, ड्रग स्क्रीनिंग और रोग मॉडलिंग में अनुप्रयोगों के लिए बायोमिमेटिक, कोलेजन आधारित हाइड्रोजेल के भीतर, कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट (सीएफएफ) के साथ स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स सह-सुसंस्कृत स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स से बना अत्यधिक गठबंधन मानव हृदय ऊतक के त्रि-आयामी (3 डी) माइक्रोफ्लुइडिक मॉडल के विकास को समझाना और प्रदर्शित करना है।

माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म के भीतर 3डी संगठित मानव हृदय ऊतक का विकास

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

हृदय रोग दुनिया भर में मौत का नंबर एक कारण बना हुआ है । पारंपरिक इन विट्रो मॉडल मोनोलेयर संस्कृति पर भरोसा करते हैं। हालांकि, दिल, विशेष रूप से दिल की मांसपेशी या मायोकार्डियम, इसकी 3 डी एनिसोट्रोपी और सेलुलर संरचना में जटिल है।इसलिए, सेलुलर घटकों और मायोकार्डियम की संरचना दोनों की बेहतर नकल करने के लिए इन विट्रो मॉडल के भीतर ऊतक संरचना की जटिलता में सुधार करना महत्वपूर्ण है। यहां इस काम में, हम एक उपन्यास माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के भीतर 3 डी परिपक्व स्टेम सेल-व्युत्पन्न मानव हृदय ऊतक के विकास के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं। इस डिवाइस में जन्मजात अंडाकार माइक्रोपोस्ट के साथ एक 3डी मुख्य ऊतक चैनल शामिल है जो आसपास के हाइड्रोजेल के संरेखण की उच्च डिग्री को प्रेरित करता है कार्डियक कोशिकाओं को समझाया जाता है।मुख्य चैनल इंजेक्शन बंदरगाहों के साथ मीडिया चैनलों द्वारा घिरा हुआ है जो पूरे ऊतक में पोषक तत्वों का प्रसार सक्षम करता है। माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को संभालने में आवश्यक देखभाल के कारण, इस प्रोटोकॉल का दृश्य प्रतिनिधित्व उन्नत ऊतक संरेखण के लिए एम्बेडेड माइक्रोपोस्ट के साथ माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के भीतर 3 डी कार्डियक ऊतक को ठीक से स्थापित करने में सहायक है। मानव हृदय फाइब्रोब्लास्ट को अलग करने के लिए, पहले इनक्यूबेटर से फ्लास्क निकालें।जैवसेफ्टी कैबिनेट के अंदर रखो और फ्लास्क से खर्च किए गए मीडिया को आकांक्षी करना शुरू करें। इसके बाद फ्लास्क धोने के लिए पीबीएस 1X के तीन एमएलएस लें। टोपी बंद करें और फ्लास्क को घूमते हैं ताकि नीचे पीबीएस में ठीक से लेपित हो।पीबीएस को आकांक्षी करें। 37 डिग्री ट्राइप्सिन के तीन एमएलएस लें और फ्लास्क में डालें। इसके बाद फ्लास्क और भंवर को झुकाएं ताकि नीचे पूरी तरह से लेपित हो।इसके बाद इनक्यूबेटर में चार से छह मिनट तक लगा दें। तीन एमएलएस लेकर एफजीएम 3 के साथ ट्राइपसिन को बेअसर करें और उसे फ्लास्क में जोड़ दें। फ्लास्क के पीछे रहने वाली किसी भी कोशिकाओं को उखाड़ फेंकने के लिए समाधान को ऊपर और नीचे पिपेट करें।एक 15 एमएल फाल्कन ट्यूब में सेल निलंबन ले लीजिए। कोशिका निलंबन के 10 माइक्रोलीटर लें और एक हीमोसाइटोमीटर में बांटना एक माइक्रोस्कोप के साथ कोशिकाओं की गिनती करने के लिए । चार मिनट के लिए 250 जी पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र।अपकेंद्रित्र के बाद, अलौकिक को सेल पेलेट को परेशान न करने के लिए सावधान रहें। एक वांछित 75 मिलियन कोशिकाओं प्रति एमएल निलंबन बनाने के लिए ताजा FGM3 के साथ सेल गोली को फिर से खर्च करें। कोशिकाओं को फिर से रीसुस्ल करें, फिर ट्यूब को शिथिल फिट टोपी के साथ नीचे सेट करें।कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के लिए, प्लेट को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें और मीडिया को एस्पिरेट करें। पीबीएस के छह एमएलएस लें और कुओं को धोएं ताकि प्रत्येक कुएं में पीबीएस का एक एमएल हो। पीबीएस को एस्पिरेट करें, सावधान रहें कि प्लेट से जुड़ी कोशिकाओं को परेशान न करें।गरम ट्रिप्ले एक्सप्रेस के छह एमएलएस जोड़ें ताकि एक छह अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में एक एमएल हो। कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए ट्रिप्ले के साथ इनक्यूबेट करें। 10 मिनट के बाद, आरपीएमआई प्लस बी27 प्लस इंसुलिन के छह एमएलएस के साथ ट्रिप्ले को बेअसर करें ताकि आप प्रत्येक अच्छी तरह से आरएमपीआई के एक एमएल को जोड़ रहे हैं।समाधान एकत्र करने के लिए एक एमएल पिपेट का उपयोग करें और यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी कोशिकाओं को हटा लिया गया है। एक 15 एमएल फाल्कन ट्यूब में सेल निलंबन ले लीजिए। तीन मिनट के लिए 300 ग्राम पर ट्यूब अपकेंद्रित्र करें।अपकेंद्रित्र के बाद, मीडिया और ट्रिप्ले को आकांक्षी करें। संवेदनशील कार्डियोमायोसाइट्स को धोने के लिए यह कदम महत्वपूर्ण है। यह कदम यह सुनिश्चित करता है कि सभी ट्रिप्ले 3 डी कार्डियक ऊतक गठन में चला गया है।आरपीएमआई प्लस बी27 प्लस इंसुलिन के पांच एमएलएस में सेल पेलेट को रीसस्ट करें। एक सजातीय सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए समाधान को ऊपर और नीचे पाइपेट करने के लिए एक एमएल पिपेट का उपयोग करें। हीमोसाइटोमीटर के साथ गिनती के लिए सेल सस्पेंशन के 10 माइक्रोलीटर लें।तीन मिनट के लिए 300 ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें। दूसरी बार अपकेंद्रित्र के बाद मीडिया को आकांक्षी । 75 मिलियन कोशिकाओं को प्रति एमएल निलंबन प्राप्त करने के लिए आरपीएमआई प्लस बी27 प्लस इंसुलिन की उचित मात्रा जोड़ें, फिर पुनर्सुंदर।एनकैप्सुलेशन के लिए कोलेजन समाधान तैयार करने के लिए, हुड में एक आइसबॉक्स पर सभी रिएजेंट्स रखें। इसके बाद स्टॉक कोलेजन के 75 माइक्रोलीटर लें। कोलेजन बहुत चिपचिपा है, इसलिए धीरे-धीरे पिपेट के साथ तेज करें, फिर बर्फ पर एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में वितरित करें।आरपीएमआई के 13.85 माइक्रोलीटर लें और फाल्कन ट्यूब में कोलेजन में जोड़ें। इसके बाद फिनॉल रेड के 10 माइक्रोलीटर लें और आइस और रिसिपेंड पर इस मिश्रण में डालें। अंत में, एक सामान्य नाओएच के 1.15 माइक्रोलीटर लें और बेअसर करने के लिए निलंबन में जोड़ें।इसके बाद 200 माइक्रोलिटर पिपेट टिप लें और सस्पेंशन को रीसुस्पेंड करें। अगला कदम कोलेजन मेट्रोगेल के भीतर कोशिकाओं का एनकैप्सुलेशन है। फिर सीएम के आठ माइक्रोलीटर का एक बहाना लें और बर्फ पर एक ताजा फाल्कन ट्यूब में जोड़ें।इसके बाद सीएस के दो माइक्रोलीटर लें और उस सेल मिश्रण में डालें। सेल निलंबन को फिर से खर्च करें और सेल निलंबन के 5.6 माइक्रोलीटर को पकड़ें और एक ताजा फाल्कन ट्यूब में डाल दें। फिर उस कोलेजन को पकड़ें जिसे आपने अभी तैयार किया है, कोलेजन के चार माइक्रोलीटर लें, फिर मेट्रोगेल के 2.4 माइक्रोलीटर लें।सेल हाइड्रोगेल निलंबन का एक सजातीय वितरण सुनिश्चित करने के लिए मिश्रण को ऊपर और नीचे पिपेट करें। एक बार जेल इंजेक्शन तैयार हो जाने के बाद, आप उपकरणों में डाल सकते हैं। एक नया टोटका लें और रिस्पन करें।उपकरणों की पेट्री डिश लें, इंजेक्शन पोर्ट में टिप डालें, और धीरे-धीरे और तेजी से इंजेक्ट करें। आप देखेंगे कि डिवाइस चैनल सेल हाइड्रोगेल निलंबन के साथ भरता है। एक बार दूसरे पोर्ट भर जाने के बाद इंजेक्शन बंद कर दें और टिप निकाल लें।इंजेक्शन के बाद, चिमटी के साथ उपकरणों को फ्लिप करें और नौ मिनट के लिए इनक्यूबेटर में पानी के साथ बड़े पेट्री डिश के अंदर रखें। नौ मिनट के बाद, उपकरणों को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें और सीधा फ्लिप करें, फिर हाइड्रोजेल बहुलीकरण को पूरा करने के लिए नौ और मिनट के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखें। अब मीडिया को जोड़ने का समय आ गया है ।तो, आरएमपीआई प्लस बी 27 लें और मीडिया पोर्ट में टिप डालें और धीरे-धीरे धक्का देना शुरू करें। फिर विपरीत मीडिया पोर्ट पर ऐसा करते हैं । आप पा सकते हैं कि मीडिया इंजेक्शन नहीं लगा रहा है, इसलिए आप बंदरगाह के शीर्ष पर मीडिया की एक बूंद डाल सकते हैं और फिर पिपेट ले सकते हैं और मीडिया को दूसरी तरफ से खींचने के लिए नकारात्मक दबाव का उपयोग कर सकते हैं ।तो आप देखेंगे के रूप में मीडिया के लिए चैनल के माध्यम से खींच लिया शुरू होता है । एक बार मीडिया मीडिया चैनलों के सभी के लिए जोड़ा गया है, उपकरणों ३७ डिग्री पर इनक्यूबेटर में वापस डाल दिया जाएगा । ऊपरी बाएं हाथ के कोने में माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस दिखाया गया है।दिन एक, सात, और संस्कृति के 14 इस छवि को दिखाया गया है । संस्कृति के 14 दिनों के बाद, कोशिकाओं को अत्यधिक गठबंधन संरचनाओं में गाढ़ा होना चाहिए जो माइक्रोपोस्ट के चारों ओर बनते हैं। 14 दिन के निशान यहां सहज संकुचन के सी में दिखाए जाते हैं, साथ ही ऐक्टिन दाग और हृदय मार्कर दाग ऊतकों की इम्यूनोफ्लोर्सेंट छवियां भी दिखाई जाती हैं।क्या देखा जाना चाहिए अत्यधिक गठबंधन actin फाइबर है कि संस्कृति में 14 दिनों के बाद फार्म, साथ ही समानांतर striated परिपक्व sarcomeres और स्थानीय अंतर जंक्शनों । इस प्रक्रिया के दौरान, समय से पहले बहुलीकरण को रोकने के लिए सेल हाइड्रोजेल इंजेक्शन के दौरान बर्फ पर कम तापमान पर सभी सामग्रियों को रखना महत्वपूर्ण है। माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को निर्माण, इंजेक्शन और विस्तारित ऊतक संस्कृति दोनों के दौरान देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए।सेल इंजेक्शन यह सुनिश्चित करने के लिए एक स्थिर प्रक्रिया होनी चाहिए कि मीडिया के अलावा से पहले समय से पहले बहुलकीकरण या हाइड्रोगेल को सुखाने से रोकने के लिए पूरे चैनल ने जल्दी से प्रदर्शन किया है।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

उच्च throughput प्रोटीन अभिव्यक्ति मंच microfluidic नहीं एक जनरेटर का उपयोग

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

एक मानव 3 डी के ऊतक इंजीनियरिंग<em&gt; इन विट्रो</em&gt; ट्यूमर परीक्षा प्रणाली

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

एक मजबूत, microfluidic intracellular वितरण मंच के रूप में सेल फैलाएंगे

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

बहु अंग चिप - लंबी अवधि के बहु-ऊतक Coculture के लिए एक microfluidic प्लेटफार्म

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

उच्च throughput एकल सेल अलगाव और संस्कृति के लिए एक microfluidic मंच

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

कण के स्थानिक ट्रैकिंग के लिए मल्टिप्लेक्स इलेक्ट्रॉनिक पता लगाने के साथ microfluidic मंच

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

3 डी बायोप्रिंटिंग का उपयोग करने वाले स्पैरोइड्स के मेडीकल इंटीग्रेशन का कार्डिएक टिश्यू का निर्माण

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

एक Microwell Array प्लेटफॉर्म के भीतर विधानसभा और माइक्रोबियल सामुदायिक विकास का ट्रैकिंग

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

भ्रूण और वयस्क कार्डियक ऊतक Explants के तुलनीय Decellularization 3 डी की तरह प्लेटफार्मों के लिए इन विट्रो अध्ययन में

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis एलिगेंस में अनुदैर्ध्य इमेजिंग के लिए एक Microfluidic प्लेटफार्म

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...