Name: developing 3d organized human cardiac tissue within a microfluidic platform
Uploaded: 2021-06-15T15:00:00
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Vorremmo ringraziare nsf CAREER Award #1653193, Arizona Biomedical Research Commission (ABRC) New Investigator Award (ADHS18-198872) e il Flinn Foundation Award per aver fornito fonti di finanziamento per questo progetto. La linea hiPSC, SCVI20, è stata ottenuta da Joseph C. Wu, MD, PhD presso lo Stanford Cardiovascular Institute finanziato da NIH R24 HL117756. La linea hiPSC, IMR90-4, è stata ottenuta dal WiCell Research Institute55,56.

Eseguire tutta la manipolazione delle cellule e la preparazione dei reagenti all'interno di un armadio biosicurezza. Assicurarsi che tutte le superfici, i materiali e le apparecchiature che entrano in contatto con le cellule siano sterili (ad esempio, spruzzare con il 70% di etanolo). Le cellule devono essere coltivate in un incubatore umidificato di 37 °C, 5% di CO2. Tutte le impostazioni cultura e differenziazione hiPSC vengono eseguite in piastre a 6 po porsi.
1. Creazione di disp...

La formazione di un modello di tessuto cardiaco umano in vitro con interazioni cellule-cellule migliorate e struttura 3D biomimetica è imperativa per la ricerca cardiovascolare di base e le corrispondenti applicazionicliniche 1. Questo protocollo delineato spiega lo sviluppo del tessuto cardiaco anisotropico umano 3D all'interno di un dispositivo microfluidico, utilizzando la co-coltura di MACCHINE derivate da cellule staminali con FF connettivi incapsulati all'interno di un idrogel di c...

Gli approcci di ingegneria tissutale sono stati ampiamente esplorati, negli ultimi anni, per accompagnare i risultati clinici in vivo nella medicina rigenerativa e nellamodellazione delle malattie 1,2. Un'enfasi significativa è stata posta in particolare sulla modellazione in vitro dei tessuti cardiaci a causa delle difficoltà intrinseche nell'approvvigionamento del tessuto cardiaco primario umano e nella produzione di surrogati in vitro fisiologicamente rilevanti, limitando la comprensione fondamentale dei complessi meccanismi delle malattie cardiovascolari (CVD)1,3. I modelli tradizionali hanno spesso coinvolto test di coltura monostrato 2D. Tuttavia, l'importanza di coltivare cellule cardiache all'interno di un ambiente 3D per imitare sia il paesaggio nativo del miocardio che le complesse interazioni cellulari è stata ampiamentecaratterizzata 4,5. Inoltre, la maggior parte dei modelli prodotti finora hanno incluso una monocoltura di MACCHINE differenziate dalle cellule staminali. Tuttavia, il cuore è composto da più tipi di cellule6 all'interno di una complessa architettura 3D7, che garantisce la necessità critica di migliorare la complessità della composizione tissutale all'interno di modelli in vitro 3D per imitare meglio i costituenti cellulari del miocardio nativo.
Ad oggi, sono stati esplorati molti approcci diversi per produrre modelli 3D biomimetici del miocardio8. Questi approcci vanno dalle configurazioni sperimentali che consentono il calcolo in tempo reale della forza generata, dalle MACCHINE monocolturate seminate su pellicole sottili (considerate pellicole sottili muscolari (MTF))9,alle cellule cardiache co-coltura in matrici idrogel 3D sospese tra cantilevers indipendenti (ritenuti tessuti cardiaci ingegnerizzati (EHTs))10. Altri approcci si sono concentrati sull'implementazione di tecniche di micromolding per imitare l'anisotropia miocardico, dalle macchine virtuali monocolturali in un idrogel 3D sospeso tra micropost sporgenti in un cerottotissutale 11,alle MACCHINE monocoltura sementi tra microgroovi rientrati12,13. Ci sono vantaggi e svantaggi intrinseci per ciascuno di questi metodi, quindi, è pertinente utilizzare la tecnica che si allinea con l'applicazione prevista e la corrispondente questione biologica.
La capacità di migliorare la maturazione delle MACCHINE derivate da cellule staminali è essenziale per il successo dell'ingegneria in vitro del tessuto miocardico simile a quello adulto e la traduzione dei successivi risultati alle interpretazioni cliniche. A tal fine, i metodi per maturare le MACCHINE sono stati ampiamente esplorati, sia in 2D che in3D 14,15,16. Ad esempio, la stimolazione elettrica incorporata negli ETT, l'allineamento forzato delle MACCHINE con la topografia superficiale, i segnali di segnalazione, i fattori di crescita della cocoltura e / o le condizioni dell'idrogel 3D, ecc., portano tutti a un cambiamento a favore della maturazione cm in almeno uno dei seguenti: morfologia cellulare, manipolazione del calcio, struttura sarcomerica, espressione genica o forza contrattile.
Di questi modelli, gli approcci che utilizzano piattaforme microfluidiche mantengono alcuni vantaggi in natura, come il controllo dei gradienti, l'input limitato delle cellule e i reagenti necessari minimi. Inoltre, molte repliche biologiche possono essere generate contemporaneamente utilizzando piattaforme microfluidiche, servendo a sezionare meglio il meccanismo biologico di interesse e ad aumentare la dimensione sperimentale del campione a favoredella potenza statistica 17,18,19. Inoltre, l'utilizzo della fotolitografia nel processo di fabbricazione del dispositivo microfluidico consente la creazione di caratteristiche precise (ad esempio, topografie) a livello micro e nano, che fungono da segnali mesoscopici per migliorare la struttura cellulare circostante e l'architettura dei tessuti macro-livello18,20,21,22 per diverse applicazioni nella rigenerazione dei tessuti e nella modellazione delle malattie.
In precedenza abbiamo dimostrato lo sviluppo di un nuovo modello di tessuto cardiaco 3D su chip che incorpora la topografia superficiale, sotto forma di micropost ellittiche innati, per allineare le cellule cardiache co-coltivate in idrogel in un tessuto anisotropicointerconnesso 20. Dopo 14 giorni di coltura, i tessuti formatisi all'interno del dispositivo microfluidico sono più maturi nel fenotipo, nel profilo di espressione genica, nelle caratteristiche di manipolazione del calcio e nella risposta farmaceutica rispetto ai controlli monostrato e isotropi 3D23. Il protocollo qui descritto delinea il metodo per la creazione di questo 3D co-coltivato, allineato (cioè, anisotropico) tessuto cardiaco umano all'interno del dispositivo microfluidico utilizzando CRM derivati dall'hiPSC. In particolare, spieghiamo i metodi per differenziare e purificare gli iPSC verso le IC, l'integrazione di hFC con IC per produrre una popolazione di co-coltura stabilita, l'inserimento della popolazione cellulare incapsulata all'interno dell'idrogel di collagene nei dispositivi microfluidici e la successiva analisi dei tessuti costruiti in 3D attraverso test contrattili e immunofluorescenti. I micro tissue ingegnerizzati in 3D risultanti sono adatti per varie applicazioni, tra cui studi di biologia fondamentale, modellazione CVD e test farmaceutici.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.65 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm Biopsy punch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95039-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm Biopsy punch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95039-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18x18mm coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-308</td>
			<td>The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>101176-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well flat botttom tissue-culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 minus insulin</td>
			<td>LifeTech</td>
			<td>A1895602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 plus insulin</td>
			<td>LifeTech</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10188-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47747-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21600069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>can also be made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45001-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM3</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10172-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFR-Matrigel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47743-718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10152-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC-Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>BD354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0536-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTCS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440299-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (150x15mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (60x15mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3532-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MT10040CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 minus glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45001-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafers (100mm)</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>1196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium lactate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4263-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 2075</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y111074 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 Developer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>NC9901158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Elastomer</td>
			<td>Essex Brownell</td>
			<td>DC-184-1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVG620 Aligner</td>
			<td>EVG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner PDC-32G</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver Z1 microscope</td>
			<td>Nikon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

developing 3d organized human cardiac tissue within a microfluidic platform

La principale causa di morte in tutto il mondo persiste come malattia cardiovascolare (CVD). Tuttavia, modellare la complessità fisiologica e biologica del muscolo cardiaco, il miocardio, è notoriamente difficile da realizzare in vitro. Principalmente, gli ostacoli risiedono nella necessità di cardiomiociti umani (MIC) che siano adulti o mostrino fenotipi simili a adulti e possano replicare con successo la complessità cellulare del miocardio e l'intricata architettura 3D. Sfortunatamente, a causa di preoccupazioni etiche e della mancanza di tessuto cardiaco umano primario disponibile derivato dal paziente, combinato con la minima proliferazione di MACCHINE, l'approvvigionamento di MACCHINE umane vitali è stato un passo limitante per l'ingegneria dei tessuti cardiaci. A tal fine, la maggior parte delle ricerche è transizione verso la differenziazione cardiaca delle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC) come fonte primaria di IC umane, con conseguente ampia incorporazione di IC hiPSC all'interno di saggi in vitro per la modellazione dei tessuti cardiaci.
Qui in questo lavoro, dimostriamo un protocollo per lo sviluppo di un tessuto cardiaco umano derivato da cellule staminali mature 3D all'interno di un dispositivo microfluidico. Spieghiamo e dimostriamo visivamente la produzione di un modello 3D in vitro di tessuto cardiaco anisotropico su chip da MACCHINE derivate dall'hiPSC. Descriviamo principalmente un protocollo di purificazione da selezionare per le MACCHINE, la co-coltura di cellule con un rapporto definito attraverso la miscelazione di MACCHINE con FF umani (hRF) e la sospensione di questa co-coltura all'interno dell'idrogel a base di collagene. Dimostriamo inoltre l'iniezione dell'idrogel carico di cellule all'interno del nostro ben definito dispositivo microfluidico, incorporato con micropost ellittici sfalsati che fungono da topografia superficiale per indurre un alto grado di allineamento delle cellule circostanti e della matrice idrogel, imitando l'architettura del miocardio nativo. Immaginiamo che il modello 3D anisotropico di tessuto cardiaco su chip sia adatto per studi di biologia fondamentale, modellazione delle malattie e, attraverso il suo uso come strumento di screening, test farmaceutici.

Per ottenere una popolazione altamente purificata di MACCHINE dagli hiPSC, viene utilizzata una versione modificata che coinvolge una combinazione del protocollo di differenziazionelian 33 e dei passaggi di purificazione di Tohyama34 (fare riferimento alla figura 1A per la sequenza temporale sperimentale). Gli iPSC devono essere simili a colonie, ~85% confluenti e distribuiti uniformemente in tutta la cultura ben 3-4 giorni dopo il passaggio, a...

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Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

L'obiettivo di questo protocollo è spiegare e dimostrare lo sviluppo di un modello microfluidico tridimensionale (3D) di tessuto cardiaco umano altamente allineato, composto da cardiomiociti derivati da cellule staminali co-coltivati con fibroblasti cardiaci (FF) all'interno di un idrogel biomimetico a base di collagene, per applicazioni nell'ingegneria dei tessuti cardiaci, nello screening dei farmaci e nella modellazione delle malattie.

Sviluppo di tessuto cardiaco umano organizzato in 3D all'interno di una piattaforma microfluidico

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

Le malattie cardiovascolari rimangono la prima causa di morte in tutto il mondo. I modelli tradizionali in vitro si basano sulla coltura monostrato. Tuttavia, il cuore, in particolare il muscolo cardiaco o il miocardio, è complesso nella sua anisotropia 3D e nella composizione cellulare.Pertanto, è fondamentale migliorare la complessità della composizione tissutale all'interno dei modelli in vitro per imitare meglio sia i costituenti cellulari che la struttura del miocardio. Qui in questo lavoro, dimostriamo un protocollo per lo sviluppo di un tessuto cardiaco umano derivato da cellule staminali mature 3D all'interno di un nuovo dispositivo microfluidico. Questo dispositivo incorpora un canale tissutale principale 3D con micropost ellittici innati che inducono alti gradi di allineamento delle cellule cardiache incapsulate idrogel circostanti.Il canale principale è affiancato da canali multimediali con porte di iniezione che consentono una diffusione dei nutrienti in tutto il tessuto. A causa della cura necessaria nella gestione dei dispositivi microfluidici, la rappresentazione visiva di questo protocollo è utile per stabilire correttamente il tessuto cardiaco 3D all'interno di un dispositivo microfluidico con micropost incorporati per un migliore allineamento dei tessuti. Per dissociare il fibroblasto cardiaco umano, estraere prima il pallone dall'incubatrice.Mettere all'interno dell'armadio di biosicurezza e iniziare ad aspirare i supporti spesi dal pallone. Quindi prendere tre ML di PBS 1X per lavare il pallone. Chiudere il cappuccio e ruotare il pallone in modo che il fondo sia rivestito correttamente in PBS.Aspirare il PBS. Prendere tre ML di tripina di 37 gradi e aggiungere al pallone. Quindi inclinare il pallone e ruotare in modo che il fondo sia interamente rivestito.Quindi mettere nell'incubatrice per quattro o sei minuti. Neutralizzare la tripina con FGM3 prendendo tre LMR e aggiungendolo al pallone. Pipettare la soluzione su e giù per spostare tutte le cellule che rimangono sul retro del pallone.Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo Falcon da 15 ML. Prendi 10 microlitri della sospensione cellulare e dispensa in un emocitometro per contare le cellule con un microscopio. Centrifugare la sospensione cellulare a 250 G per quattro minuti.Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante facendo attenzione a non disturbare il pellet cellulare. Rimorsi il pellet di cellule con FGM3 fresco per realizzare i 75 milioni di celle desiderati per sospensione ML. Rimorsi le celle, quindi impostare il tubo verso il basso con un cappuccio liberamente montato.Per dissociare i cardiomiociti, estraere il piatto dall'incubatrice e aspirare il supporto. Prendi sei ML di PBS e lava i pozzi in modo che ci sia una ML di PBS in ogni pozzo. Aspirare il PBS, facendo attenzione a non disturbare le cellule attaccate alla piastra.Aggiungere sei ML di trypLE Express riscaldato in modo che ci sia una ML in ogni pozzo di una piastra a sei po pozza. Incubare le cellule con il tripLE per 10 minuti. Dopo 10 minuti, neutralizza il trypLE con sei ML di RPMI più B27 più insulina in modo da aggiungere una ML di RMPI a ciascun pozzo.Utilizzare una pipetta ML per raccogliere la soluzione e colpirla contro la parte posteriore dei pozzi per assicurarsi che tutte le celle siano tolte. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo Falcon da 15 ML. Centrifugare il tubo a 300 G per tre minuti.Dopo la centrifugazione, aspirare il supporto e il triplo. Questo passaggio è importante per lavare i cardiomiociti sensibili. Questo passaggio assicura che tutto il triplo sia sparito nella formazione di tessuto cardiaco 3D.Rimossare il pellet cellulare in cinque ML di RPMI più B27 più insulina. Utilizzare una pipetta ML per pipettare la soluzione su e giù per garantire una sospensione cellulare omogenea. Prendi 10 microlitri della sospensione cellulare per il conteggio con l'emocitometro.Centrifugare le cellule a 300 G per tre minuti. Aspirare i supporti dopo la centrifugazione per la seconda volta. Aggiungere la quantità appropriata di RPMI più B27 più insulina per ottenere 75 milioni di cellule per sospensione ML, quindi rimorsi.Per preparare la soluzione di collagene per l'incapsulamento, avere tutti i reagenti su una ghiacciaia nel cappuccio. Quindi prendi 75 microlitri del collagene stock. Il collagene è molto viscoso, quindi lentamente assorbimento con la pipetta, quindi erogare in un tubo di microcentrifugo sul ghiaccio.Assumere 13,85 microlitri di RPMI e aggiungere al collagene nel tubo Falcon. Quindi prendere 10 microlitri di rosso fenolo e aggiungere alla miscela su ghiaccio e resuspend. Infine, prendere 1,15 microlitri di un naoh normale e aggiungere alla sospensione per neutralizzare.Quindi prendere una punta di pipetta da 200 microliter e rimodere la sospensione. Il prossimo passo è l'incapsulamento delle cellule all'interno del metrogel di collagene. Quindi prendere un'aliquota di otto microlitri di MACCHINE e aggiungere a un tubo Falcon fresco sul ghiaccio.Quindi prendere due microlitri di CS e aggiungere a quella miscela cellulare. Rimosi la sospensione cellulare e afferra 5,6 microlitri della sospensione cellulare e metti in un tubo Falcon fresco. Quindi prendi il collagene che hai appena preparato, prendi quattro microlitri del collagene, quindi prendi 2,4 microlitri di metrogel.Pipettare la miscela su e giù per garantire una distribuzione omogenea della sospensione dell'idrogel cellulare. Una volta preparata l'iniezione di gel, è possibile inserire nei dispositivi. Prendi un nuovo consiglio e resuspend.Prendi la piastra di Petri dei dispositivi, inserisci la punta nella porta di iniezione e inietta lentamente e costantemente. Vedrai come il canale del dispositivo si riempie con la sospensione dell'idrogel cellulare. Una volta riempita l'altra porta, interrompere l'iniezione e rimuovere la punta.Dopo l'iniezione, capovolgere i dispositivi con una pinzetta e posizionare all'interno della piastra di Petri più grande con acqua nell'incubatrice per nove minuti. Dopo nove minuti, eserti i dispositivi dall'incubatore e capovolgere in posizione verticale, quindi riposizionare nell'incubatore per altri nove minuti per completare la polimerizzazione dell'idrogel. Ora è il momento di aggiungere i media.Quindi, prendi RMPI più B27 e inserisci la punta nella porta multimediale e inizia a spingere lentamente. Quindi fallo sulla porta multimediale opposta. Potresti scoprire che il supporto non sta iniettando, quindi puoi mettere una goccia di supporto sopra la porta e quindi prendere la pipetta e usare la pressione negativa per tirare il supporto dall'altro lato.Quindi vedrai come i media iniziano a essere tirati attraverso il canale. Una volta che i supporti sono stati aggiunti a tutti i canali multimediali, i dispositivi verranno rimetteti nell'incubatore a 37 gradi. Il dispositivo microfluidico è mostrato nell'angolo in alto a sinistra.Ai giorni uno, sette e 14 della cultura viene mostrata questa immagine. Dopo 14 giorni di coltura, le cellule dovrebbero condensarsi in strutture altamente allineate che si formano intorno ai micropost. Tracce del giorno 14 sono mostrate qui in C di contrazione spontanea, così come immagini immunofluorescenti di actina macchiata e tessuti macchiati di marcatori cardiaci.Ciò che dovrebbe essere visto sono fibre di actina altamente allineate che si formano dopo 14 giorni in coltura, così come sarcomeres maturi striati paralleli e giunzioni gap localizzate. Durante questa procedura, è fondamentale mantenere tutti i materiali a basse temperature sul ghiaccio durante l'iniezione di idrogel cellulare per prevenire la polimerizzazione prematura. I dispositivi microfluidici devono essere maneggiati con cura, sia durante la fabbricazione, l'iniezione, sia la coltura estesa dei tessuti.Le iniezioni cellulari dovrebbero essere un processo costante per garantire che l'intero canale si sia riempito mentre viene eseguito rapidamente per prevenire la polimerizzazione prematura o l'essiccazione dell'idrogel prima dell'aggiunta del supporto.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Ricerca

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