Name: developing 3d organized human cardiac tissue within a microfluidic platform
Uploaded: 2021-06-15T15:00:00
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Gostaríamos de agradecer ao NSF CAREER Award #1653193, Arizona Biomedical Research Award (ABRC) New Investigator Award (ADHS18-198872) e ao Prêmio Flinn Foundation por fornecer fontes de financiamento para este projeto. A linha hiPSC, SCVI20, foi obtida de Joseph C. Wu, MD, PhD no Stanford Cardiovascular Institute financiado pelo NIH R24 HL117756. A linha hiPSC, IMR90-4, foi obtida pelo WiCell Research Institute55,56.

Realize toda a preparação de manuseio de células e reagentes dentro de um Gabinete de Biossegurança. Assegure-se de que todas as superfícies, materiais e equipamentos que entram em contato com as células são estéreis (ou seja, pulverizar com 70% de etanol). As células devem ser cultivadas em uma incubadora umidificada de 37 °C, 5% de CO2. Toda cultura e diferenciação hiPSC é realizada em placas de 6 poços.
1. Criação de dispositivo microfluido (duração aproximada: 1 ...

A formação de um modelo de tecido cardíaco humano in vitro com interações células-células aprimoradas e estrutura 3D biomimética é imprescindível para pesquisas cardiovasculares básicas e aplicações clínicas correspondentes1. Este protocolo delineado explica o desenvolvimento de tecido cardíaco anisotrótrópico humano 3D dentro de um dispositivo microfluido, utilizando co-cultura de CMs derivados de células-tronco com CFs conectivos encapsulados dentro de um hidrogel de c...

Abordagens de engenharia de tecidos têm sido amplamente exploradas, nos últimos anos, para acompanhar os achados clínicos in vivo na medicina regenerativa e modelagem da doença1,2. A ênfase significativa tem sido particularmente colocada na modelagem in vitro do tecido cardíaco devido às dificuldades inerentes à obtenção do tecido cardíaco primário humano e à produção fisiologicamente relevante substitutos in vitro, limitando a compreensão fundamental dos mecanismos complexos de doenças cardiovasculares (DCV)1,3. Modelos tradicionais têm frequentemente envolvido ensaios de cultura monocamadas 2D. No entanto, a importância de aculturar células cardíacas dentro de um ambiente 3D para imitar tanto a paisagem nativa do miocárdio quanto as complexas interações celulares tem sido amplamente caracterizada4,5. Além disso, a maioria dos modelos produzidos até agora incluiu uma monocultura de CMs diferenciadas das células-tronco. No entanto, o coração é composto por múltiplos tipos de células6 dentro de uma complexa arquitetura 3D7,garantindo a necessidade crítica de melhorar a complexidade da composição tecidual dentro de modelos in vitro 3D para melhor imitar constituintes celulares do miocárdio nativo.
Até o momento, muitas abordagens diferentes foram exploradas para produzir modelos 3D biomiméticos do miocárdio8. Essas abordagens vão desde configurações experimentais que permitem o cálculo em tempo real da força gerada, desde CMs monoculturados em filmes finos (considerados filmes musculosos finos (MTFs))9, até células cardíacas de co-cultura em matrizes de hidrogel 3D suspensas entre cantilevers de pé livre (considerados tecidos cardíacos projetados (EHTs))10. Outras abordagens se concentraram na implementação de técnicas de micromoldagem para imitar a anisotropia miocárdia, desde CMs monocultura em um hidrogel 3D suspenso entre micropostos salientes em um patch de tecido11, até CMs monocultura semeados entre microgrooves recuados12,13. Há vantagens e desvantagens inerentes a cada um desses métodos, portanto, é pertinente utilizar a técnica que se alinha com a aplicação pretendida e a questão biológica correspondente.
A capacidade de melhorar a maturação de CMs derivados de células-tronco é essencial para a engenharia in vitro bem sucedida do tecido miocárdio adulto e tradução de achados subsequentes para interpretações clínicas. Para isso, os métodos para amadurecer CMs têm sido amplamente explorados, tanto em 2D quanto em3D 14,15,16. Por exemplo, estimulação elétrica incorporada em EHTs, alinhamento forçado de CMs com topografia superficial, sinalização, fatores de crescimento da cocultura e/ou condições de hidrogel 3D, etc., tudo leva a uma mudança em favor da maturação de CM em pelo menos um dos seguintes: morfologia celular, manuseio de cálcio, estrutura sarvúrica, expressão genética ou força contratil.
Desses modelos, as abordagens que utilizam plataformas microfluídicas mantêm certas vantagens na natureza, como controle de gradientes, entrada celular limitada e reagentes mínimos necessários. Além disso, muitas réplicas biológicas podem ser geradas de uma só vez usando plataformas microfluídicas, servindo para dissecar melhor o mecanismo biológico de interesse e aumentar o tamanho amostral experimental em favor do poder estatístico17,18,19. Além disso, o uso da fotolitografia no processo de fabricação de dispositivos microfluidos permite a criação de recursos precisos (por exemplo, topografias) no nível micro e nano, que servem como pistas mesoscópicas para melhorar a estrutura celular circundante e a arquitetura tecidual18,20,21,22 para diferentes aplicações na regeneração tecidual e modelagem de doenças.
Anteriormente, demonstramos o desenvolvimento de um novo modelo de tecido cardíaco 3D no chip que incorpora topografia superficial, na forma de micropostos elípticos inatos, para alinhar células cardíacas co-cultivadas por hidrogel em um tecido anisotrópico interconectado20. Após 14 dias de cultura, os tecidos formados dentro do dispositivo microfluido são mais maduros em seu fenótipo, perfil de expressão genética, características de manuseio de cálcio e resposta farmacêutica quando comparados com monocamadas e controles isotrópicos 3D23. O protocolo aqui descrito descreve o método para a criação deste tecido cardíaco humano 3D co-cultivado, alinhado (ou seja, anisotrópico) dentro do dispositivo microfluido usando CMs derivados de hiPSC. Especificamente, explicamos os métodos para diferenciar e purificar hiPSCs em relação aos CMs, suplementação de HCFs com CMs para produzir uma população de cocultura estabelecida, inserção da população celular encapsulada dentro do hidrogel de colágeno nos dispositivos microfluidos e análise subsequente dos tecidos construídos em 3D através de ensaios contratuais e imunofluorescentes. Os microsaússeis projetados em 3D são adequados para várias aplicações, incluindo estudos fundamentais de biologia, modelagem de DCV e testes farmacêuticos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.65 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm Biopsy punch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95039-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm Biopsy punch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95039-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18x18mm coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-308</td>
			<td>The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>101176-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well flat botttom tissue-culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 minus insulin</td>
			<td>LifeTech</td>
			<td>A1895602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 plus insulin</td>
			<td>LifeTech</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10188-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47747-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21600069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>can also be made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45001-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM3</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10172-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFR-Matrigel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47743-718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10152-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC-Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>BD354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0536-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTCS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440299-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (150x15mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (60x15mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3532-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MT10040CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 minus glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45001-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafers (100mm)</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>1196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium lactate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4263-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 2075</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y111074 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 Developer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>NC9901158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Elastomer</td>
			<td>Essex Brownell</td>
			<td>DC-184-1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVG620 Aligner</td>
			<td>EVG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner PDC-32G</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver Z1 microscope</td>
			<td>Nikon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

developing 3d organized human cardiac tissue within a microfluidic platform

A principal causa de morte no mundo persiste como doença cardiovascular (DCV). No entanto, modelar a complexidade fisiológica e biológica do músculo cardíaco, o miocárdio, é notoriamente difícil de realizar in vitro. Principalmente, os obstáculos residem na necessidade de cardiomiócitos humanos (CMs) que são adultos ou exibem fenótipos adultos e podem replicar com sucesso a complexidade celular do miocárdio e a arquitetura 3D intrincada. Infelizmente, devido a preocupações éticas e falta de tecido cardíaco humano derivado do paciente primário disponível, combinado com a proliferação mínima de CMs, a fonte de CMs humanos viáveis tem sido um passo limitante para a engenharia de tecidos cardíacos. Para isso, a maioria das pesquisas passou para a diferenciação cardíaca das células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) como a principal fonte de CMs humanos, resultando na ampla incorporação de hiPSC-CMs dentro de ensaios in vitro para modelagem de tecido cardíaco.
Aqui neste trabalho, demonstramos um protocolo para o desenvolvimento de um tecido cardíaco humano 3D derivado de células-tronco dentro de um dispositivo microfluido. Explicamos e demonstramos visualmente a produção de um modelo 3D in vitro de tecido cardíaco anisotrótrópico de CMs derivados de hiPSC. Descrevemos principalmente um protocolo de purificação para selecionar para CMs, a co-cultura das células com uma razão definida através da mistura de CMs com CFs humanos (hCFs), e suspensão desta co-cultura dentro do hidrogel à base de colágeno. Demonstramos ainda a injeção do hidrogel carregado de células dentro do nosso dispositivo microfluido bem definido, embutido com micropostos elípticos escalonados que servem como topografia superficial para induzir um alto grau de alinhamento das células circundantes e da matriz de hidrogel, imitando a arquitetura do miocárdio nativo. Prevemos que o modelo 3D anisotrópico de tecido cardíaco on-chip é adequado para estudos fundamentais de biologia, modelagem de doenças e, através de seu uso como ferramenta de triagem, testes farmacêuticos.

Para obter uma população altamente purificada de CMs de hiPSCs, uma versão modificada envolvendo uma combinação do protocolo de diferenciaçãolian 33 e as etapas de purificação de Tohyama34 é usada (consulte a Figura 1A para cronograma experimental). Os hiPSCs precisam ser parecidos com colônias, ~85% confluentes, e se espalhar uniformemente por toda a cultura bem 3-4 dias após a passagem, no início da diferenciação cm<strong clas...

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Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

O objetivo deste protocolo é explicar e demonstrar o desenvolvimento de um modelo microfluido tridimensional (3D) de tecido cardíaco humano altamente alinhado, composto por cardiomiócitos derivados de células-tronco co-cultivados com fibroblastos cardíacos (CFs) dentro de um hidrogel biomimético, à base de colágeno, para aplicações em engenharia de tecido cardíaco, triagem de medicamentos e modelagem de doenças.

Desenvolvimento de tecido cardíaco humano organizado 3D dentro de uma plataforma microfluida

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

As doenças cardiovasculares continuam sendo a causa número um de morte em todo o mundo. Modelos in vitro tradicionais dependem da cultura monocamadas. No entanto, o coração, especificamente o músculo cardíaco ou o miocárdio, é complexo em sua anisotropia 3D e composição celular.Por isso, é fundamental melhorar a complexidade da composição tecidual dentro de modelos in vitro para melhor imitar tanto os constituintes celulares quanto a estrutura do miocárdio. Aqui neste trabalho, demonstramos um protocolo para o desenvolvimento de um tecido cardíaco humano 3D derivado de células-tronco dentro de um novo dispositivo microfluido. Este dispositivo incorpora um canal de tecido principal 3D com micropostos elípticos inatos que induzem altos graus de alinhamento das células cardíacas encapsuladas hidrogel circundante.O canal principal é ladeado por canais de mídia com portas de injeção que permitem uma difusão de nutrientes em todo o tecido. Devido aos cuidados necessários no manuseio dos dispositivos microfluidos, a representação visual deste protocolo é útil para estabelecer adequadamente tecido cardíaco 3D dentro de um dispositivo microfluido com micropostos incorporados para maior alinhamento tecidual. Para dissociar o fibroblasto cardíaco humano, primeiro tire o frasco da incubadora.Coloque dentro do armário de biossegurança e comece a aspirar a mídia gasta do frasco. Em seguida, pegue três MLs de PBS 1X para lavar o frasco. Feche a tampa e gire o frasco para que a parte inferior esteja devidamente revestida em PBS.Aspire a PBS. Pegue três MLs de trippsina de 37 graus e adicione ao frasco. Em seguida, incline o frasco e gire para que a parte inferior esteja totalmente revestida.Em seguida, coloque na incubadora por quatro a seis minutos. Neutralize o trypsin com FGM3 tomando três MLs e adicionando isso ao frasco. Pipeta a solução para cima e para baixo para desalojar todas as células que permanecem na parte de trás do frasco.Colete a suspensão da célula em um tubo Falcon de 15 ML. Pegue 10 microlitros da suspensão celular e dispense em um hemótmetro para contar as células com um microscópio. Centrifugar a suspensão da célula a 250 G por quatro minutos.Após a centrifugação, aspire o supernascedor tomando cuidado para não perturbar a pelota celular. Resuspense a pelota celular com FGM3 fresco para fazer uma desejada suspensão de 75 milhões de células por ML. Resuspend as células, em seguida, definir o tubo para baixo com uma tampa frouxamente encaixada.Para dissociar os cardiomiócitos, tire a placa da incubadora e aspire a mídia. Pegue seis MLs de PBS e lave os poços para que haja um ML de PBS em cada poço. Aspire o PBS, tomando cuidado para não perturbar as células presas à placa.Adicione seis MLs de trypLE Express aquecidos de modo que haja um ML em cada poço de uma placa de seis poços. Incubar as células com o trypLE por 10 minutos. Após 10 minutos, neutralize o trypLE com seis MLs de RPMI mais b27 mais insulina para que você esteja adicionando um ML de RMPI a cada poço.Use uma pipeta ML para coletar a solução e explodi-la contra as costas dos poços para garantir que todas as células sejam retiradas. Colete a suspensão da célula em um tubo Falcon de 15 ML. Centrifugar o tubo a 300 G por três minutos.Após centrifugação, aspire a mídia e o trypLE. Este passo é importante para lavar os cardiomiócitos sensíveis. Esta etapa garante que todo o trypLE se foi em formação de tecido cardíaco 3D.Resuspend a pelota celular em cinco MLs de RPMI mais B27 mais insulina. Use uma pipeta de um ML para pipetar a solução para cima e para baixo para garantir uma suspensão celular homogênea. Pegue 10 microliters da suspensão celular para contar com o hemócito.Centrifugar as células a 300 G por três minutos. Aspire a mídia após centrifugação pela segunda vez. Adicione a quantidade apropriada de RPMI mais b27 mais insulina para alcançar uma suspensão de 75 milhões de células por ML, em seguida, resuspend.Para preparar a solução de colágeno para encapsulamento, tenha todos os reagentes em uma geladeira no capô. Em seguida, pegue 75 microliters do colágeno de estoque. O colágeno é muito viscoso, tão lentamente absorção com a pipeta, em seguida, dispense em um tubo de microcentrifuuge no gelo.Pegue 13,85 microliters de RPMI e adicione ao colágeno no tubo Falcão. Em seguida, pegue 10 microliters de fenol vermelho e adicione à mistura no gelo e resuspend. Por fim, pegue 1,15 microliters de um NaOH normal e adicione à suspensão para neutralizar.Em seguida, pegue uma ponta de pipeta de 200 microliter e resuspenque a suspensão. O próximo passo é o encapsulamento das células dentro do metrogel de colágeno. Em seguida, pegue uma alíquota de oito microliters de CMs e adicione a um tubo Falcon fresco no gelo.Em seguida, pegue dois microliters de CS e adicione a essa mistura celular. Resuspend a suspensão celular e pegue 5,6 microliters da suspensão celular e coloque em um tubo Falcon fresco. Então pegue o colágeno que acabou de preparar, pegue quatro microliters do colágeno, e pegue 2,4 microliters de metrogel.Pipetar a mistura para cima e para baixo para garantir uma distribuição homogênea da suspensão do hidrogel celular. Uma vez que a injeção de gel esteja preparada, você pode inserir em dispositivos. Pegue uma nova dica e resuspend.Pegue a placa de Petri dos dispositivos, insira a ponta na porta de injeção e injete lentamente e de forma constante. Você verá como o canal do dispositivo se enche com a suspensão do hidrogel celular. Uma vez que a outra porta esteja cheia, pare a injeção e remova a ponta.Após a injeção, gire os dispositivos com pinças e coloque dentro da placa petri maior com água na incubadora por nove minutos. Após nove minutos, tire os dispositivos da incubadora e vire ereto, depois coloque de volta na incubadora por mais nove minutos para completar a polimerização do hidrogel. Agora é hora de adicionar a mídia.Então, pegue RMPI mais B27 e insira a ponta na porta de mídia e comece a empurrar lentamente. Então faça isso na porta de mídia oposta. Você pode descobrir que a mídia não está injetando, então você pode colocar uma gota de mídia no topo da porta e, em seguida, pegar a pipeta e usar pressão negativa para puxar a mídia através do outro lado.Então você vai ver como a mídia começa a ser puxado através do canal. Uma vez adicionadas as mídias a todos os canais de mídia, os dispositivos serão colocados de volta na incubadora a 37 graus. O dispositivo microfluido é mostrado no canto superior esquerdo.Nos dias um, sete e 14 da cultura são mostrados esta imagem. Após 14 dias de cultura, as células devem se condensar em estruturas altamente alinhadas que se formam ao redor dos micropostos. Traços do dia 14 são mostrados aqui em C de contração espontânea, bem como imagens imunofluorescentes de tecidos manchados de actin e marcador cardíaco.O que deve ser visto são fibras atuarinas altamente alinhadas que se formam após 14 dias na cultura, bem como sarcomeres maduros estriados paralelos e junções de lacunas localizadas. Durante este procedimento, é fundamental manter todos os materiais a baixas temperaturas no gelo durante a injeção de hidrogel celular para evitar a polimerização prematura. Os dispositivos microfluidos devem ser manuseados com cuidado, tanto durante a fabricação, injeção e cultura de tecido estendido.As injeções celulares devem ser um processo constante para garantir que todo o canal tenha sido preenchido enquanto realizado rapidamente para evitar a polimerização prematura ou a secagem de hidrogel antes da adição da mídia.

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