Name: a model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium
Uploaded: 2021-05-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من قبل المجلس الوطني للسينسيا إي تكنولوجيا (كوناسيت، CB-221137). أدريانا كامبوس طالبة دكتوراه في برنامج الدكتوراه في جامعة المكسيك، وكان يدعمها كوناسيتي (CVU: 1002502).

1. إعداد متوسطة قياسية ومشروطة
<ol><li>لإعداد معيار RPMI 1640، تكملة RPMI 1640 وسط الثقافة مع 10٪ (v/v) من مصل البقر الجنيني (FBS، الحرارة معطلة سابقا) و 1٪ (v/v) من محلول البنسلين-ستريبتوميسين. تخزين المتوسطة عند 4 °C.Sterilize باستخدام مرشحات 0.22 ميكرومتر.</li>
	<li>لإعداد محلول مخزون البالميتات، قم بإعداد محلول 50 mM من...

<ol>
	<li>Younossi, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-alcoholic+fatty+liver+disease+-+a+global+public+health+perspective.">Non-alcoholic fatty liver disease - a global public health perspective.</a> Journal of Hepatology. 70 (3), 531-544 (2019).</li><li>Younossi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+perspectives+on+nonalcoholic+fatty+liver+disease+and+nonalcoholic+steatohepatitis.">Global perspectives on nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis.</a> Hepatology. 69 (6), 2672-2682 (2019).</li><li>Eslam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+definition+for+metabolic+dysfunction-associated+fatty+liver+disease:+An+international+expert+consensus+statement.">A new definition for metabolic dysfunction-associated fatty liver disease: An international expert consensus statement.</a> Journal of Hepatology. 73 (1), 202-209 (2020).</li><li>Eslam, M., Sanyal, A. J., George, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAFLD:+A+consensus-driven+proposed+nomenclature+for+metabolic+associated+fatty+liver+disease.">MAFLD: A consensus-driven proposed nomenclature for metabolic associated fatty liver disease.</a> Gastroenterology. 158 (7), 1999-2014 (2020).</li><li>Chalasani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diagnosis+and+management+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease:+Practice+guidance+from+the+American+association+for+the+study+of+liver+diseases.">The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American association for the study of liver diseases.</a> Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).</li><li>Calzadilla Bertot, L., Adams, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natural+course+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease.">The natural course of non-alcoholic fatty liver disease.</a> International Journal of Molecular Science. 17 (5), 774 (2016).</li><li>Reccia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-alcoholic+fatty+liver+disease:+A+sign+of+systemic+disease.">Non-alcoholic fatty liver disease: A sign of systemic disease.</a> Metabolism. 72, 94-108 (2017).</li><li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+cholesterol+accumulation+in+hepatic+stellate+cells:+Mechanism+of+liver+fibrosis+aggravation+in+nonalcoholic+steatohepatitis+in+mice.">Free cholesterol accumulation in hepatic stellate cells: Mechanism of liver fibrosis aggravation in nonalcoholic steatohepatitis in mice.</a> Hepatology. 59 (1), 154-169 (2014).</li><li>Byrne, C. D., Targher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nafld:+A+multisystem+disease.">Nafld: A multisystem disease.</a> Journal of Hepatology. 62, 47-64 (2015).</li><li>Ipsen, D. H., Lykkesfeldt, J., Tveden-Nyborg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+hepatic+lipid+accumulation+in+non-alcoholic+fatty+liver+disease.">Molecular mechanisms of hepatic lipid accumulation in non-alcoholic fatty liver disease.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (18), 3313-3327 (2018).</li><li>Diehl, A. M., Day, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cause,+pathogenesis,+and+treatment+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">Cause, pathogenesis, and treatment of nonalcoholic steatohepatitis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (21), 2063-2072 (2017).</li><li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oleic+acid+ameliorates+palmitic+acid+induced+hepatocellular+lipotoxicity+by+inhibition+of+ER+stress+and+pyroptosis.">Oleic acid ameliorates palmitic acid induced hepatocellular lipotoxicity by inhibition of ER stress and pyroptosis.</a> Nutrition and Metabolism. 17, 11 (2020).</li><li>Ore, A., Akinloye, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+antioxidant+biomarkers+in+clinical+and+experimental+models+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease.">Oxidative stress and antioxidant biomarkers in clinical and experimental models of non-alcoholic fatty liver disease.</a> Medicina (Kaunas). 55 (2), 26 (2019).</li><li>Paradies, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M., Petrosillo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+cardiolipin+and+mitochondrial+dysfunction+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Oxidative stress, cardiolipin and mitochondrial dysfunction in nonalcoholic fatty liver disease.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (39), 14205-14218 (2014).</li><li>Aravinthan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+senescence+predicts+progression+in+non-alcohol-related+fatty+liver+disease.">Hepatocyte senescence predicts progression in non-alcohol-related fatty liver disease.</a> Journal of Hepatology. 58 (3), 549-556 (2013).</li><li>Gomez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+hepatocellular+in+vitro+model+to+investigate+steatosis.">A human hepatocellular in vitro model to investigate steatosis.</a> Chemico Biological Interactions. 165 (2), 106-116 (2007).</li><li>Wu, W. K. K., Zhang, L., Chan, M. T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy,+NAFLD+and+NAFLD-related+HCC.">Autophagy, NAFLD and NAFLD-related HCC.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1061, 127-138 (2018).</li><li>Levy, G., Cohen, M., Nahmias, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+culture+models+of+hepatic+steatosis.">In vitro cell culture models of hepatic steatosis.</a> Methods in Molecular Biology. 1250, 377-390 (2015).</li><li>Kanuri, G., Bergheim, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+models+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease+(NAFLD).">In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).</a> International Journal of Molecular Science. 14 (6), 11963-11980 (2013).</li><li>Ricchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effect+of+oleic+and+palmitic+acid+on+lipid+accumulation+and+apoptosis+in+cultured+hepatocytes.">Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+biomarkers+of+de+novo+lipogenesis+fatty+acids+and+incident+heart+failure+in+older+adults:+The+cardiovascular+health+study.">Serial biomarkers of de novo lipogenesis fatty acids and incident heart failure in older adults: The cardiovascular health study.</a> Journal of the American Heart Association. 9 (4), 014119 (2020).</li><li>Alnahdi, A., John, A., Raza, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmentation+of+glucotoxicity,+oxidative+stress,+apoptosis+and+mitochondrial+dysfunction+in+Hepg2+cells+by+palmitic+acid.">Augmentation of glucotoxicity, oxidative stress, apoptosis and mitochondrial dysfunction in Hepg2 cells by palmitic acid.</a> Nutrients. 11 (9), 1979 (2019).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oleic+acid+protects+saturated+fatty+acid+mediated+lipotoxicity+in+hepatocytes+and+rat+of+non-alcoholic+steatohepatitis.">Oleic acid protects saturated fatty acid mediated lipotoxicity in hepatocytes and rat of non-alcoholic steatohepatitis.</a> Life Sciences. 203, 291-304 (2018).</li><li>Xing, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+inflammasome+mediate+palmitate-induced+endothelial+dysfunction.">NLRP3 inflammasome mediate palmitate-induced endothelial dysfunction.</a> Life Sciences. 239, 116882 (2019).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+Growth+Factor+Binding+Protein+7+accelerates+hepatic+steatosis+and+insulin+resistance+in+non-alcoholic+fatty+liver+disease.">Insulin-like Growth Factor Binding Protein 7 accelerates hepatic steatosis and insulin resistance in non-alcoholic fatty liver disease.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 46 (12), 1101-1110 (2019).</li><li>Wang, J., Hu, R., Yin, C., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tanshinone+IIA+reduces+palmitate-induced+apoptosis+via+inhibition+of+endoplasmic+reticulum+stress+in+Hepg2+liver+cells.">Tanshinone IIA reduces palmitate-induced apoptosis via inhibition of endoplasmic reticulum stress in Hepg2 liver cells.</a> Fundamental and Clinical Pharmacology. 34 (2), 249-262 (2020).</li><li>Xiao, Z., Chu, Y., Qin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGFBP5+modulates+lipid+metabolism+and+insulin+sensitivity+through+activating+ampk+pathway+in+non-alcoholic+fatty+liver+disease.">IGFBP5 modulates lipid metabolism and insulin sensitivity through activating ampk pathway in non-alcoholic fatty liver disease.</a> Life Sciences. 256, 117997 (2020).</li><li>Avila, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+effects+of+conjugated+linoleic+acid+(CLA)+on+inflammatory+functions+of+bovine+monocytes.">In vitro effects of conjugated linoleic acid (CLA) on inflammatory functions of bovine monocytes.</a> Journal of Dairy Science. 103 (9), 8554-8563 (2020).</li><li>Malhi, H., Bronk, S. F., Werneburg, N. W., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+fatty+acids+induce+JNK-dependent+hepatocyte+lipoapoptosis.">Free fatty acids induce JNK-dependent hepatocyte lipoapoptosis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 12093-12101 (2006).</li><li>Oh, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+palmitic+acid+on+TNF-alpha-induced+cytotoxicity+in+SK-Hep-1+cells.">Effects of palmitic acid on TNF-alpha-induced cytotoxicity in SK-Hep-1 cells.</a> Toxicology In Vitro: An International Journal Published in Association with BIBRA. 26 (6), 783-790 (2012).</li><li>Stellavato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assessment+of+nutraceutical+compounds+and+novel+nutraceutical+formulations+in+a+liver-steatosis-based+model.">In vitro assessment of nutraceutical compounds and novel nutraceutical formulations in a liver-steatosis-based model.</a> Lipids in Health and Disease. 17 (1), 24 (2018).</li><li>Pachikian, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+trans-11,+trans-13+conjugated+linoleic+acid+in+the+development+of+hepatic+steatosis.">Implication of trans-11, trans-13 conjugated linoleic acid in the development of hepatic steatosis.</a> PLoS One. 13 (2), 0192447 (2018).</li><li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyze.">Analyze.</a> ImageJ User Guide. , 132-135 (2012).</li><li>Geng, Y., Wu, Z., Buist-Homan, M., Blokzijl, H., Moshage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hesperetin+protects+against+palmitate-induced+cellular+toxicity+via+induction+of+GRP78+in+hepatocytes.">Hesperetin protects against palmitate-induced cellular toxicity via induction of GRP78 in hepatocytes.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. , 404 (2020).</li><li>Geng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+metformin+against+palmitate-induced+hepatic+cell+death.">Protective effect of metformin against palmitate-induced hepatic cell death.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1866 (3), 165621 (2020).</li><li>Sarnyai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cis-+and+trans-monounsaturated+fatty+acids+on+palmitate+toxicity+and+on+palmitate-induced+accumulation+of+ceramides+and+diglycerides.">Effect of cis- and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides.</a> International Journal of Molecular Science. 21 (7), 2626 (2020).</li><li>Chen, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrahydrocurcumin+ameliorates+free+fatty+acid-induced+hepatic+steatosis+and+improves+insulin+resistance+in+HepG2+cells.">Tetrahydrocurcumin ameliorates free fatty acid-induced hepatic steatosis and improves insulin resistance in HepG2 cells.</a> Journal of Food and Drug Analysis. 26 (3), 1075-1085 (2018).</li><li>Burhans, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+oleate+regulates+adipose+tissue+lipogenesis+and+fatty+acid+oxidation.">Hepatic oleate regulates adipose tissue lipogenesis and fatty acid oxidation.</a> Journal of Lipid Research. 56 (2), 304-318 (2015).</li><li>Abenavoli, L., Milanovic, M., Milic, N., Luzza, F., Giuffre, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olive+oil+antioxidants+and+non-alcoholic+fatty+liver+disease.">Olive oil antioxidants and non-alcoholic fatty liver disease.</a> Expert Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 13 (8), 739-749 (2019).</li><li>Nagarajan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+and+glucose+metabolism+in+hepatocyte+cell+lines+and+primary+mouse+hepatocytes:+A+comprehensive+resource+for+in+vitro+studies+of+hepatic+metabolism.">Lipid and glucose metabolism in hepatocyte cell lines and primary mouse hepatocytes: A comprehensive resource for in vitro studies of hepatic metabolism.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 316 (4), 578-589 (2019).</li><li>Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+composition+of+adipose+tissue+and+blood+in+humans+and+its+use+as+a+biomarker+of+dietary+intake.">Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake.</a> Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).</li></ol>

ويهدف هذا البروتوكول إلى توفير استراتيجية لدراسة steatosis في المختبر. زراعة الخلايا هي أداة قوية لدراسة الجوانب الخلوية والجزيئية والكيميائية الحيوية والسمية للخلايا المعرضة لظروف مختلفة. مع هذا النهج ، يمكن تصور الستاتوسيس ليس فقط كمرحلة من المرض المعقد الذي هو MAFLD ، ولكن أيضا كتعرض م?...

الكبد الدهني المرتبطة الخلل الأيضي هو منتشرة للغاية في جميع أنحاء العالم1,2; وتشير التقديرات إلى أن ما يصل إلى 25٪ من السكان يتأثرون3. هذا المرض المعروف سابقا باسم مرض الكبد الدهني غير الكحولية (NAFLD), وقد تم تحديث التسميات إلى الخلل الأيضي المرتبطة مرض الكبد الدهني (MAFLD) لتعكس بدقة الإمراض المتعلقة السمنة, مقاومة الأنسولين, مرض السكري من النوع 2, وعسر الهضم, فضلا عن التدليس المحتمل للمرض3,4.
بغض النظر عن الاسم ، يتضمن المرض طيفا واسعا من التغيرات النسيجية التي تتميز بتراكم الدهون المرتفع بشكل غير طبيعي في الكبد (>5٪ من الدهون في خلايا الكبد5)وقد يتطور من خلال تراكم الدهون الموجود عادة في الداء الدهني البسيط لالتهاب الكبد ، والذي بدوره قد يؤدي إلى تطور التليف وتليف الكبد ، سرطان الكبد، وفشل الكبد5،6،7،8. بسبب انتشاره المتزايد ، من المتوقع أن يصبح MAFLD أول مؤشر على زرع الكبد والسبب الرئيسي للورم الكبدي9.
على الرغم من أنه قد اعتبر شكل حميدة أو خفيفة من أمراض الكبد الدهنية, التهاب الكبد هو في الواقع مفتاح الأيض في MAFLD10. تتأثر مسارات التمثيل الغذائي المختلفة بتراكم الدهون في الكبد ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر تخليق الدهون ، والتصدير ، والتمثيل الغذائي10. مقاومة الأنسولين، والإجهاد التأكسدي، والإجهاد الشبكي، والخلل الخلوي ترتبط ارتباطا بقوة إلى السمية الدهنية الكبدية11،12. من ناحية أخرى، الخلايا الكبدية الدهنية هي هدف لأنواع الأكسجين التفاعلية، مما يجعل الأيض كما بيروكسيدات الدهون، كربونيل البروتين، والمواد الإضافية من الأحماض النووية13. على المستوى الخلوي، قد تتعرض خلايا الكبد الدهنية لتلف الميتوكوندريا14، الشيخوخة الخلوية15، موت الخلايا المبرمج16، الإصابة بالحمى12، و autophagia17، من بين أحداث أخرى.
خلايا الكبد هي المسؤولة للغاية عن التمثيل الغذائي، وإزالة السموم، وتوليف مجموعة واسعة من الجزيئات. قد يتعرض العديد من هذه الوظائف للخطر بسبب تراكم الدهون الملاحظ في الداء النتني. لذلك ، من الأهمية بمكان أن يكون لديك أدوات قابلة للاستنساخ تسمح بتقييم دقيق للداء النتن. وبهذا المعنى، فإن النماذج المختبرية قابلة للتطبيق بسهولة وقابلة للاستنساخ بدرجة كبيرة. وقد استخدمت Steatosis في المختبر مع أهداف مختلفة16،18،19. وتستخدم على نطاق واسع خلايا HepG2 كخط الخلية الكبدية. لديها مزايا مثل كونها سهلة الثقافة وتتميز بشكل جيد. ربما، العيب الوحيد لخلايا HepG2 هو حقيقة أنه خط خلايا مسرطنة، لذلك يجب النظر في هذا عند تحليل النتائج. هنا، يظهر تطبيق خليط من الأحماض الدهنية المستخدمة على نطاق واسع في زراعة الخلايا: حمض البالميتيك (PA) وحمض الأوليك (OA). كل من السلطة الفلسطينية وOA تقدم نتائج مختلفة في الثقافة20. السلطة الفلسطينية (C 16:0) هو الأحماض الدهنية المشبعة الأكثر شيوعا التي تم الحصول عليها من النظام الغذائي16. وتعتبر السلطة الفلسطينية باعتبارها علامة بيولوجية من دي نوفو lipogenesis، خطوة حاسمة في تطوير NAFLD21. السلطة الفلسطينية تبين أن تكون شديدة السمية22; لذلك ، قد لا يوصى بالحث على الداء النتني في المختبر. الزراعة العضوية (C 18:1) هو حمض دهني أحادي غير مشبع. على النقيض من السلطة الفلسطينية، وقد اقترح الزراعة العضوية لامتلاك خصائص مضادة للالتهابات ومضادة للأكسدة، والقدرة على مواجهة السلطة الفلسطينية12. كل من السلطة الفلسطينية وOA هي الأحماض الدهنية الرئيسية الموجودة في الدهون الثلاثية، بغض النظر عن حالة الصحة أو المرض16. يقدم الجدول 1 أمثلة على ثقافة خلايا الكبد مع السلطة الفلسطينية، الزراعة العضوية، وخليطها، فضلا عن النتائج المبلغ عنها12،23،24،25،26،27. كما تم استخدام الأحماض الدهنية الأخرى في زراعة الخلايا الكبدية، بما في ذلك حمض الستيريك (C 18:0)28،29،30، حمض اللينوليك (C 18:1)28،30،31 ومواكبته (CLA)28،32، حمض البالميتوليك (C 16:1)29. ومع ذلك ، يتم الإبلاغ عن استخدامها على الأقل في الأدب ، ربما لأن وفرة الكبد أقل من السلطة الفلسطينية وOA16.
بالتزامن, كل من الأحماض الدهنية تشبه steatosis في المختبر, توفير الخلايا المنتشرة, مع زيادة موت الخلايا وانخفاض الجدوى مقارنة مع ظروف السيطرة. ومن الجدير بالذكر أن الأملاح ذات الصلة من هذه الأحماض الدهنية متوفرة ويمكن استخدامها كذلك. واحدة من المشاكل الرئيسية عند تقييم الزائد الدهون في ثقافة خلايا الكبد تعطى في التفريق بين النماذج السمية ونموذج يمثل أفضل steatosis. يمكن حساب العديد من النماذج في الحالة الأولى. في الواقع ، يمكن اعتبار استخدام السلطة الفلسطينية وحدها من بينها ، وارتفاع معدل الوفيات هو النتيجة الأكثروضوحا 12،16،23،24،25،26،27. ويمكن أيضا استخدام جرعات عالية حتى في حالة الزراعة العضوية يمكن اعتبارها نموذجا toxicologic. البروتوكول المبين هنا هو في أعلى وفقا لتطوير steatosis لأنه يظهر انخفاض معدل الوفيات مقارنة مع تلك التي لوحظت في نماذج أخرى ويسمح لاتباعها خلال عدة أيام مع تراكم الدهون التدريجي كما يحدث في NAFLD. تعتبر إمكانية تقييم الداء النتني المعتدل والشاسي من خلال الحالات التجريبية ميزة أخرى.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>الأحماض الدهنية</td>
			<td colspan="2">شروط</td>
			<td colspan="2">نتائج</td>
			<td>مرجع</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">ابي</td>
			<td colspan="2">التركيز: 200 ميكرومتر</td>
			<td colspan="2">تراكم الدهون</td>
			<td rowspan="3">يان وآخرون، 201925.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">التعرض للوقت: 24 ساعة</td>
			<td colspan="2">تلف خلايا الكبد</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">ارتفاع ترانساميناس</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">ابي</td>
			<td colspan="2">التركيز: 50 و100 و200 ميكرومتر</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">تراكم الدهون</td>
			<td rowspan="2">شينغ وآخرون، 201924.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">التعرض للوقت: 24 ساعة</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">ابي</td>
			<td colspan="2">التركيز: 250 ميكرومتر، 500 ميكرومتر، 750 ميكرومتر و1000 ميكرومتر</td>
			<td colspan="2">تراكم الدهون</td>
			<td rowspan="2">وانغ وآخرون، 202026.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">التعرض للوقت: 24 ساعة</td>
			<td colspan="2">التخفيض التدريجي لاستدامة الخلية</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">مزيج من الزراعة العضوية / السلطة الفلسطينية</td>
			<td colspan="2">التركيز: 1m</td>
			<td colspan="2">تراكم الدهون</td>
			<td rowspan="3">شياو وآخرون، 202027.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">التعرض للوقت: 24 ساعة</td>
			<td colspan="2">لا يبلغ عن سمية الدهون</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">المعدل: 2OA:1PA</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">مزيج من الزراعة العضوية / السلطة الفلسطينية</td>
			<td colspan="2">التحفيز الأول مع 200 ميكرومتر و 400 ميكرومتر من السلطة الفلسطينية ثم التحفيز الثاني مع 200 ميكرومتر من الزراعة العضوية</td>
			<td colspan="2">تراكم الدهون.</td>
			<td rowspan="4">تسنغ وآخرون، 202012.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">التركيز: 400 ميكرومتر في السلطة الفلسطينية: 200 ميكرومتر الزراعة العضوية</td>
			<td colspan="2">تم تقليل الأدلة على السمية الدهنية الناجمة عن السلطة الفلسطينية عن طريق تحفيز الزراعة العضوية.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">المعدل: 2PA:1OA</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">التعرض للوقت: 24 ساعة</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">مزيج من الزراعة العضوية / السلطة الفلسطينية</td>
			<td colspan="2">التركيز: 400 ميكرومتر في السلطة الفلسطينية: 200 ميكرومتر الزراعة العضوية</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">تراكم الدهون</td>
			<td rowspan="3">تشن وآخرون، 201823.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">المعدل: 2PA:1OA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">التعرض للوقت: 24 ساعة</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">مزيج من الزراعة العضوية / السلطة الفلسطينية</td>
			<td colspan="2">التركيز :50 و 500 ميكرومتر</td>
			<td colspan="2">جيل من نوعين من steatosis: الداء النتن الخفيف و الداء النتني الحاد.</td>
			<td rowspan="3">كامبوس وغوزمان 2021</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">المعدل: 2PA:1OA</td>
			<td colspan="2">يحاكي المعرض المزمن من الزائد الدهون</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">التعرض للوقت: 24 ساعة، 2 أيام، 3 أيام و 4 أيام.</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1 - الجداول ثقافة الكبد في ظروف مستخية. يعرض الجدول نوع الأحماض الدهنية المستخدمة، والظروف التي تم الحفاظ عليها، والنتائج الملحوظة في زراعة خلايا الكبد. السلطة الفلسطينية: حمض البالميتيك. OA: حمض الأوليك.
وأخيرا، ينطبق هذا النموذج ليس فقط على دراسة داء الستاتوسيس والكبد الدهني، ولكن أيضا على مسارات التمثيل الغذائي الكبدي والاصطناعية وإزالة السموم في سياق داء الستاتوسيس. أيضا، قد يقدم الداء المستحث في المختبر دليلا لتحديد العلامات المحتملة للمرض وكذلك الأهداف العلاجية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>ESCO Airstream</td>
			<td>AC2-452+C2:C26</td>
			<td>Class II&#160;Type A2&#160;Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>430513</td>
			<td>&#160;Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 &#956;m, 500 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albimun (BSA)</td>
			<td>Gold Biotechnology, US</td>
			<td>A-421-10</td>
			<td>BSA Fatty Acid Free for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher-Gibco, US</td>
			<td>31800-022</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher-Gibco, US</td>
			<td>A4766801</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marienfeld, DE</td>
			<td>640010</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 cell line</td>
			<td>ATCC, US</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td>Hepatocellular carcinoma human cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator</td>
			<td>Thermo Electronic Corporation,US</td>
			<td>Model: 3110</td>
			<td>Temperature (37 &#176;C &#177; 1 &#176;C), humidity (90% &#177; 5%) , CO2 (5% &#177; 1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope Eclipse</td>
			<td>NIKON, JPN</td>
			<td>Model: TE2000-S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>I9030-4L</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O Kit</td>
			<td>Abcam, US</td>
			<td>ab150678</td>
			<td>Kit for histological visualization of neutral fat.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher-Gibco, US</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 &#956;g/mL Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Beckman, US</td>
			<td>Model: 360 PH/Temp/MV Meter</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>ThermoFisher-Gibco, US</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Sarstedt, AUS</td>
			<td>86.1253.001</td>
			<td>&#160;Non-pyrogenic, sterile, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Sarstedt, AUS</td>
			<td>&#160;86.1254.001</td>
			<td>&#160;Non-pyrogenic, sterile, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>S5761-1KG</td>
			<td>Preparation of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium oleate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, US</td>
			<td>sc-215879A</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium palmitate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, US</td>
			<td>sc-215881</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syring filter</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>431219</td>
			<td>&#160;Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 &#956;m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>T6146-25G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>25-052-Cl</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well cell culture cluster</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>3524</td>
			<td>Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well cell culture cluster</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>3599</td>
			<td>Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium

مرض الكبد الدهني المرتبط بالخلل الأيضي (MAFLD)، المعروف سابقا باسم مرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD)، هو مرض الكبد الأكثر انتشارا في جميع أنحاء العالم بسبب علاقته بالسمنة والسكري من النوع 2 وعسر الهضم. التهاب الكبد، تراكم قطرات الدهون في فترة الإصابة بسمة الكبد، هو سمة رئيسية من سمات المرض الذي يسبق الالتهاب الملاحظ في التهاب الكبد والتليف وأمراض الكبد في المرحلة النهائية. تراكم الدهون في خلايا الكبد قد تتداخل مع التمثيل الغذائي السليم للزينوبيولوجيات والجزيئات الذاتية، وكذلك للحث على العمليات الخلوية مما يؤدي إلى تقدم المرض. على الرغم من أن الدراسة التجريبية للداء الكبدي يمكن إجراؤها في الجسم الحي، إلا أن النهج المختبرية لدراسة الداء النتني هي أدوات تكميلية ذات مزايا مختلفة. ثقافة الكبد في الدهون الزائد مشروطة المتوسطة هو خيار استنساخ ممتازة لدراسة steatosis الكبدي السماح بتحديد العمليات الخلوية المتعلقة تراكم الدهون، مثل الضغوط التأكسدية والريبلتية، autophagia، والانتشار، وموت الخلايا، الخ، فضلا عن غيرها من الاختبارات بما في ذلك فعالية المخدرات، والاختبار السمية، من بين العديد من التطبيقات المحتملة الأخرى. هنا ، كان يهدف إلى وصف منهجية زراعة خلايا الكبد في المتوسطة الدهنية ذات الحالة الزائدة. تم استزراع خلايا HepG2 في RMPI 1640 متوسطة مكيفة مع بالميتات الصوديوم وأوليت الصوديوم. الأهم من ذلك، فإن نسبة هذه الدهون اثنين أمر بالغ الأهمية لصالح تراكم قطرات الدهون، مع الحفاظ على انتشار الخلايا ومعدل وفيات معتدل، كما يحدث في الكبد أثناء المرض. تظهر المنهجية ، من إعداد مخزون محلول الدهون ، والخليط ، بالإضافة إلى الوسط ، وثقافة خلايا الكبد. مع هذا النهج، فمن الممكن لتحديد قطرات الدهون في خلايا الكبد التي يمكن ملاحظتها بسهولة عن طريق النفط الأحمر O تلطيخ، فضلا عن منحنيات معدلات الانتشار / الوفيات.

خلايا الكبد المستزرعة في نمو العرض المتوسط الستاتيوجينيك في جميع أنحاء سطح البئر؛ ومع ذلك، تظهر خلايا الكبد الدهنية انخفاض معدل النمو مقارنة مع الخلايا المستزرعة في وسيطة التحكم. النسبة المقترحة وتركيز الزراعة العضوية والسلطة الفلسطينية، وضمان بقاء الخلية أثناء الثقافة. البذر 1 × 105</s...

Watch this Scientific Journal Video about A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium at JoVE.com

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

ويهدف هذا البروتوكول إلى أن يكون أداة لدراسة steatosis والجزيئية والبيوكيميائية والتغيرات الخلوية التي تنتجها أكثر من التعرض للخلايا الكبدية إلى الدهون في المختبر.

نموذج من Steatosis التجريبية في المختبر: ثقافة الخلية الكبدية في الدهون الزائد مشروط المتوسطة

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver ...

ينطبق هذا البروتوكول على دراسة داء الكبد وكذلك على مسارات الكبد والأيض والاصطناعية والتحميض في سياق داء الستاتوسيس. والمزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي إمكانية إعادة إنتاجها والوقت القصير اللازم للحصول على نتائج. إضافة في حقيقة أنه يقدم مستويين من steatosis، خفيفة، وشديدة.قد يوفر داء الستاتوسيس المستحث في المختبر دليلا لتحديد العلامات المحتملة لتشخيص المرض ، وكذلك الأهداف العلاجية. والمقصود من هذا الأسلوب ليتم تطبيقها في نتيجة steatosis. ومع ذلك، يمكن تعديله إلى مجموعة واسعة من الخلايا المختلفة المتضررة من الإفراط في التعرض للدهون، كما هو الحال أثناء السمنة والدهون.إعداد معيار RPMI 1640. ملحق RPMI 1640 ثقافة المتوسطة مع 10٪ من الحرارة تفعيلها FBS، و 1٪ من محلول العقدية البنسلين. تعقيمه باستخدام مرشحات 0.22 ميكرومتر وتخزين الملحق في أربع درجات مئوية.لإعداد محلول مخزون بالميتات إعداد حل 50 ملليمولار من البالميتات في RPMI 1640 القياسية تكملها مع 1٪ من BSA خالية من الدهون. تعقيم حوالي خمسة إلى عشرة ملليلترات من محلول المخزون باستخدام مرشحات 0.22 ميكرومتر وتخزينها في أربع درجات مئوية محمية من الضوء لمدة تصل إلى شهر واحد. لإعداد حل مخزون oleate تحضير حل 50 ملليمولار من oleate في RPMI 1640 المكمل.وتعقيم محلول المخزون باستخدام مرشحات 0.22 ميكرومتر. تخزينه في ناقص 20 درجة مئوية، محمية من الضوء لمدة تصل إلى شهر واحد. لإعداد المتوسطة steatogenic من المخزونات المعدة سابقا، وإعداد 100 ملليمتر من مزيج 50 ميكرومولار من جزء واحد بالميتات واثنين من أوليات جزء.لمستويات خفيفة، صب مزيج 500 ميكرومولار من جزء واحد بالميتات واثنين من أوليات جزء لمستويات شديدة في معيار RPMI 1640. وتعقيم باستخدام مرشحات 0.22 ميكرومتر. يخزن عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.بدلا من ذلك، لإعداد حلول الأسهم مع الأحماض الدهنية المعنية باستخدام الزلال الدهون الحرة، حل إما بالميتات أو الأوليات في اثنين من ملليلتر من الإيثانول المطلق ومن ثم مزيج في الحجم النهائي من RPMI القياسية 1640. حل oleate مباشرة عن طريق تخزين في معيار RPMI 1640 ثقافة المتوسطة. السماح بتبخر الإيثانول عن طريق احتضان في حمام مائي في 70 درجة مئوية وتخلط جيدا.قم بتعقيم كل من حلول المخزون باستخدام مرشحات 0.22 ميكرومتر وتخزين محلول مخزون البالميتات عند أربع درجات مئوية. وحل مخزون الأوليات عند ناقص 20 درجة مئوية. مقعد 0.1 مليون خلايا Hep G2 لكل بئر في لوحة 24 جيدا.إضافة ملليلتر واحد من RPMI القياسية 1640. قبل الحضانة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة، مما يسمح بتعلق الخلية. بعد الثقافة المسبقة، تجاهل المتوسط RPMI 1640 القياسية.وإضافة الوسط السخونة. تجاهل supernatant وإضافة وسيطة steatogenic الطازجة كل 24 ساعة. لإجراء تقييم الجدوى والمورفولوجيا، تجاهل الخلايا الفائقة وفصل من البئر بإضافة 500 ميكرولتر من 0.05٪ تريبسين EDTA.احتضان لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. جمع الخلايا التي أعيد إنفاقها في أنبوب صغير. والطرد المركزي في 300 مرة G.Then تجاهل supernatant، إضافة 200 ميكرولتر من RPMI القياسية 1640، وإعادة إنفاق الخلايا.إضافة 15 ميكرولتر من 0.4٪ من الحل الأزرق تريبان في أنبوب صغير الطازجة. إضافة وخلط 15 ميكرولتر من تعليق الخلية السابقة. عد الخلايا الملطخة وغير الملطخة في مقياس الدم وحساب معدلات البقاء والوفيات.ضع غطاء ثقافة الخلية في كل بئر في لوحة من 24 بئرا وخلايا Hep G2 كما هو موضح في المخطوطة النصية. بعد الحضانة المناسبة، اغسل الخلايا بميليلتر واحد من برنامج تلفزيوني وتخلص من الناشرة الفائقة. مزجها مع ملليلتر واحد من 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.تجاهل paraformaldehyde الزائدة وشطف الخلايا مع ملليلتر واحد من الماء المقطر. ثم أضف ملليلتر واحد من 70٪ ايزوبروبانول واحتضان لمدة خمس دقائق. تجاهل الأيزوبروبانول الزائد وإضافة ملليلتر واحد من محلول الزيت والأحمر O واحتضان لمدة 30 دقيقة.تجاهل محلول الزيت الأحمر الزائد، ثم اشطفه بميليلتر واحد من الماء المقطر. مراقبة الخلايا تحت المجهر في التكبير من 400x. اختيار والتقاط الصور عشوائيا من 10 حقول بصرية من منطقة كاملة من البئر.كرر التصوير لكل بئر. لتقييم النسبة المئوية للمساحة الحمراء الملطخة، افتح برنامج ImageJ واستورد الملفات المطلوبة، ثم انقر على ضبط واستخدام عتبة اللون" أداة، وتحديد المعلمة هوى للكشف عن اللون الأحمر. ثم ضبط التشبع والسطوع للصورة.قارن المنطقة الملطخة مع المساحة الكاملة للحقل البصري ، وذلك باستخدام أداة تحليل الجسيمات "وحساب متوسط النسبة المئوية لكل بئر. الجلوس 0.1 مليون خلايا الكبد لكل بئر في لوحات 24 بئر يوفر التقاء الأمثل. تضاءلت الجدوى تدريجيا مع زيادة وقت الثقافة ، لتصل إلى أدنى مستوى لها وهو 60٪ في أربعة أيام في حالة الإصابة بالداء النتني الشديد.وبناء على ذلك، كان معدل الوفيات أعلى في خلايا الكبد المستزرعة في الظروف السمية. وازداد تدريجيا مع وقت التعرض للدهون. وازدادت أعداد الخلايا تدريجيا نتيجة للانتشار.ومع ذلك، كان معدل الانتشار أقل في الداء النتني المعتدل في ثلاثة وأربعة أيام. وعلى النقيض من ذلك، ارتبط الداء النتني الحاد بانخفاض الانتشار بمقدار 24 ساعة. أظهرت خلايا تلطيخ مع النفط الأحمر O زيادة مرتين على الأقل من قطرات الدهون في الخلايا المستزرعة في ظل ظروف steatogenic.زادت الدهون داخل الخلايا وفقا لوقت التعرض للثقافة في الوسط ال steatogenic. في الداء النتني الخفيف ، تم زيادة محتويات الدهون من اليوم الثاني ، في حين أنها كانت عالية بشكل كبير في حالة الداء الدهني الحاد بدءا من 24 ساعة. تتطلب ثقافة الخلية خبرة سابقة.يمكن أن يكون زراعة خلايا Hep G2 في حالة قياسية قبل استخدام هذا البروتوكول مفيدا. إعداد مخزون الأحماض الدهنية هو أيضا نقطة حاسمة. حمض بالميتيك صلب في درجة حرارة الغرفة، ويحتاج إلى تسخينه قبل إدارته.وينبغي أن تسمح هذه الطريقة التحليل الجزيئي للمسارات المختلفة، بما في ذلك، على سبيل المثال لا الحصر، الانتشار، موت الخلايا المبرمج، الأوتوفاجيا، الإجهاد التأكسدي والتحليل الدوائي والسموم.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

متعدد الفوتون التصوير من غزو خلايا الورم في الفأر نموذج مثلي الفم سرطان الخلايا الحرشفية

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

زرع الخلايا الجذعية في في المختبر مقلد نقص التروية / إعادة إشباع الخلايا النموذجي

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

تقييم التغييرات المشوهة في نموذج الزرد من التعرض الكحول الجنينية

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

في الفحص المختبري التخليص الظهارية النماذج أن الخطوات في وقت مبكر من الإنبثاث سرطان المبيض

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

excitotoxic المواد تحفيز الدماغ باعتبارها Microslices<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من السكتة الدماغية

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

العصبية زرع الخلايا الجذعية في التجريبية Contusive نموذج من إصابة الحبل الشوكي

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

تحليل الأمثل ل<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; كبدي تشحم

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

استخدام في المختبر خلية يعيش التصوير لاستكشاف تشريعات تسليمها بالقاعدة الدهنية جسيمات نانوية

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

A Cell Culture Model of Resistance Arteries

نموذج خلية ثقافة مقاومة الشرايين

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and ...

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

تشريح وثقافة Explant موريني Allantois للتحليل في المختبر للحجز الانتويك

The placenta is essential for the growth and development of mammalian embryos. For this reason, numerous genetic alterations and likely also environmental ...