Name: a model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium
Uploaded: 2021-05-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt, CB-221137) finanziert. Adriana Campos ist Doktorandin am Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, und wurde von Conacyt (CVU: 1002502) unterstützt.

1. Standard- und Konditionsmedienvorbereitung
<ol><li>Um Standard-RPMI 1640 herzustellen, ergänzen Sie RPMI 1640-Kulturmedium mit 10% (v / v) fetalem Rinderserum (FBS, zuvor hitzeinaktiviert) und 1% (v / v) Penicillin-Streptomycin-Lösung. Lagern Sie das Medium bei 4 °C.Sterilisieren Sie es mit 0,22 μm Filtern.</li>
	<li>Um Palmitat-Stammlösung herzustellen, bereiten Sie eine 50 mM Palmitatlösung im Standard RPMI 1640 vor, die zuvor mit 1% Rinderserumalbumin (lipidfrei) ergänzt wurde. Ein Volumen von 5-10 ml dies...

<ol>
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Dieses Protokoll soll eine Strategie zur Untersuchung der Steatose in vitroliefern. Zellkultur ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um zelluläre, molekulare, biochemische und toxikologische Aspekte der Zellen zu untersuchen, die verschiedenen Bedingungen ausgesetzt sind. Mit diesem Ansatz kann die Steatose nicht nur als ein Stadium der komplexen Krankheit, die MAFLD ist, visualisiert werden, sondern auch als die Überexposition der Hepatozyten gegenüber Lipiden und die möglichen Ergebnisse, die sich aus einer ...

Fettleber im Zusammenhang mit metabolischen Dysfunktion ist weltweit weit verbreitet1,2; Es wird geschätzt, dass bis zu 25% der Bevölkerung betroffen sind3. Diese Krankheit, die früher als nichtalkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) bekannt war, hat ihre Nomenklatur für metabolische Dysfunktion assoziierte Fettlebererkrankung (MAFLD) aktualisiert, um die Pathogenese im Zusammenhang mit Fettleibigkeit, Insulinresistenz, Diabetes Typ 2 und Dyslipidämie sowie die möglichen Behandlungen der Krankheit3,4 genau widerzuspiegeln.
Unabhängig vom Namen umfasst die Krankheit ein breites Spektrum histopathologischer Veränderungen, die durch eine ungewöhnlich hohe Ansammlung von Lipiden in der Leber gekennzeichnet sind (>5% des Fettes in den Hepatozyten5)und kann durch die Lipidakkumulation fortschreiten, die typischerweise bei einfacher Steatose bis Steatohepatitis vorkommt, was wiederum zur Entwicklung von Fibrose, Zirrhose führen kann. hepatozelluläres Karzinom und Leberversagen5,6,7,8. Aufgrund seiner zunehmenden Prävalenz wird erwartet, dass MAFLD der erste Hinweis auf eine Lebertransplantation und die Hauptursache für das hepatozelluläre Karzinom wird9.
Obwohl es als eine gutartige oder milde Form der Fettlebererkrankung angesehen wurde, ist die Lebersteatose tatsächlich der metabolische Schlüssel in MAFLD10. Verschiedene Stoffwechselwege werden durch die Lipidakkumulation in der Leber beeinflusst, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Lipidsynthese, Export und Stoffwechsel10. Insulinresistenz, oxidativer Stress, retikulärer Stress und zelluläre Dysfunktion sind stark mit der hepatischen Lipotoxizität verbunden11,12. Auf der anderen Seite sind Fetthepatozyten das Ziel reaktiver Sauerstoffspezies, die Metaboliten wie Lipidperoxide, Proteincarbonyle und Addukte von Nukleinsäuren13abgeben. Auf zellulärer Ebene können Fetthepatozyten unter anderem mitochondriale Schäden14, zelluläre Seneszenz15, Apoptose16, Pyroptose12und Autophagie17erleiden.
Hepatozyten sind in hohem Maße für den Stoffwechsel, die Entgiftung und die Synthese einer Vielzahl von Molekülen verantwortlich. Viele dieser Funktionen könnten durch die bei der Steatose beobachtete Lipidakkumulation beeinträchtigt werden. Daher ist es von großer Bedeutung, über reproduzierbare Werkzeuge zu verfügen, die eine genaue Beurteilung der Steatose ermöglichen. In diesem Sinne sind In-vitro-Modelle leicht anwendbar und hochgradig reproduzierbar. Steatose in vitro wurde mit verschiedenen Zielen16,18,19verwendet. Die HepG2-Zellen sind als Hepatozytenzelllinie weit verbreitet. Es hat Vorteile wie einfach zu kulturieren und gut charakterisiert. Vielleicht ist der einzige Nachteil von HepG2-Zellen die Tatsache, dass es sich um eine krebserregende Zelllinie handelt, so dass dies bei der Analyse der Ergebnisse berücksichtigt werden muss. Hier wird die Anwendung einer mischung von Fettsäuren gezeigt, die in der Zellkultur weit verbreitet sind: Palmitinsäure (PA) und Ölsäure (OA). Sowohl PA als auch OA bieten unterschiedliche Ergebnisse in Kultur20. PA (C 16:0) ist die häufigste gesättigte Fettsäure, die aus der Nahrung gewonnen wird16. PA gilt als Biomarker der De-novo-Lipogenese, einem entscheidenden Schritt in der Entwicklung von NAFLD21. PA erweist sich als hochgiftig22; Daher wird es möglicherweise nicht empfohlen, Eine Steatose in vitro zu induzieren. OA (C 18:1) ist eine einfach ungesättigte Fettsäure. Im Gegensatz zu PA wurde vermutet, dass OA entzündungshemmende und antioxidative Eigenschaften besitzt, die PA12entgegenwirken können. Sowohl PA als auch OA sind die Hauptfettsäuren, die in den Triglyceriden vorhanden sind, unabhängig vom Gesundheitszustand oder der Krankheit16. Tabelle 1 enthält Beispiele für die Hepatozytenkultur mit PA, OA und deren Mischung sowie die berichteten Endpunkte12,23,24,25,26,27. Andere Fettsäuren wurden auch in der Hepatozytenkultur verwendet, einschließlich Stearinsäure (C 18:0)28,29,30, Linolsäure (C 18: 1)28,30,31 und ihre Konjugate (CLA)28,32, Palmitoleinsäure (C 16: 1)29. Ihre Verwendung wird jedoch in der Literatur am seltensten berichtet, vielleicht weil ihre Leberhäufigkeit niedriger ist als PA und OA16.
In Verbindung damit ähneln beide Fettsäuren der Steatose in vitround bieten proliferierende Zellen mit erhöhtem Zelltod und geringerer Lebensfähigkeit im Vergleich zu Kontrollbedingungen. Erwähnenswert ist, dass die jeweiligen Salze dieser Fettsäuren vorhanden sind und ebenfalls verwendet werden können. Eines der Hauptprobleme bei der Beurteilung der Lipidüberlastung in hepatozytenzelliger Zellkultur liegt in der Unterscheidung zwischen toxikologischen Modellen und einem Modell, das die Steatose am besten darstellt. Viele Modelle können im ersten Fall berücksichtigt werden. In der Tat könnte die Verwendung von PA allein unter ihnen in Betracht gezogen werden, und die hohe Mortalität ist das offensichtlichste Ergebnis12,16,23,24,25,26,27. Die Verwendung hoher Dosen auch bei OA kann auch als toxikologisches Modell betrachtet werden. Das hier gezeigte Protokoll entspricht höher der Steatoseentwicklung, da es im Vergleich zu anderen Modellen eine niedrige Mortalität aufweist und es ermöglicht, es über mehrere Tage mit progressiver Lipidakkumulation zu befolgen, wie es bei NAFLD auftritt. Die Möglichkeit, eine leichte und schwere Steatose unter experimentellen Bedingungen zu beurteilen, gilt als weiterer Vorteil.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Fettsäure</td>
			<td colspan="2">Bedingungen</td>
			<td colspan="2">Ergebnisse</td>
			<td>Referenz</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">PAPA</td>
			<td colspan="2">Konzentration: 200 μM</td>
			<td colspan="2">Lipidakkumulation</td>
			<td rowspan="3">Yan et al, 201925.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Belichtungszeit: 24 h</td>
			<td colspan="2">Hepatozytenschäden</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">Erhöhung der Transaminasen</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">PAPA</td>
			<td colspan="2">Konzentration: 50, 100 und 200 μM</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Lipidakkumulation</td>
			<td rowspan="2">Xing et al,201924.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Belichtungszeit: 24 h</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">PAPA</td>
			<td colspan="2">Konzentration: 250 μM, 500 μM, 750 μM und 1.000 μM</td>
			<td colspan="2">Lipidakkumulation</td>
			<td rowspan="2">Wang et al, 202026.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Belichtungszeit: 24 h</td>
			<td colspan="2">Progressive Verringerung der Zelllebensfähigkeit</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Mix aus OA/PA</td>
			<td colspan="2">Konzentration: 1 mM</td>
			<td colspan="2">Lipidakkumulation</td>
			<td rowspan="3">Xiao et al, 202027.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Belichtungszeit: 24 h</td>
			<td colspan="2">Meldet keine Lipotoxizität</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Preis: 2OA:1PA</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Mix aus OA/PA</td>
			<td colspan="2">Erste Stimulation mit 200 μM und 400 μM PA und dann zweite Stimulation mit 200 μM OA</td>
			<td colspan="2">Lipidakkumulation.</td>
			<td rowspan="4">Zeng et al,202012.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Konzentration:400 μM PA: 200 μM OA</td>
			<td colspan="2">Der Nachweis einer durch PA induzierten Lipotoxizität wurde durch Stimulation von OA reduziert.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Preis: 2PA:1OA</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Belichtungszeit: 24 h</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Mix aus OA/PA</td>
			<td colspan="2">Konzentration: 400 μM PA: 200 μM OA</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Lipidakkumulation</td>
			<td rowspan="3">Chen et al, 201823.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Preis: 2PA:1OA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Belichtungszeit: 24 h</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Mix aus OA/PA</td>
			<td colspan="2">Konzentration:50 und 500 μM</td>
			<td colspan="2">Erzeugung von zwei Arten von Steatose: leichte Steatose und schwere Steatose.</td>
			<td rowspan="3">Campos und Guzmán 2021</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Preis: 2PA:1OA</td>
			<td colspan="2">Simuliert chronische Exposition von Lipidüberlastung</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Zeit Exposition: 24 h, 2 Tage, 3 Tage und 4 Tage.</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Hepatozytenkultur unter steatogenen Bedingungen. Die Tabelle zeigt die Art der verwendeten Fettsäure, die Bedingungen und die beobachteten Ergebnisse in der Hepatozytenkultur. PA: Palmitinsäure. OA: Ölsäure.
Schließlich ist dieses Modell nicht nur auf die Untersuchung von Steatose und Fettleber anwendbar, sondern auch auf die hepatischen Stoffwechsel-, Synthese- und Entgiftungswege im Zusammenhang mit Steatose. Auch die in vitro induzierte Steatose könnte Hinweise auf die Identifizierung potenzieller Marker der Krankheit sowie therapeutischer Ziele liefern.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>ESCO Airstream</td>
			<td>AC2-452+C2:C26</td>
			<td>Class II&#160;Type A2&#160;Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>430513</td>
			<td>&#160;Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 &#956;m, 500 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albimun (BSA)</td>
			<td>Gold Biotechnology, US</td>
			<td>A-421-10</td>
			<td>BSA Fatty Acid Free for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher-Gibco, US</td>
			<td>31800-022</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher-Gibco, US</td>
			<td>A4766801</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marienfeld, DE</td>
			<td>640010</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 cell line</td>
			<td>ATCC, US</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td>Hepatocellular carcinoma human cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator</td>
			<td>Thermo Electronic Corporation,US</td>
			<td>Model: 3110</td>
			<td>Temperature (37 &#176;C &#177; 1 &#176;C), humidity (90% &#177; 5%) , CO2 (5% &#177; 1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope Eclipse</td>
			<td>NIKON, JPN</td>
			<td>Model: TE2000-S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>I9030-4L</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O Kit</td>
			<td>Abcam, US</td>
			<td>ab150678</td>
			<td>Kit for histological visualization of neutral fat.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher-Gibco, US</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 &#956;g/mL Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Beckman, US</td>
			<td>Model: 360 PH/Temp/MV Meter</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>ThermoFisher-Gibco, US</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Sarstedt, AUS</td>
			<td>86.1253.001</td>
			<td>&#160;Non-pyrogenic, sterile, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Sarstedt, AUS</td>
			<td>&#160;86.1254.001</td>
			<td>&#160;Non-pyrogenic, sterile, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>S5761-1KG</td>
			<td>Preparation of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium oleate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, US</td>
			<td>sc-215879A</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium palmitate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, US</td>
			<td>sc-215881</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syring filter</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>431219</td>
			<td>&#160;Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 &#956;m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>T6146-25G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>25-052-Cl</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well cell culture cluster</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>3524</td>
			<td>Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well cell culture cluster</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>3599</td>
			<td>Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium

Die metabolische Dysfunktion-assoziierte Fettlebererkrankung (MAFLD), früher bekannt als nichtalkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD), ist aufgrund ihrer Beziehung zu Fettleibigkeit, Diabetes Typ 2 und Dyslipidämie die weltweit häufigste Lebererkrankung. Lebersteatose, die Ansammlung von Lipidtröpfchen im Leberparenchym, ist ein Schlüsselmerkmal der Krankheit, die der Entzündung vorausgeht, die bei Steatohepatitis, Fibrose und Lebererkrankungen im Endstadium beobachtet wird. Die Ansammlung von Lipiden in Hepatozyten könnte den ordnungsgemäßen Stoffwechsel von Xenobiotika und endogenen Molekülen stören und zelluläre Prozesse induzieren, die zum Fortbekommen der Krankheit führen. Obwohl die experimentelle Untersuchung der Steatose in vivodurchgeführt werden kann, sind In-vitro-Ansätze zur Untersuchung der Steatose komplementäre Werkzeuge mit unterschiedlichen Vorteilen. Die Hepatozytenkultur in lipidüberladenem Medium ist eine ausgezeichnete reproduzierbare Option für die Untersuchung der Lebersteatose, die die Identifizierung zellulärer Prozesse im Zusammenhang mit der Lipidakkumulation wie oxidative und retikuläre Belastungen, Autophagie, Proliferation, Zelltod usw. sowie andere Tests einschließlich Arzneimittelwirksamkeit und toxikologische Tests unter vielen anderen möglichen Anwendungen ermöglicht. Hier sollte die Methodik der Hepatozytenzellkultur in lipidüberladenem Medium beschrieben werden. HepG2-Zellen wurden in RMPI 1640-Medium kultiviert, das mit Natriumpalmitat und Natriumoleat konditioniert war. Wichtig ist, dass das Verhältnis dieser beiden Lipide entscheidend ist, um die Ansammlung von Lipidtröpfchen zu begünstigen, während die Zellproliferation und eine moderate Sterblichkeitsrate, wie sie während der Krankheit in der Leber auftritt, aufrechterhalten werden. Die Methodik, von der Herstellung der Lipidlösungsvorräte, Mischung, Zugabe zum Medium und Hepatozytenkultur wird gezeigt. Mit diesem Ansatz ist es möglich, Lipidtröpfchen in den Hepatozyten zu identifizieren, die durch Ölrot-O-Färbung leicht beobachtbar sind, sowie Kurven der Proliferations- / Mortalitätsraten.

Hepatozyten, die im steatogenen Medium kultiviert werden, zeigen Wachstum auf der gesamten Oberfläche des Brunnens; Fetthepatozyten zeigen jedoch eine geringere Wachstumsrate im Vergleich zu Zellen, die im Kontrollmedium kultiviert werden. Das vorgeschlagene Verhältnis und die Konzentration von OA und PA garantieren das Überleben der Zellen während der Kultur. Die Aussaat von 1 x10 5 Zellen pro Vertiefung in 24-Well-Platten sorgt für eine optimale Konfluenz, wie in Abbildung 1</strong...

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A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

Dieses Protokoll soll ein Werkzeug sein, um Steatose und die molekularen, biochemischen, zellulären Veränderungen zu untersuchen, die durch die übermäßige Exposition von Hepatozyten gegenüber Lipiden in vitroverursacht werden.

Ein Modell der experimentellen Steatose in vitro: Hepatozytenzellkultur in lipidüberlastetem Medium

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver ...

Dieses Protokoll ist anwendbar auf die Untersuchung der Lebersteatose sowie auf die leberischen, metabolischen, synthetischen und toxifizierungswege im Zusammenhang mit Steatose. Die Hauptvorteile dieser Methode sind ihre Reproduzierbarkeit und die kurze Zeit, die benötigt wird, um Ergebnisse zu erzielen. Fügen Sie hinzu, dass es zwei Ebenen der Steatose bietet, mild und schwer.In-vitro-induzierte Steatose könnte Hinweise auf die Identifizierung potenzieller Marker für die Diagnose der Krankheit sowie therapeutischer Ziele liefern. Diese Methode soll im Steatoseergebnis angewendet werden. Es kann jedoch an eine Vielzahl verschiedener Zellen angepasst werden, die von Lipidüberbelichtungen betroffen sind, z. B. bei Fettleibigkeit und Lipidämie.Bereiten Sie standard rpmI 1640 vor. Ergänzen Sie RPMI 1640 Kulturmedium mit 10% wärmeaktiviertem FBS und 1% Penicillin Streptomycinlösung. Sterilisieren Sie es mit 0,22-Mikrometer-Filtern und lagern Sie das Supplement bei vier Grad Celsius.Zur Herstellung einer Palmitat-Stammlösung ist eine 50-Millimolar-Palmitatlösung im Standard RPMI 1640 mit 1% lipidfreiem BSA zuzubereiten. Mit 0,22-Mikrometer-Filtern etwa fünf bis zehn Milliliter der Stammlösung sterilisieren und bei vier Grad Celsius lichtgeschützt bis zu einem Monat lagern. Zur Herstellung der Oleat-Stammlösung wird eine 50-Millimolar-Oleatlösung im ergänzten RPMI 1640 vorbereitet.Und sterilisieren Sie die Stammlösung mit 0,22-Mikrometer-Filtern. Lagern Sie es bei minus 20 Grad Celsius, geschützt vor Licht für bis zu einem Monat. Um steatogenes Medium aus den zuvor vorbereiteten Beständen herzustellen, bereiten Sie 100 Millimeter einer 50-mikromolaren Mischung aus einem Teil Palmitat und zwei Teilen Oleat vor.Für milde Niveaus gießen Sie eine 500-Mikromolar-Mischung aus einem Teil Palmitat und zweiTeil Oleat für schwere Konzentrationen in Standard-RPMI 1640. Und sterilisieren Sie mit 0,22-Mikrometer-Filtern. Bis zu einer Woche bei vier Grad Celsius lagern.Alternativ können Sie zur Herstellung von Stammlösungen mit den jeweiligen Fettsäuren unter Verwendung von freiem Lipidalbumin entweder Palmitat oder Oleat in zwei Millilitern absolutem Ethanol auflösen und dann das Endvolumen von Standard-RPMI 1640 mischen. Oleat direkt durch Lagerung in Standard-RPMI 1640-Kulturmedium auflösen. Ethanol durch Inkubation in einem Wasserbad bei 70 Grad Celsius verdampfen lassen und gründlich mischen.Sterilisieren Sie beide Stammlösungen mit 0,22-Mikrometer-Filtern und lagern Sie die Palmitat-Stammlösung bei vier Grad Celsius. Und Oleat-Stammlösung bei minus 20 Grad Celsius. Platz 0,1 Millionen Hep G2 Zellen pro Vertiefung in einer 24-Well-Platte.Fügen Sie einen Milliliter Standard-RPMI 1640 hinzu. Bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 24 Stunden vorinkubieren, um die Zellanhaftung zu ermöglichen. Verwerfen Sie nach der Vorkultur das Standardmedium RPMI 1640.Und fügen Sie das steatogene Medium hinzu. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie alle 24 Stunden ein frisches steatogenes Medium hinzu. Um die Lebensfähigkeit und Morphologie zu bewerten, verwerfen Sie den Überstand und lösen Sie die Zellen aus dem Bohrplatz, indem Sie 500 Mikroliter von 0,05% Trypsin EDTA hinzufügen.Fünf Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren. Sammeln Sie die resuspendierten Zellen in einem Mikroröhrchen. Und Zentrifuge bei 300-fach G.Dann verwerfen Sie den Überstand, fügen Sie 200 Mikroliter Standard-RPMI 1640 hinzu und resuspendieren Sie die Zellen.Fügen Sie 15 Mikroliter von 0,4% Trypanblaulösung in eine frische Mikroröhre hinzu. Fügen Sie 15 Mikroliter der vorherigen Zellsuspension hinzu und mischen Sie sie. Zählen Sie die gefärbten und nicht gefärbten Zellen in einem Hämozytometer und berechnen Sie die Lebensfähigkeit und Mortalitätsraten.Legen Sie in jede Vertiefung eine Zellkulturabdeckung in eine 24-Well-Platte und samen Sie Hep G2-Zellen, wie im Textmanuskript beschrieben. Nach der entsprechenden Inkubation die Zellen mit einem Milliliter PBS waschen und den Überstand entsorgen. Mischen Sie sie mit einem Milliliter 4% Paraformaldehyd in PBS und inkubieren Sie sie eine Stunde bei Raumtemperatur.Entsorgen Sie das überschüssige Paraformaldehyd und spülen Sie die Zellen mit einem Milliliter destilliertem Wasser ab. Dann fügen Sie einen Milliliter 70% Isopropanol hinzu und inkubieren Sie für fünf Minuten. Entsorgen Sie das überschüssige Isopropanol und fügen Sie einen Milliliter Oil-Red O-Lösung hinzu und inkubieren Sie es für 30 Minuten.Entsorgen Sie die überschüssige Oil-Red O-Lösung und spülen Sie sie dann mit einem Milliliter destilliertem Wasser ab. Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop bei einer Vergrößerung von 400x. Wählen Sie zufällig Fotos von 10 optischen Feldern aus dem gesamten Bereich des Brunnens aus und nehmen Sie sie auf.Wiederholen Sie die Bildgebung für jeden Brunnen. Um den Prozentsatz des rot gefärbten Bereichs zu beurteilen, öffnen Sie die ImageJ-Software und importieren Sie die erforderlichen Dateien, klicken Sie dann auf Anpassen und definieren Sie mit dem Werkzeug "Farbschwellenwert" den Farbtonparameter für die Rote-Farberkennung. Passen Sie dann die Sättigung und Helligkeit für das Bild an.Vergleichen Sie den gefärbten Bereich mit dem gesamten Bereich des optischen Feldes, indem Sie das Werkzeug "Partikel analysieren" verwenden und den durchschnittlichen Prozentsatz jeder Vertiefung berechnen. Der Sitz von 0,1 Millionen Hepatozyten pro Vertiefung in 24-Well-Platten sorgt für eine optimale Konfluenz. Die Lebensfähigkeit nahm mit zunehmender Zeit der Kultur allmählich ab und erreichte nach vier Tagen bei schwerer Steatose den niedrigsten Wert von 60%.Dementsprechend war die Sterblichkeitsrate in Hepatozyten, die unter den steatogenen Bedingungen kultiviert wurden, höher. Und es nahm mit der Zeit der Exposition gegenüber Lipiden allmählich zu. Die Zellzahlen nahmen infolge der Proliferation allmählich zu.Die Proliferationsrate war jedoch bei leichter Steatose nach drei und vier Tagen niedriger. Im Gegensatz dazu war eine schwere Steatose mit einer geringeren Proliferation um 24 Stunden verbunden. Die Färbung von Zellen mit Oil-Red O zeigte eine mindestens zweifache Zunahme von Lipidtröpfchen in Zellen, die unter steatogenen Bedingungen kultiviert wurden.Intrazelluläres Fett erhöhte sich entsprechend dem Zeitpunkt der Exposition der Kultur im steatogenen Medium. Bei leichter Steatose waren die Lipidgehalte ab dem zweiten Tag erhöht, während sie bei schwerer Steatose ab 24 Stunden signifikant hoch waren. Zellkultur erfordert Vorerfahrung.Die Kultivierung von Hep G2-Zellen in einem Standardzustand vor der Verwendung dieses Protokolls könnte hilfreich sein. Auch die Zubereitung des Fettsäurevorrats ist ein entscheidender Punkt. Palmitinsäure ist bei Raumtemperatur fest und muss vor ihrer Behandlung erwärmt werden.Diese Methode sollte die molekulare Analyse verschiedener Signalwege ermöglichen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Proliferation, Apoptose, Autophagie, oxidativen Stress und pharmakologische und toxikologische Analysen.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Forschung

Medizin

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Optimierte Analyse von<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; In Vitro</em&gt; Hepatosteatose

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The placenta is essential for the growth and development of mammalian embryos. For this reason, numerous genetic alterations and likely also environmental ...